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利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的方法.pdf

  • 上传人：狗**
  • 文档编号：5168530
  • 上传时间：2018-12-21
  • 格式：PDF
  • 页数：9
  • 大小：942.97KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201410218433.4

    		 申请日：

    2014.05.22
    公开号：

    CN104004803A

    		 公开日：

    2014.08.27
    当前法律状态：

    授权

    		 有效性：

    有权
    法律详情：

    授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12P 21/00申请日:20140522|||公开
    IPC分类号：

    C12P21/00; C12R1/01(2006.01)N

    		 主分类号：

    C12P21/00
    申请人：

    河北科技大学
    发明人：

    贾英民; 王志新; 李兴峰; 宁亚维; 杨瑾
    地址：

    050018 河北省石家庄市裕翔街26号
    优先权：

    专利代理机构：

    北京路浩知识产权代理有限公司 11002

    		 代理人：

    王文君
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    内容摘要

    本发明提供一种利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的方法，在侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)发酵过程中，待抗菌肽产量不再增加时，向发酵液中直接添加活性炭，通过活性炭对发酵产物的吸附，解除产物抑制作用，从而大幅提高菌体密度和抗菌肽产量。本发明所用的吸附分离耦合剂为活性炭，成本低廉，对环境友好，发酵过程中直接添加，无需进行活化预处理，发酵液无需调节pH值，即可实现抗菌肽的吸附。工艺简单，易于推广，发酵结束后可以通过解吸附处理再生活性炭，实现了活性炭的多次重复利用，降低了生产成本。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的方法，其特征在于，在侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)发酵过程中，待抗菌肽产量不再增加时，向发酵液中直接添加活性炭，通过活性炭对发酵产物的吸附，解除产物抑制作用，从而提高菌体密度和抗菌肽产量。

    2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述侧孢短芽孢杆菌包括但不限于B.laterosporu AS1.6343、B.laterosporu AS1.2827、B.laterosporu AS1.2739、B.laterosporu AS1.864、B.laterosporu ACCC06527、B.laterosporu ACCC05440、B.laterosporu ACCC10390。

    3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
    1)种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌的斜面或甘油管接入灭菌的营养肉汤培养基中，培养温度30-37℃，培养时间12-24h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3-5v/v％接种量接入营养肉汤培养基，30-37℃，培养6-18h，获得菌浓度为107-108cfu/mL的二级种子液；
    2)发酵培养：向发酵罐内装入发酵罐体积60-80％的发酵培养基，灭菌冷却后接入步骤1)制备的二级种子液，接种量3-5v/v％；发酵条件为：发酵温度30-34℃，转速200-400r/min，通气量1:0.1-1:0.5v/v/min，溶氧60-70％，培养时间12-24h；
    3)活性炭吸附：当发酵12-24h抗菌肽产量不再增加时，向发酵液中添加活性炭，同时补加发酵浓缩培养基，活性炭添加量1-4w/v％，发酵浓缩培养基补加量1-3v/v％，继续发酵12-24h；发酵条件同步骤2)；
    其中，步骤2)中所述发酵培养基的配方为：碳源0.5-3.0w/v％、氮源0.5-3.0w/v％、无机盐0.005-1.0w/v％、表面活性剂0.1-1.0w/v％，调pH7.0-7.4，以水配制；
    步骤3)中所述发酵浓缩培养基的配方为：碳源5.0-30.0w/v％、氮源5.0-30.0w/v％、无机盐0.05-10.0w/v％、表面活性剂1.0-10.0w/v％，调pH7.0-7.4，以水配制。

    4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵培养基和步骤3)中所述发酵浓缩培养基中使用的碳源选自葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜或甘油中的一种或多种。

    5.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵培养基和步骤3)中所述发酵浓缩培养基中使用的氮源选自玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或豆粕粉中的一种或多种。

    6.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵培养基和步骤3)中所述发酵浓缩培养基中使用的无机盐选自Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+或Cu2+盐中的一种或多种。

    7.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵培养基和步骤3)中所述发酵浓缩培养基中使用的表面活性剂选自Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Triton X-100、Triton X-114、Triton X-116、TX-4、TX-6、TX-7、TX-8、TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7或AEO-9中的一种或多种。

    8.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中使用的活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。

    9.  根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，活性炭吸附发酵产物后，通过解吸附手段再生，实现活性炭的循环利用。

    说明书

    说明书利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的方法
    技术领域
    本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的方法。
    背景技术
    随着人们生活水平的提高和对食品安全的日益重视，消费者要求降低化学防腐剂的使用和抗生素的残留，因此开发安全、高效的生物防腐剂成为食品工业的重要发展方向，其中抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)由于其化学本质为蛋白质，在人或动物体内无药物残留、无免疫原性、无毒性，在替代化学防腐剂和抗生素方面具有潜在的应用价值。
    抗菌肽是一种广泛存在于生物体内的小分子多肽，第一个分离获得的抗菌肽来自于天蚕的蚕蛹，迄今为止，在多种动物、植物和微生物中已发现了600多种内源性的抗菌肽，但动物源和植物源抗菌肽来源有限，难以实现规模化生产，而微生物源抗菌肽具有发酵周期短、成本低、易于培养、易于实现工业化生产等优点，已成为抗菌肽研究的重要方向。国内外关于微生物抗菌肽的研究已有50多年的历史，研究最多的是乳酸菌来源的细菌素——Nisin，其已被批准可用于食品工业，但乳酸菌来源的Nisin大多具有抗菌谱窄、稳定性差等问题，因此，进一步开发新型非乳酸菌抗菌肽成为一项迫切且长期的任务。
    芽孢杆菌属(Bacillus)由于其在食品工业中具有安全的应用历史，尤其是侧孢短芽孢杆菌，其产生的抗菌肽具有安全性高、抗菌谱广、稳定性好、无残留等优点，是非乳酸菌细菌素的一个重要来源，成为近年研究的热点，已被广泛应用于食品、饲料和作物病害防治领域。近年来对侧孢短芽孢杆菌抗菌肽的研究发现，在芽孢杆菌发酵产 抗菌肽的过程中，当抗菌肽达到一定产量后不再增加，表现出一种产物抑制现象，不仅影响了自身菌体的生长，同时还抑制了抗菌肽的进一步合成。基于此，要提高抗菌肽的产量，单纯通过补加培养基的连续发酵工艺达不到生产目的，而应该考虑如何解除抗菌肽的这种抑制作用，从而从根本上解决限制抗菌肽实现高产量的瓶颈问题。
    将微生物发酵与产物分离相耦合的技术在解决发酵过程中产物抑制方面效果显著，且操作方便，这种原位分离发酵技术可以选择性地从发酵液中连续地分离出对菌体有抑制性或不稳定的产物，既可以使发酵过程向产物合成的方向进行，还能降低产物在复杂环境下自然降解的作用。目前涉及的原位分离技术主要包括膜发酵法、电渗析法、溶剂萃取法以及吸附法。从工业化生产角度看，吸附法以其成本低、选择性高、交换容量大、操作简单、易于自动控制等优点，成为实现侧孢短芽孢杆菌抗菌肽高发酵产量的有效途径。
    近年来，国内外研究者开始探索利用发酵吸附分离耦合法提高小分子肽的产量。吴兆亮等[徐浩,吴兆亮,殷昊,阎瑾.发酵吸附分离耦合生产乳酸链球菌素工艺.高分子材料科学与工程,2010,26(10):155-158]报道，在Nisin的发酵生产中加入阳离子交换树脂D113作为吸附剂进行吸附耦合发酵，到达发酵终点时，Nisin的效价由原来3350IU/mL提高到5189IU/mL，提高了54.9％；然而树脂成本高，且投入发酵液前需要进行活化处理，操作复杂。Pongtharangku等[Pongtharangku T,Demirci A.Online recovery of nisin during fermentation and its effect on nisin production in biofilm reactor.Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(3):555-562]利用微生物发酵与膜分离和吸附分离耦合法生产Nisin，该方法使Nisin效价提高近了4倍，效果显著，但是该生产工艺复杂，成本较高，且发酵液pH值影响大，不适宜工业化生产。因此，寻找成本低廉、操作简单的发酵工艺成为亟待解决的问题。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种利用廉价吸附分离耦合剂解除抗菌肽发酵过程中的产物抑制进而提高菌体密度和抗菌肽产量的方法。
    为了实现本发明目的，本发明的一种利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的方法，在侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)发酵过程中，待抗菌肽产量不再增加时，向发酵液中直接添加活性炭，通过活性炭对发酵产物的吸附，解除产物抑制作用，从而提高菌体密度和抗菌肽产量。
    在发酵过程中直接添加一种吸附分离耦合剂——活性炭，活性炭无需前期活化处理，无需制备吸附柱，发酵液无需调节pH值，即可解除产物抑制作用，提高发酵菌体的密度和抗菌肽的产量。
    本发明中涉及的侧孢短芽孢杆菌包括但不限于B.laterosporu AS1.6343、B.laterosporu AS1.2827、B.laterosporu AS1.2739、B.laterosporu AS1.864、B.laterosporu ACCC06527、B.laterosporu ACCC05440、B.laterosporu ACCC10390等。
    利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的具体工艺如下：
    1)种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌的斜面或甘油管接入灭菌的营养肉汤培养基(NB培养基)中，培养温度30-37℃，培养时间12-24h，获得一级种子液；然后将一级种子液按3-5v/v％接种量接入营养肉汤培养基，30-37℃，培养6-18h，获得菌浓度为107-108cfu/mL的二级种子液；
    2)发酵培养：向发酵罐内装入发酵罐体积60-80％的发酵培养基，灭菌冷却后接入步骤1)制备的二级种子液，接种量3-5v/v％；发酵条件为：发酵温度30-34℃，转速200-400r/min，通气量1:0.1-1:0.5v/v/min，溶氧60-70％，培养时间12-24h；
    3)活性炭吸附：当发酵12-24h抗菌肽产量不再增加时，向发酵液中添加活性炭，同时补加发酵浓缩培养基，活性炭添加量1-4w/v％， 发酵浓缩培养基补加量1-3v/v％，继续发酵12-24h；发酵条件同步骤2)。
    其中，步骤2)中所述发酵培养基的配方为：碳源0.5-3.0w/v％、氮源0.5-3.0w/v％、无机盐0.005-1.0w/v％、表面活性剂0.1-1.0w/v％，调pH7.0-7.4，以水配制。
    步骤3)中所述发酵浓缩培养基的配方为：碳源5.0-30.0w/v％、氮源5.0-30.0w/v％、无机盐0.05-10.0w/v％、表面活性剂1.0-10.0w/v％，调pH7.0-7.4，以水配制。
    上述抗菌肽发酵工艺中，可利用的碳源选自葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜或甘油等中的一种或多种。
    上述抗菌肽发酵工艺中，可利用的氮源选自玉米浆、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉或豆粕粉等中的一种或多种。
    上述抗菌肽发酵工艺中，可利用的无机盐选自Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+或Cu2+盐等中的一种或多种。
    上述抗菌肽发酵工艺中，可利用的表面活性剂选自Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Triton X-100、Triton X-114、Triton X-116、TX-4、TX-6、TX-7、TX-8、TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7或AEO-9等中的一种或多种。
    上述抗菌肽发酵工艺中添加的活性炭为粉末状或颗粒状的竹炭、木炭、果壳炭或椰壳炭。活性炭吸附发酵产物后，可以通过解吸附等手段再生，实现活性炭的循环利用。
    采用上述抗菌肽发酵工艺，在发酵罐中进行发酵生产，与未添加活性炭相比，活菌数提高2-4个数量级，达到1010-1012cfu/mL，抗菌肽产量提高50-130％，效价为2200-3500AU/mL。
    本发明所用的发酵菌株为侧孢短芽孢杆菌，又称为侧孢芽孢杆菌，其代谢产物具有抑制多种细菌、真菌的功能。在食品工业中，已经被应用于生产功能性食品和食品防腐保鲜。在饲料工业中，已经被农业部批准可用于饲用微生态制剂，应用于肉鸡、肉鸭、猪和虾的养 殖，具有极高的安全性，是一种潜在的益生菌。
    本发明所用的吸附分离耦合剂为活性炭，成本低廉，对环境友好，发酵过程中直接添加，无需进行活化预处理，且发酵液无需调节pH值，即可实现抗菌肽的吸附。工艺简单，易于推广，发酵结束后可以通过解吸附处理再生活性炭，实现了活性炭的多次重复利用，降低了生产成本。
    本发明提供的抗菌肽发酵工艺解除了发酵过程中产物的抑制作用，使发酵菌体和抗菌肽产量大幅提高。
    利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产的抗菌肽，其化学本质是蛋白质，无残留，安全性好，稳定性高，抗菌谱广，能够抑制多种细菌和真菌，可广泛应用于食品、医药、畜禽养殖、生物农业等行业。
    具体实施方式
    以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
    本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
    实施例1利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的工艺
    具体工艺如下：
    1、种子培养
    将保存B.laterosporu AS1.2827的甘油管接入灭菌的NB培养基中，32℃，培养时间24h；再按5v/v％接种量接入NB培养基，32℃培养8h，获得菌浓度为107cfu/mL的二级种子液。
    2、5L发酵罐培养
    将步骤1中获得的二级种子液按5v/v％接种量接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，32℃，300r/min，通气量1:0.5v/v/min条件下培养15h。
    其中，发酵培养基(w/v)：甘油2.0％、豆粕粉2.0％、CaCl20.005％、Tween-200.5％，调pH7.2，以水配制。
    3、添加活性炭吸附分离耦合剂
    步骤2中，当培养15h后发酵液抗菌肽含量不再增加时，向发酵液中添加3％活性炭，同时补加3v/v％发酵浓缩培养基，按步骤2中发酵条件继续发酵培养20h。
    其中，发酵浓缩培养基为步骤2中发酵培养基的10倍浓缩液。
    发酵结束后测定活菌数与抗菌肽效价，与未添加活性炭的对照组相比，活菌数提高了2个数量级，抗菌肽产量提高了80％。
    实施例2利用侧孢短芽孢杆菌发酵生产抗菌肽的工艺
    具体工艺如下：
    1、种子培养
    将保存B.Laterosporu AS1.2738的斜面接入灭菌的NB培养基中，34℃，培养时间24h，再按3v/v％接种量接入NB种子培养基，34℃培养12h，获得菌浓度为108cfu/mL的二级种子液。
    2、发酵罐培养
    将步骤1中获得的二级种子液按8v/v％接种量接入装有4L发酵培养基的5L发酵罐中，进行发酵培养。
    发酵培养基(w/v)：可溶性淀粉1.5％、酵母粉1.5％、CaCl20.15％、ZnCl20.008％、MnCl20.05％，Tween-202.0％，pH7.0，以水配制。
    发酵条件：温度34℃，通气量1:0.5v/v/min，溶氧60％，溶氧与转速相关联，转速200-400r/min，培养16h。
    3、添加活性炭吸附分离耦合剂
    步骤2中，当培养16h后向发酵液中添加1.5％活性炭，同时补加2v/v％发酵浓缩培养基，按步骤2中发酵条件继续发酵培养24h。发酵浓缩培养基为步骤2中发酵培养基的10倍浓缩液。
    发酵结束后测定活菌数与抗菌肽效价，与未添加活性炭的对照组 相比，活菌数提高了3个数量级，抗菌肽产量提高了近一倍。
    实施例3活性炭添加时间对活菌数和抗菌肽产量的影响
    以侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporu)AS1.864为发酵菌株，首先将保存菌株的甘油管接入灭菌的NB培养基，32℃，培养24h，按3v/v％接种量接入NB培养基，32℃培养12h，获得菌浓度为108cfu/mL的二级种子液。
    采用5L发酵罐，按5v/v％接种量接入装有3L发酵培养基的体系中，在32℃，通气量1:0.5v/v/min，转速300r/min条件下进行发酵培养，分别于发酵的第12、16、20、24h，添加2％粉末状活性炭及2v/v％浓缩料培养基，再继续发酵24h；以未添加活性炭的作为对照，活菌数及抗菌肽产量见表1。发酵16h后添加活性炭效果最明显，活菌数与对照组相比提高将近3个数量级，抗菌肽效价提高80％。
    NB种子培养基(w/v)：蛋白胨1.0％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％，调pH7.2，以水配制。于121℃，高压蒸汽灭菌20min。
    发酵培养基(w/v)：葡萄糖1.5％、玉米浆1.8％、CaCl20.15％、ZnCl20.008％、Tween-800.1％，调pH7.0，以水配制。
    发酵浓缩培养基：发酵培养基的10倍浓缩液。
    表1活性炭添加时间对活菌数和抗菌肽效价的影响

    实施例4活性炭添加量对活菌数和抗菌肽产量的影响
    以侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporu)AS1.864为发酵菌株，首先进行二级种子液制备，种子培养基为NB培养基，培养温度32℃，获得菌浓度为108cfu/mL的二级种子液。
    采用5L发酵罐，按5v/v％的接种量接入3L发酵培养基，在32℃，通气量1:0.5v/v/min，转速300r/min，发酵16h后，分别补加1％、2％、 3％及4％的粉末状活性炭，同时均补加2v/v％发酵浓缩培养基，继续发酵24h；以未添加活性炭的作为对照，活菌数及抗菌肽产量见表2。添加2.0％粉末状活性炭时菌体密度和抗菌肽产量的提高效果最明显，活菌数与对照相比提高3个数量级，达到1011cfu/mL，抗菌肽效价提高了一倍。
    发酵培养基(w/v)：葡萄糖1.5％、玉米浆1.8％、CaCl20.15％、ZnCl20.008％、Tween-800.1％，调pH7.0，以水配制。
    发酵浓缩培养基：发酵培养基的10倍浓缩液。
    表2活性炭添加量对活菌数和抗菌肽效价的影响

    实施例5发酵浓缩料培养基补加量对活菌数和抗菌肽产量的影响
    以侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporu)AS1.864为发酵菌株，首先进行二级种子液制备，获得菌浓度为108cfu/mL的二级种子液；采用5L发酵罐，按5v/v％接种量接入3L发酵培养基，在32℃，通气量1:0.5v/v/min，转速300r/min条件下，发酵16h后，添加2％的粉末状活性炭，同时分别补加1v/v％、2v/v％及3v/v％的发酵浓缩培养基，继续发酵24h，以未添加活性炭的作为对照，活菌数及抗菌肽产量见表3。添加2v/v％的发酵浓缩培养基对效价提高效果最为显著，约提高90％。
    发酵培养基(w/v)：葡萄糖1.5％、玉米浆1.8％、CaCl20.15％、ZnCl20.008％、Tween-200.1％，调pH7.0，以水配制。
    发酵浓缩料培养基：发酵培养基的10倍浓缩液。
    表3发酵浓缩料培养基添加量对活菌数和抗菌肽效价的影响

    实施例630L发酵罐放大规模发酵试验
    以侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporu)AS1.864为发酵菌株，于32℃，NB培养基进行二级种子液制备，获得菌浓度为108cfu/mL的二级种子液。
    采用30L发酵罐，按5v/v％接种量接入20L发酵培养基，在32℃，通气量1:0.5v/v/min，转速300r/min，发酵15h后添加2％粉末状活性炭及2v/v％发酵浓缩培养基，再继续发酵20h。
    发酵培养基(w/v)：葡萄糖1.5％、玉米浆1.8％、MnCl20.05％、ZnCl20.005％、CaCl20.15％，调pH7.0，以水配制。
    发酵浓缩培养基：发酵培养基的10倍浓缩液。
    发酵结束后，活菌数达到5.0×1011cfu/mL，抗菌肽效价2916AU/mL。与未添加活性炭的相比，活菌数增加3个数量级，抗菌肽产量提高了近一倍。
    实施例7侧孢短芽孢杆菌抗菌肽抑菌谱试验
    利用活性炭发酵吸附分离偶联法获得侧孢短芽孢杆菌抗菌肽，采用牛津杯抑菌圈法研究抗菌肽的抗菌谱。
    表4结果表明，该抗菌肽对多种食源性和禽源性致病菌有一定的抑制作用，包括革兰氏阳性菌：单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。革兰氏阴性菌：大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、小肠结肠炎耶氏菌、阪崎肠杆菌等。可见，由侧孢短芽孢杆菌产生的抗菌肽在食品生物防腐和畜禽无抗养殖领域具有广阔的应用前景。
    表4抗菌肽的抑菌谱


    虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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