《同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重PCR引物及其扩增方法和用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重PCR引物及其扩增方法和用途.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104195259 A (43)申请公布日 2014.12.10 CN 104195259 A (21)申请号 201410472466.1 (22)申请日 2014.09.17 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 天津出入境检验检疫局动植物与食 品检测中心 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区第二大街 51 号 (72)发明人 崔铁军 郭京泽 刘跃庭 罗加凤 朱林慧 李关荣 廖芳 (54) 发明名称 同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引 物及其扩增方。
2、法和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种同步检测莓类植物上两种 检疫性疫霉的三重 PCR 引物及其扩增方法与用 途， 涉及 3 套引物， 即疫霉属通用引物、 草莓疫霉 特异引物和树莓疫霉特异引物， 其中通用引物用 于菌丝基因组DNA的质量控制， 建立三重PCR分子 检测， 经琼脂糖凝胶电泳观察， 疫霉属菌株均应出 现884bp的扩增片段， 草莓疫霉还应出现615bp特 异片段， 树莓疫霉还应出现 559bp 特异片段， 三套 引物可有效用于两种疫霉的菌丝基因组 DNA 三重 PCR 特异扩增。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)。
3、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104195259 A CN 104195259 A 1/1 页 2 1. 一种同步检测检疫性真菌病害草莓疫霉P. fragariae和树莓疫霉P. fragariae. rubi的三重 PCR 引物， 实现了同时检测P. fragariae和P. rubi， 引物序列如下 ： 通用引物 ： 18SUF ： CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ： AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 草莓疫霉特异引物 。
4、： PFSF ： TGT ATA TTT AAT ACG TAA TTA GCT C PFSR ： AAT CTA TAT TGT TGT GAT AAA TG 树莓疫霉特异引物 ： PRSF ： ACT CCA TAA TAG ATA TAT ACG TG PRSR ： AAC CAC TTA ATG GAA AG 所述通用引物 18SUF/18SUR 扩增片段为 884bp， 作为 DNA 提取和扩增过程的质量控制 ； 特异引物 PFSF/PFSR 扩增片段为 615bp， PRSF/PRSR 扩增片段为 559bp， 这三套特异引物用 于草莓疫霉和树莓疫霉的菌丝基因组 DNA 特异三重 。
5、PCR 扩增。 2. 一种权利要求 1 所述的同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物及其扩增方 法， 其特征在于， 包括下述的扩增体系和扩增程序 ： （1） 扩增体系 建立 30L 的扩增体系为， 包括 10Buffer3.0L（其中含终浓度为 1.5mmol/L 的 MgCl2) ； 2.5mmol/L dNTPs 为 2.0L ； 0.4L Taq DNA 聚合酶 (5U/L) ； 浓度为 10mol/ L 的引物 18SUF/18SUR、 PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次为 0.1L/0.1L、 0.8L/0.8L、 1.5L/1.5L ； DNA 模板 1L（约。
6、为 20ng)， 余量为双蒸水 ； （2） 反应程序 设立反应程序 ： 94预变性 4min ； 94变性 30s， 54复性 40s， 72延伸 45s， 35 个循 环 ； 72延伸 7min。 3.如权利要求1所述同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重PCR引物及在检测冬草莓疫 霉和树莓疫霉方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 104195259 A 2 1/5 页 3 同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物及其扩增方 法和用途 0001 技术领域 本发明设计PCR技术检测寄生于莓类水果上草莓疫霉和树莓疫霉的三重PCR引物及其 扩增方法和用途， 属于莓类水果上草莓疫霉和树莓疫霉检测领。
7、域。 背景技术 0002 草莓 ( Fragaria ananassa Duch) 属蔷薇科草莓属多年生缩根浆果类水果， 果实 柔软多汁， 色泽艳丽， 酸甜适口， 营养丰富， 富含多酚 黄酮类等抗氧化物质， 能预防或减少 心血管 肿瘤和贫血等疾病的发生， 备受消费者青睐， 被誉为水果皇后 （陈卫平 不同草莓 品种果实品质的比较研究 江西农业学报， 2010， 22 ( 9) : 4648） 。 目前世界上大多数 国家都有草莓栽培， 世界各大洲中， 亚洲草莓产量最多， 主要分布在中国、 土耳其、 日本、 韩 国、 伊朗、 以色列等， 并高度集中在中国。 早在2003年我国草莓年生产量已达134万。
8、t， 栽培 面积 7.6 万 hm2， 分别占世界产量和面积的 1/3 和 1/4， 产量和面积均居世界第一位。草莓 年生产量由多至少的国家依次是 : 中国、 美国、 西班牙、 波兰、 日本、 意大利、 韩国、 墨西哥、 俄罗斯、 土耳其、 德国等 （王忠和 . 草莓市场分析及其对策 . 北方园艺 , 北方园艺， 2007， (7):110111） 。 0003 草莓疫霉 （P. fragariae） 和树莓疫霉 （P.rubi） 是寄生于草莓的两种重要检疫性 真菌。P. fragariae和P.rubi是草莓疫霉的两个变种，P. fragariae主要寄主为草莓， P.rubi主要寄主为树莓。
9、。P. fragariae和P. rubi均可侵染草莓， 引起草莓红心病， 使草 莓植株枯萎和根部腐烂。1920 在苏格兰的拉纳克郡地区首先发现并研究P. fragariae， 随后在美国、 澳大利亚、 奥地利等报导， 几乎遍布主要栽培草莓的地区。1937 年首次在患有 根腐病的树莓植株上分离得到P.rubi， 随后在美国， 英国、 澳大利亚等地报道。草莓植株发 生被侵染后幼根根尖开始腐烂， 根上有长裂口时， 中柱上面出现红色腐烂， 由于腐烂发展， 侧根很快地被破坏， 引起主根呈现鼠尾状， 中柱红色常常扩展到根颈。 地上部症状取决于根 部腐烂的严重程度， 当条件有利于植物快速生长时， 重病植株。
10、矮化， 并在某些环境里， 幼叶 呈浅兰绿色、 老叶是红色、 橙色或黄色。少数严重感病植株生长比健株差， 但叶子颜色没有 变化， 轻度感病植株的地上部分不易发现 (Maas JL ,et al. Compendium of strawberry diseases.1998)。1971 年加拿大新斯科舍生发生此病害， 损失达当季栽培草莓总量的 78%， 每公顷经济损失达1500加币 （Gourley et al. Economic loss from strawberryred stele disease in Nova Scotia. Report, Research Station Kentv。
11、ille, Nova Scotia, Canada for 1971, 1972: 63-64） 。 0004 随着经济全球化进程的加快和我国对外开放的深入发展， 农产品进出口数量日益 增大， 检疫性有害生物传入我国的风险也逐年增加。 因此， 急需加强进境草莓及其种子上携 带有害生物快速、 准确的检测鉴定， 有效保护和促进我国草莓产业健康发展。草莓作为一 种重要的水果， 可传带多种有害生物， 疫霉菌常规生物学检测方法是水果带菌检测， 经过分 离培养可通过肉眼直接观察菌落、 孢子囊、 卵孢子等形态特征来鉴定真菌病害。病原菌菌 说 明 书 CN 104195259 A 3 2/5 页 4 株培养时。
12、间需达 20 天左右才能诱激产生孢子囊， 此种情况不仅耗时费力， 且 P. fragariae 和 P.rubi 均是草莓疫霉的变种， 二者形态特征、 培养性状及生理特性等极为相似， 很难根 据菌落形态、 孢子囊的形态和脱落性、 有性器官的产生和形态、 厚垣孢子的有无、 菌丝的生 长温度等特性准确、 快速有效地鉴定出两种病原菌 (Brunner-Keinath, et al. On the diagnosis of phytophthora root rot of raspberry. Nachrichtenblatt des Deutschen Pflanzenschutzdienstes.。
13、1992, 44:179-182)，分 子 生 物 学 方 法 如 ELISA（Mohan. Evaluation of antisera raised against Phytophthora fragariae for detecting the red core disease of strawberries by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Plant Pathology1988, 37:206-216)、 单克隆抗体(Burns et al. The use of monoclonal antibodies for the d。
14、etection of fungi. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1995, 25:31-38) 等已被应用于草莓疫霉的检测， 但是只能检测到疫霉属的水平， 不能准确诊断出 P. fragariae 和 P.rubi。目前的检测方法不能满足口岸检测 “快验快放” 的要求， 导致错 过最佳防治时间， 使病害在我国传播。 因此， 加强对口岸进境草莓及其种子携带有害生物快 速、 准确的检测显得极为重要， 对保护和促进我国草莓产业健康发展具有十分重要的意义。 发明内容 0005 本发明索要解决的技术问题是 ： 设计同步检测莓类水果上草莓疫霉和树莓疫霉的 三重 PCR 引物。
15、， 包括草莓疫霉特异引物和树莓疫霉特异引物， 与自行设计的疫霉属通用引 物 18SUF/18SUR， 建立同步检测柑橘属上莓类水果上草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物 及其扩增方法和用途。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 一种同步检测草莓疫霉和树 莓疫霉的三重 PCR 引物， 实现两种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物， 序列如下 ： 草莓疫霉特异引物 ： PFSF ： TGT ATA TTT AAT ACG TAA TTA GCT C PFSR ： AAT CTA TAT TGT TGT GAT AAA TG 树莓疫霉特异引物 ： PRSF ： ACT C。
16、CA TAA TAG ATA TAT ACG TG PRSR ： AAC CAC TTA ATG GAA AG 所述 PFSF/PFSR 扩增片段为 615bp， PRSF/PRSR 扩增片段为 559bp， 特异引物用于草莓 疫霉和树莓疫霉的菌丝基因组 DNA 特异三重 PCR 扩增。还包括检测草莓疫霉和树莓疫霉的 通用引物， 序列如下 ： 18SUF ： CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ： AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 所述引物用于草莓疫霉和树莓疫霉菌丝基因组 DNA 扩增， 扩增片段为 884bp， 作为提取 。
17、和扩增过程的质量检测。 0007 一种同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物的扩增方法， 包括下述的扩增 体系和扩增程序 ： （1） 扩增体系 建立 30L 的扩增体系为， 包括 10Buffer3.0L（其中含终浓度为 1.5mmol/L 的 说 明 书 CN 104195259 A 4 3/5 页 5 MgCl2) ； 2.5mmol/L dNTPs 为 2.0L ； 0.4L Taq DNA 聚合酶 (5U/L) ； 浓度为 10mol/ L 的引物 18SUF/18SUR、 PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次为 0.1L/0.1L、 0.8L/0.8L、 1.5L。
18、/1.5L ； DNA 模板 1L（约为 20ng)， 余量为双蒸水 ； （2） 反应程序 设立反应程序 ： 94预变性 4min ； 94变性 30s， 54复性 40s， 72延伸 45s， 35 个循 环 ； 72延伸 7min。 0008 上述同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物在检测冬草莓疫霉和树莓疫 霉方面的应用。 0009 本发明的有益效果是 ： 建立了方法简便、 重现性好的P. fragariae和P. rubi的 三重 PCR 引物， 能将P. fragariae和P. rubi区别开来。采用引物检测试验过程， 避免假 阴性。实现了在同一 PCR 管中 3 组引物检。
19、测P. fragariae和P. rubi， 该三重 PCR 检测体 系的建立简化和方便了对P. fragariae和P. rubi的检测， 节约了试剂盒时间， 检测快速、 可靠， 可有效在口岸检测中推广应用。 附图说明 0010 图 1 是本发明菌丝基因组 DNA 三重 PCR 扩增。 具体实施方式 0011 本发明的同步检测检疫性真菌草莓疫霉P. fragariae和树莓疫霉P. rubi的四 重 PCR 引物， 实现了同时检测P. fragariae和P. rubi。 0012 （1） 设计草莓疫霉和树莓疫霉的各自的特异性引物， 引物序列如下 ： 草莓疫霉特异引物 ： PFSF ： TG。
20、T ATA TTT AAT ACG TAA TTA GCT C PFSR ： AAT CTA TAT TGT TGT GAT AAA TG 树莓疫霉特异引物 ： PRSF ： ACT CCA TAA TAG ATA TAT ACG TG PRSR ： AAC CAC TTA ATG GAA AG PFSF/PFSR扩增片段为615bp， PRSF/PRSR扩增片段为559bp， 这两套特异引物用于草莓 疫霉和树莓疫霉的菌丝基因组 DNA 特异三重 PCR 扩增。 0013 （2） 自行设计的草莓疫霉和树莓疫霉的通用引物， 序列如下 ： 18SUF ： CGC GGT AAT TCC AGC T。
21、CC AAT A 18SUR ： AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 上述引物用于草莓疫霉和树莓疫霉菌丝基因组 DNA 扩增， 扩增片段为 884bp， 作为提取 和扩增过程的质量检测。 0014 本发明建立检测草莓疫霉和树莓疫霉的是重 PCR 引物及其扩增方法， 包括扩增体 系的建立及反应程序的设立。 0015 （1） 扩增体系 建立 30L 的扩增体系为， 包括 10Buffer3.0L（其中含终浓度为 1.5mmol/L 的 MgCl2) ； 2.5mmol/L dNTPs 为 2.0L ； 0.4L Taq DNA 聚合酶 (5U/L) ； 浓度为 10。
22、mol/ 说 明 书 CN 104195259 A 5 4/5 页 6 L 的引物 18SUF/18SUR、 PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次为 0.1L/0.1L、 0.8L/0.8L、 1.5L/1.5L ； DNA 模板 1L（约为 20ng)， 余量为双蒸水 ； （2） 反应程序 设立反应程序 ： 94预变性 4min ； 94变性 30s， 54复性 40s， 72延伸 45s， 35 个循 环 ； 72延伸 7min。 0016 本发明设计合成了三套引物， 包括P. fragariae和P. rubi的特异引物 PFSF/ PFSR 和 PRSF/PRSR 以及通用。
23、引物 18SUF/18SUR， 对所有实验材料菌丝 DNA 进行质量检测， 避 免假阴性， 三套引物对P. fragariae和P. rubi进行三重 PCR 扩增。 0017 所述同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物在检测草莓疫霉和树莓疫霉 方面的应用。 0018 本发明建立了简便快速、 特异性强、 灵敏度高、 准确可靠的P. fragariae和P. rubi的三重 PCR 分子检测方法， 能将P. fragariae和P. rubi区别开来。该方法的建立为 两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异可行的方法， 节约了世界和时间， 检测快 速、 可靠， 整个过程在一个工作日内完。
24、成， 可有效在口岸检测中推广应用。 0019 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细说明 ： 实施例 1 ： 实验材料菌丝的培养 本实验供试菌株为P. fragariae和P. rubi同属菌株， 共计 17 个菌株 （见表 1） 。实验 设计的材料包括 5 株 ATCC 菌株购买于美国菌种保藏中心， 7 株 CBS 菌株购买于荷兰菌种保 藏中心， 3 株 ACCC 菌株购买于中国微生物菌种保藏中心， Ljf2012-4 和 Ljf2011-9 为天津出 入境检验检疫局动植物与食品检测中心从美国脐橙和澳大利亚柑橘上截获， 供试材料的相 关信息见表 1. 表 1 供试材料 挑取P. fr。
25、agariae和P. rubi菌丝置于V8培养基， 12h光照黑暗交替， 25恒温保湿 培养 7d。培养 7d 后手机大量菌丝供 DNA 提取。 0020 实施例 2 ： 菌丝基因组 DNA 的提取 采用美国 QIAGEN 公司的 DNeasy Plant Mini Kit 提取菌丝 DNA， 提取的菌丝 DNA 溶于 100L 1TE 缓冲液中， 其余菌丝 DNA 置于 -70保存。 0021 PCR 扩增相关试剂为大连宝生物 （TaKaRa） 工程公司产品。 0022 3.1 反应混合液的配置 建立 30L 的扩增体系为， 包括 10Buffer3.0L（其中含终浓度为 1.5mmol/L。
26、 的 说 明 书 CN 104195259 A 6 5/5 页 7 MgCl2) ； 2.5mmol/L dNTPs 为 2.0L ； 0.4L Taq DNA 聚合酶 (5U/L) ； 浓度为 10mol/ L 的引物 18SUF/18SUR、 PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 依次为 0.1L/0.1L、 0.8L/0.8L、 1.5L/1.5L ； DNA 模板 1L（约为 40ng)， 余量为双蒸水。以草莓疫霉的菌丝为阳性对 照， 无菌水为阴性对照 ； 3.2 PCR 反应程序 94预变性 4min ； 94变性 30s， 54复性 40s， 72延伸 45s， 35 个循环。
27、 ； 72延伸 7min。2% 琼脂糖凝胶电泳， EB 染色及成像观察目的条带。 0023 3.3 结果分析 同一 PCR 管中 3 组引物 18SUF/18SUR、 PRSF/PRSR 和 PFSF/PFSR 对 17 个菌株的菌丝 DNA 进行扩增， 通过2%琼脂糖凝胶电泳能够明确的区分P. fragariae和P. rubi这两种寄生于 莓类水果上的检疫性真菌病害。泳道 P 为P. fragariae的引物 18SF/18SR 的 884bp 扩增 片段作为质量监控 ； 泳道 1 和 2 分别为P. rubi（ATCC64968 和 CBS967.95） 18S rDNA 区域 884b。
28、p 扩增片段和 nad9 基因区域 559bp 的特异片段 ； 泳道 3 为P. fragariae（CBS209.46） 18S rDNA 区域 884bp 扩增片段和 nad9 基因区域 615bp 特异片段 ； 泳道 4-17 为 2 种疫霉同 属菌株 ； 泳道 N 为阴性对照 ； 泳道 M 为 DL100bp marker。 0024 以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点， 其目的在于使本领域内 的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施， 不能仅以本实施例来限定本发明的专利范 围， 即凡本发明所揭示的精神所做的同等变化和修饰， 仍落在本发明的专利范围内。 说 明 书 CN 。
29、104195259 A 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 同步检测草莓疫霉和树莓疫霉的三重 PCR 引物及其扩增方法和用途 6 PatentIn version 3.3 1 22 DNA 人工合成 1 cgcggtaatt ccagctccaa ta 22 2 25 DNA 人工合成 2 agaacatcta agggcatcac agacc 25 3 25 DNA 人工合成 3 tgtatattta atacgtaatt agctc 25 4 23 DNA 人工合成 4 aatctatatt gttgtgataa atg 23 5 23 DNA 人工合成 5 序 列 表 CN 104195259 A 8 2/2 页 9 actccataat agatatatac gtg 23 6 17 DNA 人工合成 6 aaccacttaa tggaaag 17 序 列 表 CN 104195259 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 104195259 A 10 。