《产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法.pdf（48页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104066834 A (43)申请公布日 2014.09.24 CN 104066834 A (21)申请号 201280064144.2 (22)申请日 2012.12.21 11400061.5 2011.12.22 EP C12N 1/21(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C07K 14/71(2006.01) A61K 39/00(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (71)申请人 万科斯蒙股份有限公司 地址 瑞士巴塞尔 (72)发明人 海因茨尤贝瑙诺 霍尔格西德 雷纳特詹森 。
2、马尔科施普林格 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 杨生平 (54) 发明名称 产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 可 用 于 培 养 伤 寒 沙 门 氏 菌 (Salmonella typhi) 减毒突变株的新方法， 所述 菌株不具有半乳糖表异构酶活性并且含有重组的 DNA分子。 所述方法包括这样的步骤 ： 培养所述伤 寒沙门氏菌菌株但在发酵过程中不向培养基中添 加葡萄糖， 起始的葡萄糖含量在达到平台期之前 耗尽。本发明还涉及可通过所述方法获得的伤寒 沙门氏菌减毒突变株以及涉及可用作疫苗的含有 编码VEGF受体蛋白的重。
3、组DNA分子的伤寒沙门氏 菌减毒突变株。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.06.23 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2012/005364 2012.12.21 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/091898 EN 2013.06.27 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 13 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书22页 序列表13页 附图10页 (10)申请公布号 CN 104066834 A CN 104066834 A 1/。
4、2 页 2 1. 一种培养缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝的含有表达盒的重组 DNA 分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法， 其包括以发酵规模在起始 pH 值接近中性的含有蛋白胨的缓冲培养基中培养所述菌株 的步骤， 其中发酵过程中对所述培养基中葡萄糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄 糖含量减少到零。 2. 权利要求 1 的方法， 其中发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖并且起始的葡萄 糖含量在达到平台期之前耗尽。 3. 权利要求 1 或 2 中任一项的方法， 其中所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏 菌 Ty21a。 4. 权利要求 1 到 3 任一项的方法， 其中所述表达盒是真。
5、核表达盒， 优选编码 VEGF 受体 蛋白， 优选选自人 VEGFR-2 及与其具有至少约 80同一性的同源蛋白的 VEGF 蛋白， 特别地 其中人 VEGFR-2 具有 SEQ ID NO1 所示的氨基酸序列。 5.权利要求1到4任一项的方法， 其中所述缓冲的培养基包含非动物来源的蛋白胨， 优 选地其中所述缓冲的培养基是非动物来源的胰蛋白酶大豆液体培养基 (TSB)。 6. 权利要求 1 到 5 任一项的方法， 其中所述培养基的体积是至少约 10L， 优选地从约 10L 到约 10,000L， 更优选地从约 30L 到约 1,000L， 最优选地从约 100L 到约 500L。 7. 权利要。
6、求 1 到 6 任一项的方法， 其中所述起始葡萄糖浓度相当于细菌基本培养基中 的葡萄糖浓度或更低， 优选地其中所述起始葡萄糖浓度为从约 0g/l 到约 4g/l。 8. 权利要求 1 到 7 任一项的方法， 其中所述起始 pH 值是从约 5 到小于约 9， 优选地从 约 6 到约 8， 更优选地从约 6.5 到约 7.5。 9.权利要求1到8任一项的方法， 其中所述pH值在所述培养过程中被调整到约6到小 于约 8， 优选地被调整到约 6.5 到约 7.5。 10. 权利要求 1 到 9 任一项的方法， 其中培养进程通过以下确定 ： (i) 测定光密度 (OD) 确定的， 优选地通过 (ia) 。
7、原位监测所述培养物中的光密度或通过 (ib) 取样并测定所取样 品的光密度， 或者通过 (ii) 测定细胞密度， 优选地 (iia) 通过显微镜或 (iib) 通过测定电 阻， 或者 (iic) 通过流式细胞仪， 或通过 (iii) 取样并铺在琼脂平板上， 然后测定菌落形成 单位 (CFU) 值。 11.权利要求1到10任一项的方法， 其中在光密度达到约6.0之前， 优选地在光密度约 5 到约 6 时收获细胞。 12. 权利要求 1 到 11 任一项的方法， 其中所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏 菌 Ty21a 并且所述重组 DNA 分子含有卡那霉素抗性基因、 pMB1ori、 受 CM。
8、V 启动子控制的编 码人 VEGFR-2 的真核表达盒， 特别地其中所述人 VEGFR-2 具有如 SEQ ID NO2 所示的核酸序 列。 13. 一种缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝的含有表达盒的 DNA 分子的伤 寒沙门氏菌减毒突变株， 其可通过培养所述菌株的方法获得， 包括以下步骤 ： 以发酵规模在含有蛋白胨起始 pH 值接近中性的缓冲培养基中培养所述菌株， 其中所 述培养基中葡萄糖的量在发酵过程中被调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到 权 利 要 求 书 CN 104066834 A 2 2/2 页 3 零， 优选地其中在发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖并且起始的葡。
9、萄糖含量在达到 平台期之前耗尽。 14. 权利要求 13 的减毒突变株， 其中所述表达盒是编码 VEGF 受体蛋白的真核表达盒， 优选选自人VEGFR-2及与其具有至少约80同一性的同源蛋白的VEGF受体蛋白， 其中所述 人 VEGFR-2 具有 SEQ ID NO1 所示的氨基酸序列。 15. 权利要求 14 的减毒突变株， 其中所述减毒突变株是伤寒沙门氏菌 Ty21a 并且所述 重组 DNA 分子含有卡那霉素抗性基因、 pMB1ori、 受 CMV 启动子控制的编码人 VEGFR-2 的真 核表达盒， 其中所述人 VEGFR-2 具有如 SEQ ID NO2 所示的核酸序列。 16. 一种。
10、用作疫苗的伤寒沙门氏菌 Ty21a 减毒突变株， 其含有至少一个拷贝的含有真 核表达盒的重组 DNA 分子， 所述真核表达盒编码 VEGF 受体蛋白， 优选选自人 VEGFR-2 及与 其具有至少约 80同一性的同源蛋白的 VEGF 受体蛋白， 特别地其中所述人 VEGFR-2 具有 SEQ ID NO1 所示的氨基酸序列。 权 利 要 求 书 CN 104066834 A 3 1/22 页 4 产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法 技术领域 0001 本发明涉及新的可用于产生伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi) 减毒突变株的方 法， 所述菌株不具有半乳糖表异构酶活性并且含有重组的 。
11、DNA 分子。所述方法包括培养所 述伤寒沙门氏菌菌株的步骤， 在发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖， 所述培养基中起始 的葡萄糖含量在达到平台期之前耗尽。 本发明还涉及可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌 减毒突变株以及涉及可用作疫苗的含有编码 VEGF 受体蛋白的重组 DNA 分子的伤寒沙门氏 菌减毒突变株。 背景技术 0002 在疫苗开发的多种不同方法中， 活菌苗是其中最有前景的， 由于其模拟了许多病 原菌的侵入途径并且能够在全身和粘膜腔两个水平上诱导有效的体液和细胞免疫应答。 活 菌苗可通过口腔或经鼻给药， 与肠胃外给药相比其具有简单和安全的优势。批量制备成本 较低并且活菌苗制剂具有高稳定性。。
12、 通过缺失基因可实现减毒， 所述基因包括毒性基因、 调 节基因和代谢基因。 0003 减毒细菌疫苗不仅可被用于诱导其相应病原菌菌株的免疫， 而且可被改进后用于 递送一种或多种异种抗原。 0004 肠炎沙门氏菌 (Salmonella enterica) 的减毒产物用作递送异种抗原到哺乳动物 免疫系统的载体是非常有前景的， 因为肠炎沙门氏菌菌株可通过免疫系统的粘膜途径递送 并且具有入侵宿主组织并存留的能力， 同时可持续产生异种抗原。 此外， 沙门氏菌菌株可在 全身和粘膜腔两种水平激发体液和细胞免疫应答。 0005 通过aro突变减毒的数种鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimuriu。
13、m)已显示是动 物模型中异种抗原的安全和有效的递送载体。 0006 WO03/073995 中描述了通过活的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株将编码异种抗原 的 DNA 结构， 特别是 VEGF 受体蛋白递送到小鼠靶细胞的方法。Niethammer 等 (Nature Medicine2002,8(12),1369) 揭示了含有编码鼠血管内皮生长因子受体 2(VEGFR-2 或 FLK-1) 的表达载体的减毒的鼠伤寒沙门氏菌 aroA 菌株 SL7207 具有肿瘤疫苗的功能， 所述 鼠血管内皮生长因子受体 2 对肿瘤血管发生是必要的。 0007 但是， 只有一种减毒的肠炎血清型沙门氏菌菌株， 其称为肠炎血。
14、清型伤寒沙门氏 菌 Ty21a( 简称 ： 伤寒沙门氏菌 Ty21a) 可被接受用于人。 0008 通过化学诱变野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌 Ty2 并且包含 galE 基因的功 能缺失突变以及其他未经发现的突变可获得这种耐受性好的针对伤寒的活口服疫苗。 在现 场试验显示有效并且安全后， 其已在许多国家被批准作为伤寒疫苗。 0009 对于可安全用于人的活的减毒细菌载体用作异种抗原特别是肿瘤抗原的递送 载体具有很大的需求。提供这种减毒的细菌载体用作 DNA 疫苗还需要高效、 高产地培养所 述异种抗原 DNA 转化的所述减毒细菌菌株。使用重组 DNA 构建转化细菌菌株经常会导致细 胞生长的下降。
15、。因此， 通常需要改良优化的大规模培养过程以获得高产的具有活力和功能 说 明 书 CN 104066834 A 4 2/22 页 5 活性的细胞。 0010 发明目的 0011 本发明的目的是改进现有技术中培养伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法。尤其是， 本发明的目的是开发可获得含有编码异种抗原的重组 DNA 分子的高产有活力细菌的有效 培养方法。 所述方法和可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌减毒突变株将满足对安全的沙 门氏菌作为可用于人的疫苗的需求。 所述方法将尤其适合于商业大规模生产基于减毒沙门 氏菌的 DNA 疫苗。 发明内容 0012 令人意外地发现， 如果在达到平台期以前培养基中葡萄糖含量减。
16、少到零， 缺失半 乳糖表异构酶活性的伤寒沙门氏菌减毒菌株的细胞产量会显著增加。本发明显示， 在发酵 过程中向培养基中添加葡萄糖未产生更高的细胞量 / 更高的 OD 值。相反地， 在培养所述减 毒沙门氏菌过程中不添加葡萄糖， 在细胞生长平台期的初始阶段的OD值约为6到8， 而相同 的培养在葡萄糖水平约 1 到约 4g/l， 优选约 2 到约 3g/l 时 ( 例如， 通过向培养基中持续添 加葡萄糖实现 ) 得到的 OD 值仅为约 3 到约 5.5。 0013 与含有葡萄糖培养的细胞相比， 本发明所述用于培养伤寒沙门氏菌减毒突变株的 方法还可产生不同形态的细胞。与含有葡萄糖培养的细胞相比， 无葡萄。
17、糖条件下培养的伤 寒沙门氏菌细胞更小且更短。 但是， 与含有葡萄糖的培养基中培养的细胞类似， 这些形态不 同的细胞具有完全的生物学活性， 并未表现出任何细胞裂解的趋势。 0014 无论所选择的伤寒沙门氏菌减毒菌株含有编码异种抗原的重组 DNA 分子 ( 例如 pcDNA3.1-FLK1 或其衍生的质粒例如 pVAX10.VR2-1) 或者不含重组 DNA 分子 ( 空的减毒菌 株 )， 通过本发明的方法在培养过程中不添加葡萄糖获得的细胞产量的增加都可以实现。 0015 因此， 一方面， 本发明涉及培养缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝含 有表达盒的DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法。
18、， 其包括在含有蛋白胨起始pH值接 近中性的缓冲培养基中以发酵规模培养所述菌株的步骤， 其中发酵过程中对培养基中葡萄 糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。 0016 在一个具体的实施方案中， 发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖， 并且在达到平 台期之前起始的葡萄糖被耗尽。 0017 在一个具体的实施方案中， 所述伤寒沙门氏菌突变株是伤寒沙门氏菌 Ty21a。 0018 在一个具体的实施方案中， 所述表达盒是真核表达盒。 在一个具体的实施方案中， 所述表达盒编码 VEGF 受体蛋白。在一个具体的实施方案中， 所述 VEGF 受体蛋白选自人 VEGFR-2及与其具有至少约80同一。
19、性的同源蛋白。 在一个优选的实施方案中， 人VEGFR-2 的氨基酸序列如 SEQ ID NO1 所示。 0019 在一个具体的实施方案中， 所述缓冲的培养基包含非动物来源的蛋白胨。在一个 优选的实施方案中， 所述缓冲的培养基是非动物来源的胰蛋白酶大豆液体培养基 (TSB)。 0020 在一个具体的实施方案中， 所述培养基的体积是至少约 10L， 更具体地是从约 10L 到约 10,000L， 更具体地是从约 30L 到约 1,000L， 最具体地是从约 100L 到约 500L。 0021 在一个具体的实施方案中， 所述起始葡萄糖浓度与细菌基本培养基一致或更低， 具体地所述起始葡萄糖浓度从约。
20、 0g/l 到约 4g/l。 说 明 书 CN 104066834 A 5 3/22 页 6 0022 在一个具体的实施方案中， 所述起始pH值是从约5到小于约9， 具体地从约6到约 8， 更具体地从约 6.5 到约 7.5。 0023 在一个具体的实施方案中， 在所述培养过程中将所述pH值调整到约6到约8， 具体 地调整到 pH 值约 6.5 到约 7.5。 0024 在一个具体的实施方案中， 所述培养进程是通过测定光密度 (OD) 确定的， 具体地 是通过原位检测培养物的光密度或者通过取样并测定样品的光密度确定的。 0025 在另一个具体的实施方案中， 所述培养进程是通过测定细胞浓度确定的。
21、， 具体地 是通过显微镜或通过测定电阻或通过流式细胞仪确定的。 0026 在另一个具体的实施方案中， 所述培养进程是通过取样并接种到琼脂平板上来测 定菌落形成单位 (CFU) 值确定的。 0027 在一个具体的实施方案中， 在达到光密度约6时收获细胞， 具体地在光密度约5到 约 6 时收获细胞。 0028 在一个具体的实施方案中， 所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏菌 Ty21a， 所述重组 DNA 分子包括卡那霉素抗性基因、 pMB1ori 和受 CMV 启动子控制的编码人 VEGFR-2 的真核表达盒。在一个具体的实施方案中， 所述人 VEGFR-2 具有 SEQ ID NO2 所示的。
22、核酸序 列。 0029 另一方面， 本发明涉及缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝含有表达盒 的重组 DNA 分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株， 其可通过培养所述菌株获得， 包括以发酵规 模在含有蛋白胨起始 pH 值接近中性的缓冲培养基中培养所述菌株的步骤， 其中发酵过程 中对培养基中葡萄糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。 0030 在一个具体的实施方案中， 在所述发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖， 并 且在达到平台期之前起始量的葡萄糖被耗尽。 0031 在一个具体的实施方案中， 所述表达盒是编码 VEGF 受体蛋白的真核表达盒。在一 个具体的实施方案中， 所述真核表。
23、达盒编码选自人 VEGFR-2 及与其具有至少约 80同一性 的同源蛋白的 VEGF 受体蛋白。在一个具体的实施方案中， 所述人 VEGFR-2 的氨基酸序列如 SEQ ID NO1 所示。 0032 在一个具体的实施方案中， 所述减毒突变株是伤寒沙门氏菌 Ty21a 并且所述重组 DNA 分子包括卡那霉素抗性基因、 pMB1ori、 和受 CMV 启动子控制的编码人 VEGFR-2 的真核 表达盒。在一个具体的实施方案中， 所述人 VEGFR-2 具有 SEQ ID NO2 所示的核酸序列。 0033 还有另一方面， 本发明涉及用作疫苗的伤寒沙门氏菌 Ty21a 减毒突变株， 其包括 至少一。
24、个拷贝的含有编码 VEGF 受体蛋白的真核表达盒的重组 DNA 分子。 0034 在某些实施方案中， 所述VEGF受体蛋白选自人VEGFR-2及与其具有至少约80同 一性的同源蛋白。 0035 在一个优选的实施方案中， 所述人 VEGFR 的氨基酸序列如 SEQ ID NO1 所示。 0036 对于安全和经济地生产基于减毒沙门氏菌菌株例如已批准的伤寒沙门氏菌 Ty21a 菌株的商业 DNA 疫苗来说， 通过本发明的方法能够获得更高细胞产量的伤寒沙门氏菌减毒 突变株是重要的。伤寒沙门氏菌 Ty21a 携带编码异种抗原的重组 DNA 分子例如所述表达质 粒 pVAX10.VR2-1， 因而可以更高。
25、产地培养产生更高产量的可用于人的 DNA 疫苗。这也符合 生产和培养沙门氏菌即使是减毒沙门氏菌时的高安全性原则。 说 明 书 CN 104066834 A 6 4/22 页 7 具体实施方式 0037 通过参考以下对本发明的详细描述及其中所包含的实施例可更容易地理解本发 明。 0038 1) 伤寒沙门氏菌包括野生型伤寒沙门氏菌 Ty2 和减毒伤寒沙门氏菌 Ty21a。 0039 在所述受试方法中， 可使用任意伤寒沙门氏菌减毒菌株。伤寒沙门氏菌减毒菌 株 Ty21a 是也称为( 生产商 ： Berna Biotech Ltd.,a Crucell Company, 瑞士 ) 中的活性成分。其是目。
26、前仅有的已许可针对伤寒的活性口服疫苗。该疫苗 已在超过 40 个国家被许可。的市场许可证号为 ： PL15747/0001， 许可时间 ： 1996 年 12 月 16 日。一剂疫苗含有至少 2109个有活力的伤寒沙门氏菌 Ty21a 菌落形成 单位和至少5109个无活力的伤寒沙门氏菌Ty21a细胞。 所述疫苗菌株是在发酵罐内控制 条件下培养的， 其所用培养基中包含消化的酵母提取物、 酸消化酪蛋白、 葡萄糖和半乳糖。 0040 本发明中， 所述伤寒沙门氏菌 Ty21a 细菌菌株的一个生物化学性质是其不具有代 谢半乳糖的能力。所述重组的减毒细菌菌株也不具有将硫酸盐还原为硫化物的能力， 这将 其与。
27、野生型伤寒沙门氏菌 Ty2 菌株相区别。对于伤寒沙门氏菌 Ty21a 菌株的血清学特性， 其含有 O9- 抗原 ( 其是所述细菌的外膜上的多糖 ) 并且缺少 O5- 抗原 ( 其是伤寒沙门氏菌 Ty2 的特征组分 )。另一方面， 该血清学特性支持在分批释放的鉴定试验中包含合适的测 试。 0041 在一个具体的实施方案中， 通过本发明的方法培养的伤寒沙门氏菌减毒突变株是 携带至少一个拷贝的 pVAX10.VR2-1 质粒 DNA 的伤寒沙门氏菌 Ty21a， 所述质粒 DNA 编码人 血管内皮生长因子受体 2(VEGFR-2) 的真核表达盒。该减毒突变株命名为 VXM01 并可被用 作口服肿瘤疫。
28、苗。 0042 本发明中， 所述伤寒沙门氏菌 Ty21a 减毒株在口服递送命名为 VXM01 的 DNA 疫苗 中用作编码异种抗原血管内皮生长因子受体 2(VEGFR-2) 的质粒 DNA 的细菌载体。 0043 基于质粒 DNA 技术递送疫苗可产生广谱的粘膜和全身免疫应答。活的复制型载体 可原位产生它们自身的免疫调节因子例如脂多糖 (LPS)， 这形成了相对于其他给药形式例 如微囊化的优势。 此外， 使用自然侵入途径证明是有利的， 因为许多细菌例如沙门氏菌通过 派尔集合淋巴结的 M 细胞从肠腔流出并最终迁移进入淋巴结和脾， 从而使疫苗靶向免疫系 统的诱发位点。迄今为止， 所述伤寒沙门氏菌 T。
29、y21a 疫苗株已被证明具有非常好的安全范 围。当通过 M 细胞从肠腔逸出后， 所述细菌被吞噬细胞例如巨噬细胞和树突细胞吸收。这 些细胞被病原体激活并可能迁移进入淋巴结和脾。由于它们的减毒突变， 所述伤寒沙门氏 菌 Ty21 菌株在这些吞噬细胞中不能存活而是从此死亡。迄今为止， 没有数据表明伤寒沙门 氏菌 Ty21a 能够进入全身血液系统。因此， 所述活的伤寒沙门氏菌 Ty21a 减毒疫苗株可特 异地靶向免疫系统， 从而具有非常好的安全范围。 0044 携带编码靶抗原的 DNA 的活的减毒细菌携带者可用作口服递送这些抗原的载体。 活的复制型载体可原位产生它们自身的免疫调节因子例如脂多糖 (LP。
30、S)， 这形成了相对于 其他给药形式例如微囊化的优势。 0045 基因免疫接种可具有相对于传统疫苗接种的优势。所述靶 DNA 可在很长时间内检 说 明 书 CN 104066834 A 7 5/22 页 8 测到， 因而可作为储存的抗原。一些质粒中的基序如 GpC 岛是免疫调节因子并且还可作为 由 LPS 和其他细菌组分引起的免疫刺激的佐剂。 0046 如上所述， 通过 M 细胞从肠腔逸出后所述重组沙门氏菌被吞噬细胞吸收。这些吞 噬细胞是被病原体激活并开始分化的， 并且可迁移进入淋巴结和脾。该过程中， 所述细菌 由于它们的减毒突变而死亡并且释放基于所述质粒的真核表达载体， 然后所述质粒通过特 。
31、有的运输系统或者通过胞内渗透转移进入细胞液。最后， 所述载体进入细胞核并转录， 在 宿主细胞的细胞液中产生抗原表达。针对所述异种抗原的具体的细胞毒性 T 细胞， 优选人 VEGFR-2， 被活化的抗原呈递细胞 (APC) 所诱导。 0047 在一个具体的实施方案中， 由所述伤寒沙门氏菌 Ty21a 菌株所携带的重组 DNA 分 子是 pVAX10.VR2-1 质粒 DNA(7.58kb)， 含有真核的人巨细胞病毒 (CMV) 早期瞬时启动子以 保证在宿主细胞中有效转录 VEGFR-2 蛋白， 并且含有原核的复制起始点 (ori) 以保证在细 菌宿主内增殖。对可从商业途径 (Invitrogen。
32、) 获得的 pcDNA3 载体进行改良以符合调节 需要， 以此将在大肠杆菌中复制非必需的序列或者在哺乳动物细胞中表达所述重组蛋白非 必需的序列移除以限定所述 DNA 序列与人类基因组可能的同源性并且最小化染色体整合 的可能性。此外， 使用卡那霉素抗性基因替代氨苄霉素抗性基因。对于本发明方法产生的 伤寒沙门氏菌减毒突变株 VXM01， 将 pVAX1-Flk-1 质粒中的高拷贝 pUC 复制起始点替换为 pVAX10.VR2-1 质粒中的低拷贝复制起始点 pBR322。进行所述低拷贝调整以减少代谢负荷 并使所述结构更加稳定。VAX10.VR2-1 质粒结构的细节如图 2 所示。 0048 2) 。
33、血管内皮生长因子受体 ： 0049 血管内皮生长因子VEGF(Kd75-760pM)是六个结构相关蛋白家族(VEGF-A也称作 VEGF,-B,-C,-D,-E 和 PLGF 胎盘生长因子， 也称作 PGF 或 PIGF-2) 的成员之一， 其调节 血管系统多种组分特别是血液和淋巴管的生长和分化。VEGF 在血管发生中的作用是通过 该蛋白与 VEGFR-2 的相互作用介导的。VEGFR-2 也称作含激酶插入区受体 (KDR)， 其是具有 1356 个氨基酸、 分子量为 200-230kDa 对 VEGF 以及 VEGF-C 和 VEGF-D 高亲和的受体。通过 筛选内皮 cDNA 鉴定的人酪氨。
34、酸激酶受体 VEGFR-2 与以前发现的鼠 VEGFR-2( 也称为胎肝激 酶 1， Flk-1) 具有 85序列同一性。VEGFR-2 通常在内皮和造血干细胞前体以及内皮细胞、 初期造血干细胞和脐带间质中表达。但是， 在静止的成人脉管系统中 VEGFR-2mRNA 是被下 调的。 0050 VEGFR-2 的胞外域含有 18 个可能的 N- 连接糖基化位点。VEGFR-2 最初合成 为 150kDa 的蛋白并迅速糖基化为 200kDa 的中间体， 然后以较低的速率进一步糖基化为 230kDa 在细胞表面表达的成熟蛋白质。 0051 克隆进入 pVAX10.VR2-1 质粒的编码 cDNA 序。
35、列的人 VEGFR-2 氨基酸序列如图 1 所 示。 0052 3) 制造空的和工程伤寒沙门氏菌 Ty21a 0053 本发明所实施的伤寒沙门氏菌减毒突变株的生产过程包括在含有蛋白胨作为氨 基酸和肽源的培养基中培养所述伤寒沙门氏菌减毒突变株。 适合于本发明方法的培养基包 括但不限于标准 TSB 培养基和非动物来源的 TSB 培养基。标准 TSB 培养基和非动物来源的 TSB 培养基都含有 2.5g/l 葡萄糖。通常， TSB 或 TSB- 类似培养基中含有的起始葡萄糖大致 会在伤寒沙门氏菌减毒株培养 35h 后被耗尽， 并且必须每 35h 用新的葡萄糖替换以保 说 明 书 CN 1040668。
36、34 A 8 6/22 页 9 持所述培养基中葡萄糖水平的相对稳定。在培养伤寒沙门氏菌减毒突变株 ( 其可任选地含 有编码异种抗原的DNA分子)的过程中省略添加葡萄糖的步骤发现会导致与添加葡萄糖的 培养相比细胞生长增加， 这是非常令人意外的并且显示所述细菌细胞中的某些代谢途径被 葡萄糖的缺失所启动。如果在所述培养过程开始的 TSB 或 TSB- 类似培养基中不含有葡萄 糖， 也能观察到所描述的效应。因此， 除更高的细胞产量及由此产生的更高的最终 DNA 疫苗 产量之外， 通过阐明发酵过程中给料葡萄糖的步骤不是必需的， 本发明的方法还具有更便 宜、 更简单的优点。 0054 本发明所实施的伤寒沙。
37、门氏菌 Ty21a 减毒突变株的生产过程示例性的描述于下 表 1 ： 0055 0056 说 明 书 CN 104066834 A 9 7/22 页 10 0057 更详细地 ： 所述每种培养物 (TSB 培养基加 25g/ml 卡那霉素 ) 用不同的沙门氏 菌菌株 ( 空的 Ty21a 和重组的 Ty21a(pVAX10.VR2-1) 接种。生产细胞样品的过程中， 所用 的 TSB 培养基含有 2.53.0g/l 葡萄糖， 优选 2.5g/l。在一种对照培养基中， 不添加葡萄 糖。此外， 所述培养基含有卡那霉素， 优选 25g/ml。将所述培养物在 30 2振荡孵 育， 直到光密度达到 OD。
38、600nm0.1。更为详细的描述见实施例部分。 0058 完成所述孵育时间的第一和第二步骤的过程控制包括通过测定 OD600nm、 pH 和 CFU/ ml 来分析细菌生长， 以及如果适用的话确定质粒稳定性 (PST) 和细菌检测。后者的分析是 基于血琼脂测定用于需要复杂营养的病原微生物的溶血反应。所述 CFU 值是在交叉流过滤 (CFF) 之前或其后测定的。最终细菌浓缩物制剂后， 立即测定具有最低细菌浓度制剂的 CFU 和屈光指数。 0059 本发明中省略了给料葡萄糖步骤的方法更省力、 更有效， 可获得更高的细胞产量。 0060 4) 细胞培养过程中葡萄糖给料的影响 0061 在 TSB 或。
39、 TSB- 类似的培养基中测试了空的伤寒沙门氏菌 Ty21a 和工程伤寒沙门 氏菌 Ty21a 的生长， 在 2535培养所述细胞 0 到 30 小时， 优选 30并且 pH 介于 6.5 和 7.5 之间， 优选 pH 为 7.0。以 OD 或 CFU/ml( 菌落形成单位 ) 的值来判断生长。 0062 这些试验的结果显示， 添加葡萄糖未导致所述野生型菌株更高的 OD- 值 / 细胞群 产量， 尽管有葡萄糖消耗。相反地， 未添加葡萄糖的瓶中达到了更高的 OD 值 ( 预培养 1 的 OD 值达到 6， 预培养 2 的 OD 值达到 8)。与未添加葡萄糖的生长相比， 添加葡萄糖后约 1h O。
40、D 保持不变 ( 甚至略有下降 )。在重复添加后， 葡萄糖消耗下降， 未观察到另外的 / 增加的生 长效果。在发酵过程中还监测了 pH 值， 并且在一些试验中如果观察到变化则将其调整到起 始 pH 值。 说 明 书 CN 104066834 A 10 8/22 页 11 0063 不添加葡萄糖时， 在葡萄糖耗尽后观察到 pH 变为碱性， 而添加葡萄糖后 pH 下降 (对比图8中的预培养1和图9中的预培养2)。 在所有的预培养中都观察到该现象， 表明世 代数对此没有影响。在最长 30h 的平均培养时间中， 添加葡萄糖 15 次 ( 优选 13 次 )。 通常在细胞生长约 515 小时后进入指数生。
41、长期之后的平台期， 这取决于所述细胞培养的 起始条件。如果在添加葡萄糖的预培养中加入新的培养基， 则观察到相同的生长特征 ( 不 添加葡萄糖时具有更高的 OD 值 /pH 变为碱性 )。 0064 通过在生长阶段甚至是开始的起始培养基中不给料葡萄糖， 可观察到 pH 值转变 为碱性 (ca.7 到 ca.8)， 虽然所述培养系统中含有缓冲液。在细胞培养过程中将 pH 值调整 到起始 pH(ca.7.0) 可能是有利的。 0065 结果表明， 葡萄糖浓度高于相对低的限度 ( 约 2.5g/l) 时可触发 ( 葡萄糖 ) 代谢 的可逆改变。不囿于任何理论， 可假设存在未经鉴定的物质被分泌到所述培养。
42、基中可抑制 进一步的生长， 即使葡萄糖继续下降至低于触发水平。 接种至新的培养基之后， 该物质被稀 释至低于有效浓度。如果起始培养基中不含任何葡萄糖， 可获得非常类似的结果。 0066 有趣的是， 不只使用空的伤寒沙门氏菌 Ty21a 可获得相同的结果， 而且使用伤寒 沙门氏菌 Ty21apVAX10.VR2-1 工程菌株 (VXM01) 也可以获得相同的结果， 表明该出乎意 料的结果不受人工设计的细菌组成的影响。但是， 如图 12 所示， 如同所预料的， 未进行葡萄 糖给料的工程细菌的细胞生长比野生型菌株慢， 但是最终可获得与野生型菌株相同的光密 度值 (OD7-8)， 而通过添加葡萄糖在含。
43、有葡萄糖条件下培养的工程沙门氏菌菌株并未达到 如此高的光密度值并停止生长， 其通常的细胞密度为 OD3 或更低。 0067 在添加和不添加葡萄糖时， 空的伤寒沙门氏菌 Ty21a 和伤寒沙门氏菌 Ty21a 工程 菌株显示出类似的生长特征。 0068 总之， 如上所述以及下述的本发明关于两张菌株的结果， 添加葡萄糖不会导致更 高的 OD- 值 / 细胞群产量。相反地， 未添加葡萄糖的瓶中达到了更高的 OD 值。未添加葡萄 糖时在葡萄糖耗尽后观察到 pH 变为碱性， 而添加葡萄糖的 pH- 值下降。培养过程中伤寒沙 门氏菌 Ty21a 葡萄糖浓度依赖的代谢变化的效应可能与分泌进入生长培养基中的抑。
44、制性 物质一致， 这迄今尚未确定。 0069 一方面， 本发明涉及培养缺失半乳糖表异构酶活性并包括至少一个拷贝含有表达 盒的DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法， 其包括在含有蛋白胨起始pH值接近中性 的缓冲培养基中以发酵规模培养所述菌株的步骤， 其中发酵过程中对培养基中葡萄糖的量 进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。 0070 本文中， 术语 “包含” 意指 “包括但不限于” 。该术语是倾向于开放的， 用于列举存 在任意所述的特征、 元素、 整体、 步骤或组分， 但不排除存在或增加一种或多种其他特征、 元 素、 整体、 步骤、 组分， 或其组合。因此， 术语 “包含” 包括。
45、更限定性的术语 “由组成” 和 “基 本上由组成” 。 0071 本文中， 术语 “大约” 或 “大致” 意指给定值或范围的 20之内， 或 10之内， 包括 5之内。另外， 特别是在生物系统中， 术语 “大约” 意指在一个大致的对数 ( 即， 数量级 ) 范 围内， 包括在 2 的给定倍数的范围内。 0072 本文中， 术语 “生长” 和 “培养” 同义， 其涉及培养基中微生物的增殖引起它们的生 长。 说 明 书 CN 104066834 A 11 9/22 页 12 0073 本文中， 术语 “发酵” 是指大规模培养微生物， 通常在发酵罐， 即可维持所述微生物 最适生长条件的装置中进行， 。
46、以高产量地生产需要的微生物产品， 包括代谢产物和所述微 生物本身。 0074 本文中， 术语 “减毒的” 是指具有与不含减毒突变的亲本细菌菌株相比降低毒性的 细菌菌株。减毒的细菌菌株优选失去它们的毒性但保留诱导保护性免疫的能力。减毒细菌 可从自然界中发现， 也可在实验室中产生， 例如通过适应新的培养基或细胞培养物或者可 以通过重组 DNA 技术产生。 0075 本文中， 术语 “突变株” 是指其基因组中含有突变的细菌菌株。本文中， 术语 “突 变” 是指核酸序列的改变， 包括点突变、 插入、 缺失、 转座和倒位。 0076 本文中， 术语 “重组 DNA 分子” 是指工程 DNA 构建， 优选。
47、由不同来源的 DNA 片段组 成。所述重组 DNA 分子可以使线状核酸， 或者优选通过将目标开放读码框导入表达载体质 粒中形成的环装重组 DNA 质粒。所述开放读码框优选为异种抗原。所述异种抗原优选为肿 瘤抗原。所述肿瘤抗原优选为 VEGF 受体蛋白。本文中， 术语 “异种抗原” 是指来自伤寒沙 门氏菌之外物种的抗原。 0077 本文中， 术语 “表达盒” 是指包含受控制其表达的调控序列控制的至少一个基因的 核酸单元。 所述伤寒沙门氏菌减毒突变株中的表达盒优选地可介导靶细胞中包含的开放读 码框的转录。表达盒通常包含启动子、 至少一个开放读码框和转录终止信号。 0078 本文中， 术语 “蛋白胨。
48、” 是指包括通过水解含蛋白质材料， 例如通过部分酸或者酶 水解天然蛋白质混合物产生的氨基酸和肽的分解产物的混合物。 0079 本文中， 术语 “接近中性 pH 值” 是指约 5 到约 9 的 pH 值， 优选约 6 到约 8， 更优选 约 6.5 到约 7.5， 最优选约 7.0。 0080 适于本发明方法的培养基包括但不限于标准TSB培养基以及非动物来源的TSB培 养基。本领域公知的标准 TSB 培养基包含胰酪蛋白胨、 大豆粉蛋白胨、 磷酸氢二钾 ( 缓冲 剂)、 氯化钠以及起始浓度2.5g/l的葡萄糖作为能量来源。 适合的非动物来源的TSB培养基 的一个实例是非动物来源的 CASO Bou。
49、illon， 其包括非动物来源的蛋白胨、 磷酸氢二钾 ( 缓 冲剂 )、 氯化钠以及起始浓度 2.5g/l 的葡萄糖。 0081 本文中， 术语 “平台期” 是指指数生长期或者对数生长期之后的细菌生长阶段， 此 时生长培养基中的细胞密度保持基本恒定。因此， 术语 “达到平台期之前” 是指平台期之前 的任意时间点， 其包括延滞期(即细菌生长的第一个阶段， 此时细菌适应培养条件)和指数 期。令人意外地发现， 依据本发明的方法培养伤寒沙门氏菌减毒突变株延长了指数生长阶 段。 当所用的起始葡萄糖在指数生长期被耗尽但发酵过程中不添加葡萄糖培养伤寒沙门氏 菌 Ty21a 减毒突变株时， 平台期的出现不早于培养 9 小时后， 优选培养 9 到 20 小时后， 更优 选培养 9 到 15 小时后， 最优选培养 9 到 12 小时后。 0082 在一个具体的实施方案中， 发酵过程中不添加葡萄糖并且起始。