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1、(10)申请公布号 CN 104177492 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104177492 A (21)申请号 201410347938.0 (22)申请日 2014.07.21 C07K 14/71(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/866(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C07K 19/00(2006.01)。
2、 A61K 38/17(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市黄埔大道西 601 号 (72)发明人 汪炬 陈安安 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 苏运贞 陈燕娴 (54) 发明名称 FGFR2c 胞外段类似物及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开一种 FGFR2c 胞外段类似物及其 编码基因与应用。 该类似物选自氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的野生型 wsFGFR2c ； 或。
3、是与野生型 wsFGFR2c 的氨基酸序列至少有 80同源性的序 列 ； 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示S252W突变型 msFGFR2c ； 或是与 S252W 突变型 msFGFR2c 的氨基 酸序列至少有 80同源性的序列。将编码类似物 的基因和表达载体重组， 得到表达重组载体 ； 将 重组载体导入宿主细胞中， 得到转基因细胞株。 发 酵该转基因细胞株， 得到 FGFR2c 胞外段类似物。 该 FGFR2c 胞外段类似物、 编码基因、 重组载体和 转基因细胞株均可用于制备用于抑制 EGF 信号通 路的药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 14 页 序列表 9。
4、 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书14页 序列表9页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104177492 A CN 104177492 A 1/1 页 2 1. 一种 FGFR2c 胞外段类似物， 其特征在于选自如下多肽 ： (1) 野生型 wsFGFR2c ： 氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； 或是与野生型 wsFGFR2c 的氨 基酸序列至少有 80同源性的序列 ； (2)S252W 突变型 msFGFR2c ： 氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所示 ； 或是与 S252W 突变型 msFGFR2c。
5、 的氨基酸序列至少有 80同源性的序列。 2.权利要求1所述的FGFR2c胞外段类似物的编码基因， 其特征在于选自如下核苷酸序 列 ： (1) 编码野生型 wsFGFR2c 的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.3 所示 ； 或 因遗传密码的简并性而与 (1) 的核苷酸序列不同的序列 ； 或 与 (1) 或 (1) 的核苷酸序列至少有 80同源性的序列 ； (2) 编码 S252W 突变型 msFGFR2c 的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.4 所示 ； 或 因遗传密码的简并性而与 (2) 的核苷酸序列不同的序列 ； 或 与 (2) 或 (2) 的核苷酸序列至少有 80同源性的序列。 。
6、3. 一种表达重组载体， 其特征在于 ： 含有权利要求 2 所述的 FGFR2c 胞外段类似物的编 码基因。 4. 一种转基因细胞株， 其特征在于 ： 是将权利要求 3 所述的表达重组载体转染到宿主 细胞中得到。 5. 根据权利要求 4 所述的转基因细胞株， 其特征在于 ： 所述的宿主细胞为 CHO 细胞、 大 肠杆菌、 昆虫细胞和酵母细胞中的一种。 6. 一种融合蛋白， 其特征在于 ： 含有权利要求 1 所述的 FGFR2c 胞外段类似物的氨基酸 序列。 7. 根据权利要求 6 所述的融合蛋白， 其特征在于 ： 所述的融合蛋白为免疫球蛋白表位 标记序列或 Fc 区与权利要求 1 所述的 FG。
7、FR2c 胞外段类似物连接得到。 8. 权利要求 1 所述的 FGFR2c 胞外段类似物的应用， 其特征在于 ： 将其用于抑制 EGF 信 号通路。 9. 权利要求 2 所述的 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因的应用， 其特征在于 ： 将其用于 抑制 EGF 信号通路。 10. 一种用于抑制 EGF 信号通路和抗肿瘤的药物， 其特征在于 ： 其活性成分包括权利要 求 1 所述的 FGFR2c 胞外段类似物、 权利要求 2 所述的 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因、 权 利要求 3 所述的表达重组载体、 权利要求 4 或 5 所述的转基因细胞株和权利要求 6 或 7 所 述的融合蛋白。 。
8、权 利 要 求 书 CN 104177492 A 2 1/14 页 3 FGFR2c 胞外段类似物及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 特别涉及一种 FGFR2c 胞外段类似物及其编码基因与 应用。 背景技术 0002 FGF信号具有促进细胞增殖， 诱导新生血管形成等重要生理作用。 肿瘤的发生与发 展过程与 FGF 信号通路也有十分密切的关系。典型的 FGF 受体由细胞外区、 跨膜区和细胞 内区组成， 它们都为单链的糖蛋白分子。细胞外区为 3 个免疫球蛋白样结构域 ( )， 分别命名为 D1， D2 和 D3， 在 D1 和 D2 之间有一个由 4 8 个酸性氨基酸。
9、组成的酸盒 ； 跨膜 区是一个穿膜螺旋 ； 细胞内区是酪氨酸激酶区 (PTK)。FGF 受体胞外段 ( 如 D1-D3 区 ) 可 用于抑制 FGF 信号， 并用于治疗肿瘤、 皮肤炎症等。文献报道的 FGFR2c 亚型胞外段其序列 有采用自第 147 至第 366 个氨基酸 (Ju Wang,Xue-ting Liu,Hui Huang,et al.Antitumor Activity of a Recombinant Soluble Ectodomain of Mutant Human Fibroblast Growth Fac tor Receptor-2IIIc.Mol Cancer T。
10、her2011 ； 10:1656-1666.)， 也有采用自第151至第 377 个氨基酸 ( 何颖， 汪炬等 .FGFR2IIIc 胞外段的原核表达及其对前列腺癌细胞增殖的抑 制作用.中国生物工程杂志.2009,29(7):711.文中指出是150366aa， 实际上通过引 物扩增出来的是 151 377aa) 具有抑制肿瘤细胞增殖作用， 但存在着溶解性不太好、 较不 稳定等问题。 0003 EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物， 是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。 该家族包括 HER1(erbB1， EGFR)、 HER2(erbB2， NEU)、 HER3(erbB3) 。
11、及 HER4(erbB4)。HER 家 族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR 信号通路对细胞的生长、 增殖和分化等生 理过程发挥重要的作用。 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的 活性或细胞定位异常， 均会引起肿瘤、 糖尿病、 免疫缺陷及心血管疾病的发生。也是肿瘤治 疗中重要的分子靶点。对 EGF 信号的抑制往往导致其他酪氨酸激酶信号的激活， 如 FGF 信 号， 并产生耐药。因此， 有必要寻找能够同时抑制 EGF 以及 FGF 信号的分子， 对肿瘤的治疗 效果更好。 发明内容 0004 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种 FGFR2c 。
12、胞外段类 似物， 使其蛋白稳定性更好。 0005 本发明的另一目的在于提供所述的 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因。 0006 本发明的再一目的在于提供所述的 FGFR2c 胞外段类似物及其编码基因的应用。 0007 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 一种 FGFR2c 胞外段类似物 (sFGFR2c)， 选 自如下多肽 ： 0008 (1) 野生型 wsFGFR2c ： 氨基酸序列如下所示 ； 或是与野生型 wsFGFR2c 的氨基酸序 列至少有 80同源性的序列 ； 说 明 书 CN 104177492 A 3 2/14 页 4 0009 所述的野生型 wsFGFR2c 的氨基酸序。
13、列 ： 0010 NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIM ESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVE KNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL ； 0011 (2)S252W突变型msFGFR2c ： 氨基酸序列如下所示 ； 或是与S252W突变型msFGFR2c 的氨基酸序列至少有 80同源性的。
14、序列 ； 0012 所述的 S252W 突变型 msFGFR2c 的氨基酸序列为 ： 0013 NKRAPYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIM ESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERWPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVYSDAQPHIQWIKHVE KNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVL ； 0014 所述 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因， 选自如下核苷酸序。
15、列 ： 0015 (1) 编码野生型 wsFGFR2c 的核苷酸序列， 如下所示 ； 或 0016 因遗传密码的简并性而与 (1) 的核苷酸序列不同的序列 ； 或 0017 与 (1) 或 (1) 的核苷酸序列至少有 80同源性的序列 ； 0018 所述的编码野生型 wsFGFR2c 的核苷酸序列为 ： 0019 AACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAAAGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCC AACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGGGGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAG。
16、GAGTT TAAGCAGGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTATGGAAAGTGTGGTCCCAT CTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTGGTGGAGAATGAATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTG GAGCGATCGCCTCACCGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGAGACGTAGA GTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGATCAAGCACGTGGA。
17、AAAGAACGGCAGTAAAT ACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACCTCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCACGGACAAAGAGATTGAGGTT CTCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGGGATATCCTT TCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTG ； 0020 (2) 编码 S252W 突变型 msFGFR2c 的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.4 所示 ； 或 0021 因遗传密码的简并性而与 (2) 的核苷酸序列不同的序列 ； 或 0。
18、022 与 (2) 或 (2) 的核苷酸序列至少有 80同源性的序列 ； 0023 所述的编码 S252W 突变型 msFGFR2c 的核苷酸序列为 ： 0024 AACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAAAGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCC AACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGGGGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTT TAAGCAGGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTATGGAAAGTGTG。
19、GTCCCAT CTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTGGTGGAGAATGAATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTG GAGCGATGGCCTCACCGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGAGACGTAGA GTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGATCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAAT ACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACCTCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCAC。
20、GGACAAAGAGATTGAGGTT CTCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGGGATATCCTT TCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTG ； 0025 一种表达重组载体， 含有所述 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因 ； 0026 所述的表达重组载体优选为将所述 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因克隆至表达 说 明 书 CN 104177492 A 4 3/14 页 5 载体得到， 或是将所述 FGFR2c 胞外段类似物的编码基因和其他基因重组， 再克隆至表达载 体得到 ； 002。
21、7 所述的表达载体包括原核表达载体和真核表达载体 ； 优选为 pET3c 载体、 pCDNA3.1 载体、 pIRESneo3 载体、 pPICZA 载体或 pFastBac 载体 ； 0028 所述的其他基因优选为编码免疫球蛋白表位标记序列的基因或编码 Fc 区的基 因 ； 0029 一种转基因细胞株， 是将上述表达重组载体转染到宿主细胞中得到 ； 0030 所述的宿主细胞优选为 CHO 细胞、 大肠杆菌、 昆虫细胞和酵母细胞中的任一种 ； 0031 一种融合蛋白， 含有上述 FGFR2c 胞外段类似物的氨基酸序列 ； 0032 所述的融合蛋白优选为免疫球蛋白表位标记序列或Fc区与上述FGF。
22、R2c胞外段类 似物连接得到 ； 0033 上述任一项多肽或上述任一项核苷酸序列用于抑制 EGF 信号通路， 从而抑制肿瘤 细胞的增殖 ； 0034 上述表达重组载体、 上述宿主细胞和上述融合蛋白中的任一项用于抑制 EGF 信号 通路， 从而抑制肿瘤细胞的增殖 ； 0035 一种用于抑制 EGF 信号通路和抗肿瘤的药物， 其活性成分包括上述任一项核苷酸 序列、 上述任一项多肽、 上述载体、 上述宿主细胞或上述融合蛋白。 0036 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 本发明在于利用 FGFR2c 胞外段 类似物或其药用组合物阻断如 EGF 信号通路， 阻止其激活， 从而抑制肿瘤及其他以。
23、 EGFR 为 靶点的疾病。 附图说明 0037 图 1 是实施例 1 中 FGFR2c 胞外段类似物 (sFGFR2c) 的 SDS-PAGE 图 ； 其中， 泳道 M 为蛋白Marker， 泳道1为诱导的野生型wsFGFR2c， 泳道2为未诱导的野生型wsFGFR2c， 泳道 3 为诱导的 S252W 突变型 msFGFR2c， 泳道 4 为未诱导的 S252W 突变型 msFGFR2c。 0038 图 2 是实施例 1 中 sFGFR2c 的蛋白杂交图 ； 其中， 泳道 1 为野生型 wsFGFR2c， 泳道 2 为 S252W 突变型 msFGFR2c。 0039 图 3 是 实 施 。
24、例 7 中 sFGFR2c、 sFGFR2c(147-366aa) 和 sFGFR2c(151-377aa) 稳 定性比较图和肿瘤细胞抑制效果比较图 ； 其中图 A 是 sFGFR2c 稳定性的电泳图， 图 B 是 sFGFR2c(147-366aa) 稳定性的电泳图， 图 C 是 sFGFR2c(151-377aa) 稳定性的电泳图。 0040 图 4 是实施例 8 中 sFGFR2c 与 EGFR 的结合能力的 co-IP 图 ； 其中， wsFGFR2c 为野 生型 FGFR2c 胞外段类似物， msFGFR2c 为 S252W 突变型 msFGFR2cFGFR2c 胞外段类似物。 00。
25、41 图5是实施例8中sFGFR2c对DU145细胞增殖影响的CCK8结果图 ； 其中， wsFGFR2c 为野生型 FGFR2c 胞外段类似物， msFGFR2c 为 S252W 突变型 FGFR2c 胞外段类似物， 代表 与空白对照组相比， P 0.01 ； 代表与 EGF 单独诱导组相比， P 0.01。 0042 图 6 是实施例 8 中 FGFR2c 胞外段类似物对 EGFR/ERK 信号通路影响的蛋白杂交鉴 定图 ； 其中， wsFGFR2c 为野生型 FGFR2c 胞外段类似物， msFGFR2c 为 S252W 突变型 FGFR2c 胞 外段类似物。 说 明 书 CN 1041。
26、77492 A 5 4/14 页 6 具体实施方式 0043 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0044 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等 人， 分子克隆 ： 实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所 述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例中所用到的各种常用化学试剂， 均为市售 产品。所用到的细胞株和载体均为商业化产品。F 开头的引物一般为上游引物， R 开头的引 物一般为下游引物。 0045 实施例 1 野。
27、生型及突变型 FGFR2c 胞外段类似物多肽基因在大肠杆菌中的表达 0046 本实施例描述野生型 wsFGFR2c 和 S252W 突变型 msFGFR2c 的制备过程。 0047 一、 FGFR2c 胞外段类似物多肽基因的制备 ： 0048 1、 用 Trizol 法从人胎盘组织 ( 从广东某医院经产妇同意获得新鲜胎盘组织 ) 提 取野生型 FGFR2c 胞外段总 RNA， 并建立 cDNA 文库 ； 0049 (1) 用 Trizol 法抽提 mRNA ： 使用 Trizol 试剂进行抽提， 具体步骤见文献 “张 志成 . 突变型 FGFR2IIIc 胞外段的原核表达、 体外复性及活性研究。
28、 . 暨南大学硕士论 文 ,2007:46-47” 。 0050 (2) 进行 RT-PCR 以获得 cDNA ： 0051 计算好整个逆转录 PCR 各成分的用量， 先在 PCR 管内加入步骤 (1) 制备的样品总 RNA 和 DEPC 处理水， 在 PCR 仪上进行 RNA 预变性， 条件为 65， 10min。预变性后立即插入 冰中。然后再添加逆转录反应中的其他成分， 进行逆转录反应， 得到 cDNA。具体如下 ： 0052 0053 逆转录 PCR 程序 ： 30， 10min ； 42， 1h ； 70， 10min。 0054 2、 引物的设计 ： 0055 本发明中引物合成均来自。
29、于北京六合华大基因科技股份有限公司。 0056 本发明中限制性内切酶均来自于 TaKaRa。 0057 野生型 wsFGFR2c 基因引物序列如下 ： 0058 F1 ： 5 -CGCATATGAACAAGAGAGCACCATAC-3 ； 划横线为 Nde 酶切位点 ； 0059 R1 ： 5 -ATGGATCCCTATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3 ； 划横线为 BamH I 酶切位点。 0060 为获得编码 S252W 突变型 msFGFR2c 的基因， 设计一对定点突变引物， 如下 ： 0061 F2 ： 5 -TTGTGGAGCGATGGCCTCACCGGCCCAT-3。
30、 ； 说 明 书 CN 104177492 A 6 5/14 页 7 0062 R2 ： 5 -ATGGGCCGGTGAGGCCATCGCTCCACAA-3 。 0063 3、 FGFR2c 胞外段类似物基因序列的扩增 ： 0064 为扩增野生型 FGFR2c 胞外段类似物基因， 使用野生型 wsFGFR2c 引物 (F1 和 R1) 对步骤 1 得到的 cDNA 进行 PCR， 得到野生型 wsFGFR2c 基因。 0065 为扩增突变型 FGFR2c 胞外段类似物基因， 利用重叠延伸 PCR 法， 以野生型 wsFGFR2c 基因为模板， 分别使用突变型 PCR 引物， 扩增得到 S252。
31、W 突变型 msFGFR2c 基因。 0066 上述 PCR 的扩增体系和反应条件如下 (PrimerSTAR max 来自 TaKaRa) ： 0067 野生型 FGFR2c PCR 反应体系 ： 0068 0069 重叠 PCR 进行点突变获得 S252W 突变型 msFGFR2c 基因包括两个步骤 ： 0070 第一步 PCR 反应体系 ： 0071 0072 第二步 PCR 反应体系 ： 0073 0074 反应条件为 ： 96 5min ； 94 15s、 60 15s、 72 5s， 31 个循环 ； 72 10min。 0075 4、 收集、 纯化、 鉴定步骤 ： 0076 1浓。
32、度的琼脂糖电泳， 切胶， 使用 DNA 凝胶回收试剂盒 (TIANGEN， DP209) 回收 DNA， 回收得到的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。OD260/ 说 明 书 CN 104177492 A 7 6/14 页 8 OD280比值应为 1.7-1.9。 0077 二、 野生型及突变型的 FGFR2c 胞外段类似物多肽基因重组载体的构建 ： 0078 1、 以双酶切和连接反应构建重组质粒 0079 分别将 PCR 扩增的序列与 pET3c 载体 ( 来自美国 Invitrogen 公司 ) 同时进行 Nde 和 BamH 双酶切， 酶切反应条件 ： 37。
33、水浴 4h ； 0080 pET3c 质粒和 FGFR2c 基因分别经 Nde 和 BamH 双酶切后， 使用 T4DNA 连接酶 进行连接， 按T4DNA连接酶说明书操作， 配制反应体系， 连接反应条件为16水浴12h， 得到 连接产物。 0081 2、 重组质粒的表达和鉴定 0082 I、 CaCl2法转化大肠杆菌DH5菌株 ： 先用CaCl2制备大肠杆菌DH5感受态， 接着 使用上述步骤得到的连接产物转化大肠杆菌DH5感受态， 具体步骤见文献 “张志成.突变 型 FGFR2IIIc 胞外段的原核表达、 体外复性及活性研究 . 暨南大学硕士论文 ,2007:46” 。 0083 II、 重。
34、组质粒的双酶切鉴定 ： 0084 用接种环多次挑取单菌落分别至于含 100g/ml 氨苄青霉素 (Amp) 的 5ml LB 培 养基中， 并做好标记， 37摇床震荡培养12h， 抽提质粒(按照OMEGA质粒小提试剂盒操作方 法 )， 进行双酶切鉴定 ( 使用 Nde 和 BamH 双酶切 )， 选取双酶切鉴定成功的单克隆送 生工生物公司测序， 获得测序正确的 pET3c-FGFR2c、 pET3c-S252W-FGFR2c 两种重组质粒。 0085 三、 FGFR2c 胞外段类似物多肽基因在大肠杆菌中的表达 ： 0086 (1)按照上述CaCl2法转化大肠杆菌DH5菌株的方法， 同理将上述两。
35、种重组质粒 分别转入到大肠杆菌 BL21(DE3)(Novagen) 工程菌种中， 获得表达菌株 ； 0087 (2) 按体积比 1 ： 50 的接种比例将 BL21(DE3) 表达菌株接种到含有质量体积比 0.1 Amp 的灭菌的 LB 液体培养基中， 37、 200rpm 摇床培养。 0088 当菌体 OD600 达到 0.6 0.8 时， 设对照组和诱导组 ： 诱导组加 0.84M IPTG 至终 浓度为 0.84mM， 37诱导表达 3h ； 对照组不做任何处理。 0089 以 SDS-PAGE 电泳鉴定目的蛋白表达情况， 结果如图 1 所示。结果表明， IPTG 能较 好地诱导 BL。
36、21(DE3) 表达菌株表达 FGFR2c 胞外段类似物。 0090 四、 FGFR2c 胞外段类似物多肽的收集与纯化 ： 0091 (1) 按步骤三的方法获得 IPTG 诱导后的菌体， 接着 4、 6000rpm 离心 30min 收集 菌体沉淀。 0092 (2) 按菌体 ： 破碎缓冲液 1g ： (8 10)ml 的比例， 超声破碎菌体， 破碎完成 后 4、 18000rpm 离心 60min， 收集破碎的上清。破碎条件是 ： 工作 3s， 停 5s， 破碎时间为 18min， 振幅为 65， 破碎缓冲液为 ： 0.15M NaCl、 25mM 磷酸钠缓冲液 (PB， 磷酸二氢钠和磷 酸。
37、氢二钠搭配得到 )、 2mM EDTA， pH 7.5。 0093 (3) 在一些原核表达的菌中， FGFR2c 胞外段类似物蛋白以包涵体形式表达， 则通 过包涵体清洗以及变复性技术来获得活性形式的 FGFR2c 胞外段类似物蛋白 ( 具体方法可 参考专利 ZL200710029286.6 实施例 1)。 0094 (4) 通 过 Western Blot 进 行 检 测，一 抗 为 Bek 抗 体 (c-17)(santa Cruz Biotechnology)， 二抗为兔二抗 (cat NO.AS006,Asbio)。结果如图 2 所示， 表明 FGFR2c 胞 外段类似物能被 FGFR 。
38、抗体特异性识别。 说 明 书 CN 104177492 A 8 7/14 页 9 0095 实施例 2FGFR2c 胞外段类似物在哺乳动物细胞中表达 0096 该实施例描述通过在哺乳动物细胞中的重组表达野生型 wsFGFR2c、 S252W 突变型 msFGFR2c 基因制备潜在糖基化形式的 FGFR2IIIc 胞外段类似物多肽的方法。 0097 1、 引物设计如下 ： 0098 F3 ： 5 -ATATGGATCCGCCGCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3 ； 划横线为 BamH I 酶 切位点 ； 0099 R3 ： 5 -GCGCAAGCTTTCATTA CAG。
39、AACTGTCAACCATGC-3 ； 划横线为 Hind 酶切位点。 0100 2、 载体构建 ： 0101 载体 pCDNA3.1(-)( 购买于美国 Invitrogen 公司 ) 作为表达载体 ； 0102 以实施例 1 得到的 pET3c-FGFR2c、 pET3c-S252W-FGFR2c 为模板， 以 F3 和 R3 为引 物， 进行 PCR， 反应体系和条件同实施例 1。将得到的野生型 wsFGFR2c 基因、 S252W 突变型 msFGFR2c基因分别连接到pCDNA3.1(-)， 转化大肠杆菌DH5感受态细胞， 由此产生的载体 称为 pCDNA3.1-FGFR2c、 pC。
40、DNA3.1-FGFR2c-S252W、 ( 具体步骤同实施例 1， 所用的双酶切的 酶为 BamH I 和 Hind )。 0103 3、 pCDNA3.1-FGFR2c、 pCDNA3.1-FGFR2c-S252W 分别转染 293 细胞 0104 (1) 按照去内毒素质粒小提试剂盒的方法 ( 购买于 OMEGA 公司 ) 抽提质粒， 得到 pCDNA3.1-FGFR2c、 pCDNA3.1-FGFR2c-S252W 质粒 ； 0105 (2) 选用人胚肾细胞 293T 细胞 (ATCC， CRL-3216) 为宿主细胞， 以添加了胎牛血清 (FBS， 终浓度为 10 v/v) 的 DME。
41、M 培养基， 37、 5 CO2饱和湿度培养箱培养细胞生长至融 合 ； 0106 (3) 转染 24h 前， 用质量体积比 0.25的胰酶消化对数期生长的 293T 细胞， 用无 双抗的 DMEM 培养基吹打细胞成悬液， 铺于六孔板中， 每孔 2105个， 使其在转染时完全贴 壁， 且细胞密度达到 50 -60 ； 0107 (4) 用 LipofectamineTM2000 脂质体转染试剂盒 ( 购买于美国 Invirtogen 公司 ) 进行转染， 具体转染步骤如下 ： 0108 LipofectamineTM2000 的 稀 释 ：按 六 孔 板 每 孔 的 量 计 算 ： 5L Lip。
42、ofectamineTM2000 加到 250L opti-MEM 培养基的比例稀释， 静置 5min ； 0109 待转染质粒的稀释 ： 按六孔板每孔的量计算 ： 4g 待转染质粒加到 250L opti-MEM 培养基的比例稀释 ； 0110 将步骤和步骤得到的稀释液等体积混合， 静置 20min， 每孔加 500L 混合 液， 每孔补加 1.5ml opti-MEM 培养基 ； 37、 5 CO2的培养箱培养 4-6h 后换成含体积百分 比 10 FBS 的 DMEM 培养基 ； 转染 24h 后， 小心吸去旧的培养基， 换上含 10 (v/v)FBS 的 DMEM 完全培养基， 继续培。
43、养。 0111 4、 FGFR2c 胞外段类似物蛋白质的纯化与鉴定 ： 0112 4、 18000rpm 离心 30min 收集培养液上清， 蛋白质纯化步骤为 ： 0113 使用肝素亲和层析柱 (GE 17-0998-01 50ml)， 用双蒸水冲洗柱子 3 个柱体积后用 亲和层析平衡液平衡柱子， 流速为 5ml/min， 平衡至少 3 个柱体积后将步骤 (2) 得到的上清 上样， 上样完成后继续用亲和层析平衡液冲洗 3 个柱体积， 换成肝素洗脱液进行洗脱， 在波 长为 280nm 处收集单一的洗脱峰， 得到野生型 wsFGFR2c 多肽和 S252W 突变型 msFGFR2c 多 说 明 书。
44、 CN 104177492 A 9 8/14 页 10 肽， -70保存， 用于后续试验。 0114 亲和层析平衡液 ： 25mM HEPES、 0.15M NaCl， pH 7.5 ； 0115 肝素洗脱液 ： 25mM HEPES、 1.5M NaCl， pH 7.5 ； 0116 流速为 5ml/min。 0117 通过 Western Blot 进行鉴定。结果表明 FGFR2c 胞外段类似物能被 FGFR 抗体特 异性识别。 0118 实施例 3FGFR2c 胞外段类似物在 CHO 细胞中表达 0119 1、 引物设计 ： 0120 上游引物 F4 ： 5 -ATATGCTAGCGCC。
45、GCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3 ； 划横线为 Nhe I 酶切位点 ； 0121 下游引物 R4 ： 5 -GCGCGAATTCTCATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3 划横线为 EcoR I 酶 切位点。 0122 2、 载体构建 ： 0123 载体 pIRESneo3( 购自 Clontech 公司 ) 作为表达载体 ； 0124 按实施例 2 步骤 2 操作， 所用的引物为 F4 和 R4， 所用的限制性内切酶为 Nhe I 和 EcoR I。由此产生的载体称为 pIRESneo3-FGFR2c、 pIRESneo3-FGFR2c-S252W。
46、。 0125 3、 pIRESneo3-FGFR2c、 pIRESneo3-FGFR2c-S252W 分别转染 CHO-DG44 细胞 0126 (1) 用 无 内 毒 素 质 粒 大 提 试 剂 盒 抽 提 质 粒，得 到 pIRESneo3-FGFR2c、 pIRESneo3-FGFR2c-S252W 质粒 ； 0127 (2) 分 别 用 步 骤 (1) 得 到 的 质 粒 转 染 中 华 仓 鼠 卵 巢 细 胞 CHO-DG44 细 胞 (Invitrogen 公司 )， 转染步骤同实施例 2 ； 经嘌呤霉素高压 (400ng/ml) 筛选后得到稳定克 隆的重组 CHO 细胞 ； 01。
47、28 (3) 取重组 CHO 细胞， 按 5105个 /ml 接种于 1.5L 含 4mmol/L 谷氨酰胺、 0.68mg/ L 次黄嘌呤、 0.194mg/L 胸腺嘧啶的 proCHO5 培养基中， 用 5L 摇瓶培养， 在转速为 110r/min 的条件下， 37培养 72h 后， 转至 31继续培养 216h ； 0129 (4)收获1.5L培养体积下细胞培养液上清， 取500ml经0.45m滤膜过滤， 按照实 施例 2 的方法使用肝素亲和层析柱纯化目的蛋白， 并通过 Western Blot 进行鉴定。结果表 明 FGFR2c 胞外段类似物能被 FGFR 抗体特异性识别。 0130 。
48、实施例 4FGFR2c 胞外段类似物多肽在酵母细胞中表达 0131 1、 引物设计 ： 0132 上游引物 F5 ： 5 -ATATCTCGAGGCCGCCACC ATG AACAAGAGAGCACCATAC-3 ； 划横线为 Xho I 酶切位点 ； 0133 下游引物 R5 ： 5 -GCGCTCTAGATCATTA CAGAACTGTCAACCATGC-3 ； 划横线为 Xba 酶切位点。 0134 2、 载体的构建 ： 0135 所用的载体为毕赤酵母表达载体 pPICZA(Invitrogen)。 0136 按实施例 2 步骤 2 操作， 所用的引物为 F5 和 R5， 所用的酶为 Xho I 和 Xba 。由 此产生的载体称为 pPICZA-FGFR2c、 pPICZA-FGFR2c-S252W。 0137 3、 大肠杆菌 DH5 菌的转化及鉴定 ： 说 明 书 CN 104177492 A 10 9/14 页 11 0138 按照实施例1中CaCl2法转化大肠杆菌DH5菌株的方法， 将pPICZA-FGFR2c。