说明书变体α-淀粉酶及其使用方法
优先权
本申请要求提交于2011年12月22日的美国临时申请系列号61/579,356的优先权，其全文据此以引用方式并入。
技术领域
本发明公开了与变体α-淀粉酶相关的组合物和方法。
背景技术
淀粉由直链淀粉(15-30％重量/重量)和支链淀粉(70-85％重量/重量)的混合物组成。直链淀粉由α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量(MW)为约60,000至约800,000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。
浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，该方法涉及：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度为约7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡糖苷酶(也称为葡糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。
α-淀粉酶通过随机裂解内部α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。特别是来自芽孢杆菌属(Bacilli)的α-淀粉酶已被用于各种不同的用途，包括淀粉液化、纺织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性，用于烘焙和酿造，食品工业的糖浆的生产，以及用于动物饲料中以提高可消化性。这些酶也可用于在盘碟洗涤和衣物洗涤过程中除去含淀粉污垢和污渍。
一种表征的α-淀粉酶为嗜碱芽孢杆菌属(alkaliphilic Bacillus)物种菌株TS-23的α-淀粉酶，其产生至少五种呈现出淀粉水解活性的酶(Lin et al.,(1998)Biotechnol.Appl.Biochem.28:61-68(Lin等人，1998年，《生物技术 应用生物化学》，第28卷，第61-68页))。尽管芽孢杆菌属物种菌株TS-23的α-淀粉酶在宽的pH范围(即，pH4.7至10.8)内是稳定的，但是其最适pH为9。尽管酶在较低温度(如，15-20℃)下具有活性，但是其最适温度为45℃。这种酶的变体如在国际专利申请WO 2009/061380、WO 2009/100102和WO 2010/115028中已经有所描述。
发明内容
本发明组合物和方法涉及变体α-淀粉酶多肽及其使用方法。
在一个方面，提供变体α-淀粉酶多肽，其在有效氨基酸位置包含至少一个可组合突变；其中：(i)所述可组合突变为与亲本α-淀粉酶相比，改善了变体α-淀粉酶的至少一种所需特性，而与亲本α-淀粉酶相比，未显著降低变体α-淀粉酶的表达、活性或稳定性的突变，(ii)所述有效位置为可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，所有这些置换导致符合(i)的要求的变体淀粉酶，并且(iii)所述可组合突变列在表C或表D中，其使用SEQ ID NO:2进行编号。
在一些实施例中，变体可组合突变具有表A中列出的性能特性。在一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些特性中的任一者，PI大于或等于1.0。在一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI。在一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI。
在一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为+++、++++或+++++。在一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为++++或+++++。在一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为+++++。在一些实施例中，可组合突变的有效性得分为1或2。
在一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在另一个方面，提供了包含任何上述变体淀粉酶的组合物。在一些实施例中，该组合物有效除去衣物、盘碟或织物的淀粉污渍。在一些实施例中，该组合物包含表面活性剂。在一些实施例中，该组合物为洗涤剂组合物。在一些实施例中，该组合物为衣物洗涤剂或衣物洗涤添加剂。在一些实施例中，该组合物为人工或自动盘碟洗涤剂。
在另一方面，提供一种用于从表面移除含淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括：在包含有效量的权利要求1-13中任一项所述的变体淀粉酶的含水组合物的存在下温育该表面，允许多肽水解含淀粉污渍中存在的淀粉组分以产生溶解于含水组合物中的较小淀粉衍生分子，以及清洗该表面，从而从该表面移除含淀粉污渍。
在一些实施例中，含水组合物还包含表面活性剂。在一些实施例中，该表面为纺织物表面。在一些实施例中，该表面在盘碟上。在一些实施例中，该表面为弄脏的硬质表面。
在另一个方面，与包含多核苷酸的表达载体和包含表达载体的宿主细胞一样，提供编码任何上述多肽的分离的多核苷酸。
通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例将显而易见。
附图说明
图1为质粒pHPLT-Amy TS23t的图谱。
序列的简要说明
SEQ ID NO:1示出芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的成熟形式的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2示出芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的C-端截短形式的成熟形式的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明描述了与变体α-淀粉酶相关的组合物和方法。变体淀粉酶包括突变以赋予性能益处，例如增加的淀粉底物的水解、增强的清洁性能、提高的热稳定性、提高的储存稳定性、增加的溶解度、改变的pH曲线、降低的钙依赖性、和/或增加的表达。在一些情况下，性能益处在低温下实现。
对象α-淀粉酶为芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶(即，AmyTS23)的变体，或者与AmyTS23共用至少60％、至少70％、至少80％、或甚至至少90％序列同一性的淀粉酶的变体。
本发明的淀粉酶的示例性应用是在清洁组合物的制备中，例如用于清洁衣物、盘碟[包括人工和自动盘碟洗涤(ADW)]和其他表面，用于纺织物处理(如，退浆)的洗涤剂组合物；在动物饲料中用于提高的可消化性，以及用于淀粉液化和糖化。所述组合物和方法的这些及其他方面在下文详细描述。
1.定义和首字母缩略词
根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一种酶”包括多个此种酶，而提及“该剂型”，包括提及一个或多个剂型以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。
本文档被组织成多个章节，以便于阅读；然而，读者将会知道，在一个章节中进行的陈述可以应用到其他章节。因此，本公开不同章节使用的标题不应理解为限制性的。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。为了清楚起见，定义以下缩写和/或术语：
1.1 缩写/首字母缩略词
如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定：
AE 醇乙氧基化物
AEO 醇乙氧基化物
AEOS 醇乙氧基硫酸盐
AES 醇乙氧基硫酸盐
AOS α-烯烃磺酸盐
AS 烷基硫酸盐
cDNA 互补DNA
CMC 羧甲基纤维素
DNA 脱氧核糖核酸
DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸
EC 酶学委员会
EDTA 乙二胺四乙酸
EO 环氧乙烷(聚合物片段)
GA 葡糖淀粉酶
IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
kDa 千道尔顿
LAS 直链烷基苯磺酸盐
LAT 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶
MW 分子量
MWU 改良的伍格母单位；1.6×10-5mg/MWU＝活性单位
NOBS 壬酰基氧基苯磺酸盐
NTA 次氨基乙酸
OxAm Purastar HPAM5000L(丹尼斯克美国公司(Danisco US Inc.))
PEG 聚乙二醇
PI 等电点
PVA 聚(乙烯醇)
PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)
RNA 核糖核酸
SAS 烷基磺酸盐
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
sp. 物种
TAED 四乙酰基乙二胺
w/v 重量/体积
w/w 重量/重量
v/v 体积/体积
wt％ 重量百分比
℃ 摄氏度
H2O 水
dH2O或者DI 去离子水
dIH2O 去离子水，Milli-Q过滤
g或者gm 克
μg 微克
mg 毫克
kg 千克
μL和μl 微升
mL和ml 毫升
mm 毫米
μm 微米
M 摩尔浓度
mm 毫摩尔浓度
μm 微摩尔浓度
U 单位
sec 秒
min(s) 分钟
hr(s) 小时
DO 溶解氧
Ncm 牛顿厘米
EtOH 乙醇
eq. 当量
N 当量浓度
ds或DS 干固形物含量
1.2 定义
术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除其他方面外还能够催化淀粉的降解的酶。α-淀粉酶为裂解淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。一般来讲，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式裂解淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键从而生成含有三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖的内切作用酶。相反地，外切淀粉分解酶如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原端裂解多糖分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)和产物特异性淀粉酶如麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.60)和麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98)可产生特定长度的麦芽低聚糖。一些细菌α-淀粉酶主要从淀粉和相关的α-1,4-葡聚糖产生麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)或麦芽六糖(G6)，而大多数α-淀粉酶进一步将它们转化为葡萄糖和/或麦芽糖作为最终产物。
如本文所用，术语“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C6H10O5)x(其中X可以是任何数字)的直链淀粉和支链 淀粉构成。该术语包括植物基材料，如谷物、草、块茎和根，并且更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、裸麦、大米、高梁、糠、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯获得的材料。
关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。
关于多肽的术语“变体”是指不同于特定野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽，因为它在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份从上下文来看将是显而易见的。
当结合对象细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表明对象已通过引入异源核酸或蛋白质、或者变更天然的核酸或蛋白质而得到改性，或者细胞衍生自已经过此类改性的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中发现的基因，或者以不同的水平或在不同于自然界中存在的条件下表达天然基因。
如本文所用，“可组合突变”是可用于制备组合变体的任何氨基酸位置处的突变。可组合突变改善分子(在这种情况下，为淀粉酶)的至少一种所需特性，而未明显降低表达、活性或稳定性。可组合突变可分组如下：
组A：产生这样的变体的突变：其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)在pH 8(16℃、32℃或50℃)或pH10(16℃或50℃)下的CS-28微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI。
组B：产生这样的变体的突变：其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)在pH 8(16℃、32℃或50℃)或pH10(16℃或50℃)下的CS-28微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能 指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI。
组C：产生这样的变体的突变：其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)在pH 8(16℃、32℃或50℃)或pH10(16℃或50℃)下的CS-28微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI。
可组合突变的特性汇总于下表中。
表A.每组可组合突变的性能特性
优选的可组合突变是在“有效位置”，如下所述。就本发明淀粉酶而言，“活性”是指淀粉酶活性，其可如本文所述进行测量。
如本文所用，“有效位置”是耐受用不同氨基酸残基进行置换的氨基酸位置，其中所得的变体符合上文所列出的一组可组合性性能标准。有效位置可以赋给如下有效性得分(Productivity Score)：
1.其中给定位置处小于15％的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“1”。
2.其中给定位置处小于40％但大于或等于15％的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“2”。
3.其中给定位置处小于75％但大于或等于40％的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“3”。
4.其中给定位置处75％或更多的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“4”。
优选的有效位置为可组合突变。
如本文所用，“适宜性得分”是指根据突变每一者所落入的可组合性性能标准(即，上文所列出的A、B和C)，一个或多个可组合突变用于产生组合变体的能力。较高的适宜性得分指示更适合用于产生组合变体的突变。适宜性得分在下表中描述。
表B.适宜性得分的定义
在如下组中出现置换： 适宜性得分
A、B和C +++++
A和B ++++
A或(B和C) +++
B ++
C +
术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指从如在自然界中发现的那样与其天然相关的至少一种其他物质或组分中移除的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定的物质或组分。
如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的物质(如，分离的多肽或多核苷酸)，所述相对纯的状态如至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或甚至至少约99％纯。
在氧化环境、螯合剂的存在下、洗涤剂的存在下、暴露于高温、和/或暴露于pH极值的上下文中，术语“增强的稳定性”或“提高的稳定性”是指与另一种(即，参考)淀粉酶相比，对象淀粉酶随时间推移保持较高的淀粉分解活性。
结合酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于高温后保持活性的能力。酶(如淀粉酶)的热稳定性是由其半衰期(t1/2)度量的，所述半衰期以分钟、小时或天为单位给出，在此期间酶活性在限定的条件下损失一半。半衰期可通过测量暴露于(即，经受)高温后残余的淀粉酶活性来计算。
如本文所用，表述“在含有蛋白酶的商业衣物洗涤剂组合物的存在下基本上100％稳定”或相似的用语是指至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、和最多至100％的稳定性。可参照该稳定性特性来指定这些值中的每一个和任何一个。
关于酶的“pH范围”是指酶显示出催化活性的pH值范围。
如本文所用，结合酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及在预定的时间段(如，15分钟、30分钟、1小时)内、酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、”蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用常规的氨基酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向(即，N→C)提供。
术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向给出。
所谓“同源物”，应当指与对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有某种程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与对象序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％相同的氨基酸序列，序列比对使用熟知的具有默认参数的序列比对工具Clustal V进行。通常，除非另外指明，否则同源物将包括与对象氨基酸序列相同的活性位点残基。
如本文所用，“杂交”是指核酸碱基对的一条链与互补链在印迹杂交技术和PCR技术期间所发生的过程。严格的杂交条件如下所示：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。
如本文所用，“合成”分子通过体外化学合成或酶促合成而生成、而非由生物体生成。
如本文所用，结合细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指包含整合到其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(如，异源)核酸序列的细胞。
在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主菌株”或“宿主细胞”为已经将表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码所关注的多肽(如，淀粉酶)的多核苷酸引入其中的生物体。示例性的宿主菌株为细菌细胞。术语“宿主细胞”包括由细胞形成的原生质体，例如芽孢杆菌属物种的原生质体。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
如本文所用，术语“表达”是指基于核酸序列生成多肽的过程。该过程包括转录和翻译二者。
“选择性标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。可选标记的例子包括(但不限于)抗微生物剂(如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。
“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等等。
“表达载体”是指包含编码所关注多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列有效连接至能够实现DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA上核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的增强子和序列。
术语“有效连接”意指特定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，如果编码序列的表达受调控序列的控制，则调控序列有效连接至编码序列。
“信号序列”是连接至蛋白质的N-端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质细胞外分泌。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。
如本文所用，“生物活性”是指具有特定生物活性(例如酶活性)的序列。
“水硬度”是对存在于水中的矿物质(如，钙和镁)的量度。
如本文所用，“样片”是其上施有污渍的一块材料，例如织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制成的织物。该样片还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬质材料，如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、颜料、油或这些化合物的混合物。
如本文所用，“小样片”是自样片上用打孔装置(如，定制的96孔打孔装置)切下的部分，其中多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配，或者是以其他方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织物、纸、金属或其他合适的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔微量滴定板孔之前或之后具有固着的污渍。“小样片”也可以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样片可以是直径为5/8英寸或0.25英寸的一块施有污渍的织物。定制的打孔器以使得其同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中的方式设计。该装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而向每孔递送不止一个样片。可以设想将多孔打孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送多个样片。在另一个可设想的方法中，染污的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷或另一合适材料制成的、被污物载污体包覆的珠。然后将一个或多个包覆的珠置于含有合适缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。
如本文所用，“包含α-淀粉酶多肽的培养细胞材料”或者类似的用语是指包含α-淀粉酶多肽作为组分的细胞裂解液或上清液(包含培养基)。细胞材料优选地来自在出于产生α-淀粉酶多肽的目的的培养物中生长的异源宿主。
本文引用的所有参考文献明确地以引用方式并入。
2. 淀粉酶多肽和核酸
来自芽孢杆菌属物种菌株TS-23(即，AmyTS23)的α-淀粉酶的成熟形式具有如下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1：
NTAPINETMM QYFEWDLPND GTLWTKVKNE AANLSSLGIT ALWLPPAYKG 50
TSQSDVGYGV YDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TKTQYIQAIQ AAKAAGMQVY 100
ADVVFNHKAG ADGTEFVDAV EVDPSNRNQE TSGTYQIQAW TKFDFPGRGN 150
TYSSFKWRWY HFDGTDWDES RKLNRIYKFR STGKAWDWEV DTENGNYDYL 200
MFADLDMDHP EVVTELKNWG TWYVNTTNID GFRLDAVKHI KYSFFPDWLT 250
YVRNQTGKNL FAVGEFWSYD VNKLHNYITK TNGSMSLFDA PLHNNFYTAS 300
KSSGYFDMRY LLNNTLMKDQ PSLAVTLVDN HDTQPGQSLQ SWVEPWFKPL 350
AYAFILTRQE GYPCVFYGDY YGIPKYNIPG LKSKIDPLLI ARRDYAYGTQ 400
RDYIDHQDII GWTREGIDTK PNSGLAALIT DGPGGSKWMY VGKKHAGKVF 450
YDLTGNRSDT VTINADGWGE FKVNGGSVSI WVAKTSNVTF TVNNATTTSG 500
QNVYVVANIP ELGNWNTANA IKMNPSSYPT WKATIALPQG KAIEFKFIKK 550
DQAGNVIWES TSNRTYTVPF SSTGSYTASW NVP 583
来自芽孢杆菌属物种菌株TS-23(即，AmyTS23t或BASE)的成熟α-淀粉酶的酶活性C-端截短形式具有如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ
SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN
HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
YHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEV
VTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGE
FWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMK
DQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY
GIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSG
LAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGS
VSIWVAK
芽孢杆菌属物种菌株TS-23的变体如在国际专利申请WO 2009/100102、WO 2009/061380和WO 2010/115028中已经有所描述。本发明的组合物和方法涉及芽孢杆菌属物种菌株TS-23的另外变体，其满足本文所述的各种标准。优选的突变为在有效位置的可组合置换，其中存在于亲本淀粉酶中的氨基酸残基(即，“野生型”残基)被不同的氨基酸残基替换。具体的置换列于表C和D中。
表C.在有效位置的可组合置换
氨基酸位置 置换
|
12 Y,D,H,Q,T,G,S
13 F,Y,S
20 D,N
[0172] 23 L,A,E,F,G,M,N,S,T,W,Y,Q
27 V,E,G,N,S,T,Q
31 A,G,H,N,P,T,Y,Q,S
33 N,D,G,P
34 L,H,N,Q
40 T,R
41 A,D,Q,R,S
43 W,Y
44 L,T
48 Y,Q,T
63 L,V,E,M,S
64 Y,T,S
66 L,I
68 E,D,N
74 T,L,W
79 Y,H,W
81 T,H
88 A,S
89 I,M,V,A
92 A,G
96 G,A,C,E,K
97 M,F,V
106 N,D
109 A,E,T
117 V,E,Q,P,W,A,S
120 V,A,N
122 V,C
133 G,N,D,P,E,H
139 A,P
146 P,A
173 L,Q,W
180 R,I,M,V,A,D,K,N,Q,T,C,G,W
181 S,A,G,C,D,H,M,P,Q,T
194 N,F,H
209 H,E,Y,A,C,W,M,N,Q,R
212 V,P
213 V,T,P
215 E,H
218 N,S
223 Y,F,L,S
224 V,K,R,Q
225 N,D
226 T,A,H,N,Q
229 I,V,S
232 F,W
242 Y,F
243 S,D,Q,A
[0173] 244 F,H,V,N,S,L,M,T
245 F,N,S,V,A,M,Q,T
249 L,Q
251 Y,H,M,Q,R,S,P
252 V,L
253 R,K,T,H
256 T,N,D,Q,R,Y
258 K,Q,C,N
260 L,M,R
262 A,G,M
271 V,Y,I,P,R,S,M,T,A,D,G,W,H,Q
282 N,D,L,M,E
285 M,Q,T,V,I,A
286 S,D,H,Q,T,N,R
287 L,I
294 N,R,E
295 N,R
302 S,E,K,Q,T,L,D
304 G,N,Q
312 L,I,K,M,Q,R,S,T
313 N,R,K,T
321 P,N,R,T,A
326 T,S
327 L,I,M
331 H,Q,C,G,T,V
335 P,D,G,H,I,L,M,N,Q,T,K
341 S,D,R,Q,E,H,N
342 W,Q,L,S
345 P,D
346 W,A,F
349 P,Q,T
350 L,I,M,S,Q
353 A,S
354 F,H,L,M,G,T
355 I,T
357 T,A
358 R,H
360 E,A,Q,S,F
362 Y,A,I,S,D,H,K,T,R,E
364 C,A,D,H,S,T,Q,M
366 F,D
367 Y,E,H,Q,F
371 Y,A,H,N,T,R
378 I,A,H,M,N,S
380 G,D,E,N,P,Q,R,K
383 S,I,R,T,L
384 K,Y
[0174] 385 I,L,M
386 D,Q
387 P,A,R,T
391 A,S
395 Y,F,H,N,Q,R
396 A,G,S
400 Q,E,H,N
404 I,E,S
405 D,S
406 H,D
410 I,A
413 T,S,A
415 E,D
417 I,D,E,G,K,L,M,Q,S,T,V,Y
418 D,H,Q,S,A,G
420 K,F,H,L,N,Q,R,S,Y,A
421 P,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,T,W,Y
422 N,A,C,D,H,I,L,Q,R,S,T,W,Y
423 S,A,D
424 G,S
425 L,A,F,I,T,V,Y
427 A,G,T
429 I,E,T
430 T,D
434 G,H,I,K,N,T,V,A,Q
435 G,C,M,T
440 Y,C,E,F,H,L,P,Q,S,T,W,D,G,N,R
442 G,D
443 K,A,C,D,E,F,G,H,Q,R,S,T,W,Y
449 V,A,C,D,E,G,H,K,M,P,T,Y,\Q
454 T,A,Q
455 G,A,D,K,N,S
456 N,T,H
457 R,A,L,Q,T,W
458 S,A,D,F,K,Q,T,V,W,L
460 T,A,E,I,L,P,Q
461 V,A,H,Q,T
462 T,D,K,P,R,V
463 I,A,M,V,S
464 N,D,G,H,K,L,M,TA
466 D,E,Q,S,T
468 W,A,C,F,G,H,L,M,N,Q,R,T,Y
469 G,A,S
471 F,M,Y
472 K,A,I,R,T,D
474 N,A,D,E,F,I,K,M,S,L,T
476 G,A,N,P,Q,S,T,V,Y
[0175] 477 S,H,K,R
478 V,C,L,M,W,N,Q,S,T,A,I
479 S,A,G,T,C
482 V,L,H
表D.在有效位置的可组合置换
氨基酸位置 置换
15 H
25 G
50 D
59 C,K
107 C,S
140 K
162 M
165 F
166 C,G,H,P,Q
177 H
179 I
203 K,N,D,Q
236 E
337 P,V,Y
339 C,F,S,T
484 Q,S
在一些实施例中，本发明的变体淀粉酶包括列于表C和/或表D中的置换的一种或多种。在一些实施例中，本发明的变体淀粉酶包括列于表C和/或表D中的置换的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种或更多种。
在一些实施例中，本发明的淀粉酶为芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的变体，该淀粉酶与SEQ ID NO:1具有限定程度的氨基酸序列同源性/同一性，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同源性/同一性。
在一些实施例中，本发明的淀粉酶为具有C端截短的芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的变体，如SEQ ID NO:2的氨基酸序列所例示，并且与SEQ ID NO:2具有限定程度的氨基酸序列同源性/同一性，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％氨基酸序列同源性/同一性。
除了本文所述的突变之外，本发明的淀粉酶还可包括一种或多种之前描述的突变。之前描述的突变是已知在至少一种与芽孢杆菌属淀粉酶具有相似折叠和/或具有60％或更高的氨基酸序列同一性的淀粉酶中，或者在至今已被称为“Termamyl样”的任何淀粉酶中赋予有益特性的突变。
此外，本发明的淀粉酶可包括在未特异性突变的位置处的任何数量的保守性氨基酸置换。示例性的保守性氨基酸置换在表E中列出。
表E.保守性氨基酸置换
本发明的淀粉酶可为“前体”、“不成熟的”或”全长的”，在该情况下它们包括信号序列，或“成熟的”，在该情况下它们缺少信号序列。多肽的成熟形式通常是最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号方式是指各淀粉酶多肽的成熟形式。本发明的淀粉酶多肽还可被截短以除去N或C端(如SEQ ID NO:2所例示)，只要所得的多肽保持淀粉酶活性即可。
本发明的淀粉酶可为“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括第一淀粉酶多肽的至少一部分和第二淀粉酶多肽的至少一部分(这种嵌合淀粉酶最近已被“重新发现”为结构域交换淀粉酶)。本发明淀粉酶可还包括异源信号序列、使得能跟踪或纯化的表位等等。示例性的异源信号序列来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)和链霉菌(Streptomyces)CelA。
在另一个方面，提供编码任何所述淀粉酶多肽的核酸。该核酸可编码特定的淀粉酶多肽或与该特定淀粉酶具有指定程度的氨基酸序列同一性的淀粉酶。在一个例子中，核酸编码与参考淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％同源性/同一性的淀粉酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可编码相同的多肽。
核酸还可与编码α-淀粉酶多肽的示例性多核苷酸具有指定程度的同源性。例如，核酸可与示例性序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％核苷酸序列同一性。又如，核酸在严格或非常严格的条件下与示例性序列杂交。这样的条件在此有所描述，但也是本领域中众所周知的。实际上，在一些实施例中，亲本酶由核酸序列编码，该核酸序列在严格或非常严格的条件下与编码芽孢杆菌属物种菌株TS-23淀粉酶的如SEQ ID NO:1或2所例示的核酸杂交。
核酸可编码“全长”(“fl”或“F“”)淀粉酶(包括信号序列)、仅淀粉酶的成熟形式(缺少信号序列)或淀粉酶的截短形式(缺少成熟形式的N端或C端)。
编码α-淀粉酶的核酸可在适于在宿主细胞中表达α-淀粉酶的载体中与各种启动子和调节子有效连接。示例性启动子来自地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(AmyE或AprE)和链霉菌CelA。这种核酸还可与其他编码序列连接，例如用以编码嵌合多肽。
3. 生产和纯化蛋白质的方法
本发明组合物和方法的一个方面为淀粉酶可被表达为分泌的多肽。生产和纯化从芽孢杆菌分泌到培养基中的蛋白质的方法是本领域已知的，用于生产淀粉酶的合适宿主细胞也是如此。用于生产淀粉酶的示例性方法在下文中公开。
3.1 用于生产淀粉酶的材料和方法
使用通常将包括控制序列的表达载体来表达多肽，该控制序列包括合适的启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号，并且任选地包括阻遏基因或多个激活基因。大量的载体可商购获得，以用于重组DNA方法，并且载体的选择通常将取决于它即将引入其中的宿主细胞。该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当其被引入分离的宿主细胞中时被整合进宿主细胞 基因组中并与整合其的染色体一起复制的载体。通过使用由抗生素选择或其他选择压力(如必需的调节基因)驱动的或由对必需代谢途径基因剂量效应的补充而驱动的可扩增构建体，也可以扩增该整合的基因以产生染色体中该基因的多个拷贝。
在载体中，DNA序列应有效连接到合适的启动子序列。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于引导编码淀粉酶的DNA序列的转录，尤其是在细菌宿主中的转录的示例性启动子为大肠杆菌(E.coli)乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，可用的启动子的例子为那些衍生自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码淀粉酶的基因时，可以例如从噬菌体启动子选择合适的启动子，该噬菌体启动子包括T7启动子和λ噬菌体启动子。适用于在酵母物种中表达的启动子的例子包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorisor)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中的表达，可使用CBHII(纤维二糖水解酶II)启动子。
表达载体也可包含与编码α-淀粉酶的DNA序列有效连接的合适转录终止子以及在真核生物中的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。
载体还可包含使得载体能在宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体还可包含可选标记，如其产物能补足分离的宿主细胞中的缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包含曲霉属(Aspergillus)选择标记，如amdS、argB、niaD和xxsC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过例如本领域已知的共转化实现选择。参见例如PCT国际专利申请WO 91/17243。
如上文所述，虽然细胞内表达或固态发酵在一些方面可为有利的，例如当将某些细菌或真菌用作宿主细胞时，但是所述组合物和方法的一个方面设想了将α-淀粉酶表达入培养基。
通常，“全长的”、“成熟的”或“前体”淀粉酶包括在氨基末端的信号序列，其允许分泌到培养基中。如果需要，该信号肽可被不同序列取代，这可通过编码相应信号多肽的DNA序列的置换而方便地实现。
表达载体通常包含克隆载体的组分，例如，在选择的宿主生物中允许载体自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测标记。表达载体通常包含例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选的阻遏基因或一个或多个激活基因的控制核苷酸序列。另外，表达载体可包含编码能够将淀粉酶靶向至宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)、或靶向至特定宿主细胞区室的氨基酸序列的序列。这种靶向序列包括但不限于序列SKL。对于在控制序列引导下的表达，淀粉酶的核酸序列以就表达而言正确的方式与控制序列有效连接。
用于分别连接编码淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的操作，和用于将它们插入含有复制必需信息的合适载体的操作是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook et al.,MOLECULAR,CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd ed.,Cold Spring Harbor,1989,and3rd ed.,2001(Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，1989年，以及第3版，2001年))。
包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地在淀粉酶的重组生产中用作宿主细胞。可用编码酶的DNA构建体，方便地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合进宿主染色体中来转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更有可能在细胞中稳定地维持。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体整合进宿主染色体中。 作为另外一种选择，可用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体对细胞进行转化。
合适的细菌宿主生物体的例子为革兰氏阳性细菌物种，如芽孢杆菌科(Bacillaceae)(包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(之前称为嗜热脂肪芽孢杆菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；链霉菌物种，例如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸菌物种，包括乳球菌属(Lactococcus)物种如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属(Lactobacillus)物种，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属(Leuconostoc)物种；片球菌属(Pediococcus)物种；以及链球菌属(Streptococcus)物种。备选地，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。
可从生物工艺学相关的酵母物种中选择合适的酵母宿主生物，所述酵母物种例如但不限于如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)，或者克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、Yarrowinia、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种的酵母物种或酵母属(Saccharomyces)的物种(包括酿酒酵母)，或属于裂殖酵母属的物种例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中合适的宿主生物包括曲霉属的物种，如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。备选地，镰孢菌属(Fusarium)物种的菌株，如尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)，或者根毛霉属(Rhizomucor)物种的菌株，例如米赫根毛霉可用作宿主生物。其他合适的菌株包括嗜热真菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。另外，里氏木霉可用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的合适方法包括(例如)在EP 238023中所述的。
在又一个方面，提供生产α-淀粉酶的方法，该方法包括在有利于酶生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基回收酶。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于培养所考虑的宿主细胞和获得淀粉酶表达的常规培养基。合适的培养基和培养基组分可获自商业供应商或可根据公布的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述的配方)制备。
在一个方面，从宿主细胞分泌的酶用于全发酵液制备。在本发明的方法中，使用任何本领域已知的导致α-淀粉酶表达的培养方法，可实现要消耗的重组微生物全发酵液的制备。因此，可将发酵理解为包括在合适培养基中以及在允许淀粉酶表达或分离的条件下进行的在实验室中的摇瓶培养、或在工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。术语“要消耗的全发酵液”在本文中被定义为发酵材料的未分级内容物，包括培养基、细胞外蛋白质(例如酶)和细胞生物质。应当理解，术语“要消耗的全发酵液”还涵盖了已使用本领域中熟知的方法使其裂解或具有渗透性的细胞生物质。
可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的酶，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，以及借助于诸如硫酸铵之类的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和色谱等之类的色谱方法。
一个方面构思了载体中的多核苷酸有效连接到能够通过宿主细胞提供编码序列的表达的控制序列，即载体为表达载体。控制序列可例如通过添加其他转录调控元件进行修饰，从而使控制序列所引导的转录水平对转录调节因子的响应更灵敏。控制序列尤其可包含启动子。
可在允许淀粉酶表达的合适条件下培养宿主细胞。酶的表达可以是组成型的，使得它们可以连续生产；或可以是诱导型的，从而需要刺激物来引发表达。在诱导型表达的情况下，例如，可以在需要时通过向培养基中添加诱导物质(例如地塞米松或IPTG或Sopharose)来引发蛋白质产生。也可以在体外无细胞体系(如TNTTM(Promega)兔网织红细胞体系)中重组生产多肽。
表达淀粉酶的宿主也可在适合该宿主的培养基中、在有氧条件下进行培养。可提供振荡或者搅拌和通风的组合，在适合该宿主的温度例如约25℃至约75℃(例如30℃至45℃)下进行生产，这取决于宿主的需要以及生产所需淀粉酶的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任 何时间值，如24至72小时)。通常，培养发酵液的pH为约5.5至约8.0，这也取决于与淀粉酶的生产相关的宿主所需的培养条件。
3.2 用于蛋白质纯化的材料和方法
发酵、分离和浓缩技术是本领域中熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的含淀粉酶多肽溶液。
发酵后，获得发酵液，并通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物(包括残留的发酵原料)以获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、转鼓真空过滤、超滤、离心、随后进行的超滤、提取或层析法等。
可取的是浓缩含α-淀粉酶多肽溶液以便优化回收率。使用未浓缩的溶液需要增加温育时间以便收集纯化的酶沉淀。
使用常规的浓缩技术浓缩含酶溶液直到获得所需的酶含量。可通过任何本文论述的技术实现含酶溶液的浓缩。纯化的示例性方法包括但不限于旋转式真空过滤和/或超滤。
将酶溶液浓缩成浓缩酶溶液直至该浓缩的含淀粉酶多肽溶液的酶活性处于所需的水平。
可使用例如沉淀剂(例如金属卤化物沉淀剂)进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。示例性的金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。
金属卤化物沉淀剂以能有效沉淀α-淀粉酶多肽的量使用。在常规测试后选择能有效引起酶沉淀的金属卤化物的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件(包括温育时间、pH、温度和酶浓度)，对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。
一般而言，向浓缩的酶溶液添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，通常是至少8％w/v。一般而言，向浓缩的酶溶液添加不超过约25％w/v的金属卤化物，通常是不超过约20％w/v。除了其他方面，金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于具体淀粉酶多肽的性质以及其在浓缩的酶溶液中的浓度。
影响酶沉淀的另一个选择方案是使用有机化合物。示例性的有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可相继进行或同时进行。
通常，有机沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠或钾盐)和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基基团含有1至12个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂可以是(例如)4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基基团含有1至10个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。示例性的有机化合物为4-羟基苯甲酸的直链烷基酯(其中烷基基团含有1至6个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲酯、4-羟基苯甲酸的丙酯、4-羟基苯甲酸的丁酯、4-羟基苯甲酸的乙酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(名为对羟基苯甲酸甲酯)和4-羟基苯甲酸丙酯(名为对羟基苯甲酸丙酯)，它们也都是淀粉酶防腐剂。有关进一步的描述，参见例如美国专利No.5,281,526。
就pH、温度、淀粉酶多肽浓度、沉淀剂浓度和温育时间而言，添加有机化合物沉淀剂提供了沉淀条件高度灵活性的优势。
有机化合物沉淀剂以能通过金属卤化物沉淀剂有效地改善酶沉淀的量使用。按照本公开，在常规测试后选择有机化合物沉淀剂的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件(包括温育时间、pH、温度和酶浓度)，对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。
一般而言，向浓缩酶溶液添加至少约0.01％ w/v的有机化合物沉淀剂，通常是至少约0.02％ w/v。一般而言，向浓缩酶溶液添加不超过约0.3％ w/v的有机化合物沉淀剂，通常是不超过约0.2％ w/v。
可以调节含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩多肽溶液的pH，该pH将必然取决于待纯化的酶。通常，将pH调节至淀粉酶等电点附近的水平。可将pH在低于等电点(pI)约2.5 pH单位至高于等电点约2.5 pH单位的pH范围内调节。
获得纯化的酶沉淀物所需的温育时间取决于具体酶的性质、酶浓度以及具体沉淀剂及其浓度。一般而言，能有效沉淀酶的时间在约1至约30小时之间；通常不超过约25小时。在存在有机化合物沉淀剂的情况下，温育时间还可以减至低于约10小时，在大多数情况下甚至是约6小时。
一般来讲，温育期间的温度在约4℃和约50℃之间。通常在约10℃和约45℃之间(如，在约20℃和约40℃之间)的温度下进行该方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用的沉淀剂而变化。
通过搅拌包含酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液来改善纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的温育期期间进行搅拌步骤。合适的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强力通风或任何类似的技术。
在温育期后，将已纯化的酶与解离的颜料和其他杂质分离，并通过常规分离技术(诸如过滤、离心、微滤、旋转式真空过滤、超滤、压滤、跨膜微滤、错流膜微滤等)进行收集。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进一步纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水、或者用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物。
在发酵过程中，α-淀粉酶多肽集聚在培养发酵液中。对于所需淀粉酶的分离和纯化，对培养液进行离心或过滤以除去细胞，并且将所得的无细胞液体用于酶纯化。在一个实施例中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞的培养液进行盐析；然后将70％饱和度沉淀的级分溶解于缓冲液中，再施加到诸如Sephadex G-100柱之类的柱上，然后洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱之类的常规方法。
纯化后的酶可用于衣物洗涤和清洁应用。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和去渍剂中。可以将它们制成液体(溶液、浆液)或固体(颗粒、粉末)形式的终产品。
纯化的更具体的例子在Sumitani,J.et al.(2000)“New type of starch-binding domain:the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.195α-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading,”Biochem.J.350:477-484(Sumitani,J.等人，2000年，“新型淀粉结合域：芽孢杆菌属物种195号α-淀粉酶的C端区域中的同向重复基序有助于淀粉结合和生淀粉降解”，《生物化学杂志》，第350卷，第477-484页)中有所描述并 在这里进行简要概括。用80％饱和度的(NH4)2SO4处理从4升变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24培养上清液获得的酶。通过在10,000×g下(20分钟和4℃)离心而回收沉淀物，并且将其重新溶解在含有5mMCaCl2的20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)中。然后用相同的缓冲液对溶解的沉淀进行透析。然后将透析过的样品施加到先前已用含5mM CaCl2的20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)平衡的Sephacryl S-200柱上，然后用相同缓冲液以7mL/h的线性流速洗脱。收集来自柱的级分，然后评估其按酶活性测定和SDS-PAGE判断的活性。按如下方式进一步纯化蛋白质。Toyopearl HW55柱(宾夕法尼亚州蒙哥马利市东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)；Cat.编号19812)用含5mM CaCl2和1.5M(NH4)2SO4的20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)平衡。用含5mM CaCl2的20mM Tris/HCL缓冲液(pH7.0)中线性梯度为1.5至0M的(NH4)2SO4洗脱酶。收集活性级分，并且用80％饱和度的(NH4)2SO4使酶沉淀。如上所述对沉淀物进行回收、重新溶解和透析。然后将透析后的样品施加到Mono Q HR5/5柱(安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia)；Cat.编号17-5167-01)，该柱先前已用含5mM CaCl2的20mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)以60mL/h的流速进行了平衡。收集活性级分，并将其添加到1.5M(NH4)2SO4溶液中。使活性酶级分如前所述在Toyopearl HW55柱上重新层析，得到如通过SDS-PAGE确定的均质酶。参见Sumitani,J.et al.(2000)Biochem.J.350:477-484(J.Sumitani等人，2000年，《生物化学杂志》，第350卷，第477-484页)，了解其方法和变化的一般讨论。
对于工厂规模的回收，可如上一般地描述通过用聚合物絮凝除去细胞而对淀粉酶多肽进行部分纯化。作为另外一种选择，可使用可用的膜和设备通过微滤、接下来通过超滤进行浓缩而对酶进行纯化。然而，对于某些应用，无需对酶进行纯化，并且无需进一步处理即可对整个肉汤培养物进行溶解和使用。然后可将酶加工成(例如)颗粒。
4.清洁组合物
本发明组合物和方法的一个方面为包含淀粉酶多肽作为组分的清洁组合物。淀粉酶多肽可用作用于洗手、衣物洗涤、盘碟洗涤和其他硬质表面清洁的洗涤剂组合物中的组分。优选地，将淀粉酶多肽掺入到洗涤剂中，其浓度在方便洗涤剂中淀粉酶使用的浓度处或附近。例如，淀粉酶多肽可 以对应于每升洗涤液/盘碟洗涤液0.00001–1mg(按纯酶蛋白质计算)淀粉酶的量添加。本文提供示例性制剂，如下所示出：
4.1 衣物洗涤剂组合物
淀粉酶多肽可作为唯一的酶或者与其他酶(包括其他淀粉分解酶)一起成为洗涤剂组合物的组分。照此，其可以以无粉尘颗粒、稳定化液体或受保护的酶的形式被包含在洗涤剂组合物中。可以例如，如美国专利No.4,106,991和No.4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子为聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)，其平均摩尔量为1,000至20,000；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。例如，GB 1483591给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制备物。其他的酶稳定剂是本领域知道的。可根据例如EP 238 216中公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，以及用于改善蛋白质的溶解性。
洗涤剂组合物可为任何可用形式，如作为粉末、颗粒剂、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。它也可为仅含约30％水的紧致凝胶类型形式。
洗涤剂组合物可包括一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂通常将含有0％至约50％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。所述组合物也可含有0％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。
洗涤剂组合物可另外包含一种或多种其他酶，如脂肪酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶的任何组合。
洗涤剂可含有约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶的稳定性相容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包封形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害的组分影响。酶、具体地讲淀粉酶(具有或不具有淀粉结合域)可在包括衣物洗涤和盘碟洗涤应用、表面清洁剂的多种组合物中使用，以及在用于从淀粉或生物质生成乙醇的组合物中使用。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可含有漂白系统，其可包含可与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用的H2O2来源(如过硼酸盐或过碳酸盐)。或者，漂白系统可包含过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可为酶漂白系统，例如过水解酶，例如在美国专利文件US2008145353、US7754460、US7951566、US7723083、和US8062875中所描述的那些。
可使用常规的稳定剂，例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳香硼酸酯)稳定洗涤剂组合物的酶；并且可如例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。
洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或香料。
pH(在使用浓度下于水溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。
包含α-淀粉酶的洗涤剂组合物可以配制成具体形式，包括：
1)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约7％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如，C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例 如，C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约2至约6％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约15％至约22％的沸石(例如，NaA1SiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0至3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001至0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；以及0至5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
2)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约6％至约11％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如，C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约24％至约34％的沸石(例如NaA1SiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1至6％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料)。
3)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约5％至约9％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO)；约1至约3％的脂肪酸皂(例如，C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约23％至约33％的沸石(如NaA1SiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如，EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0 至3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
4)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约8％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约25％至约35％的沸石(例如，NaA1SiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1至3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料)。
5)一种含水液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的脂肪酸皂(例如，油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如，PVP、PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
6)一种含水结构化液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3至9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约10％的脂肪酸皂(例如，油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaA1SiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，PEG、PVP)；0％至约3％的锚定聚合物，例如，甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物(摩尔比25:1，分子量3800)；0％至约5％的甘油；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0 至5％的微量成分(例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
7)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0至3％的脂肪酸皂；约5％至约10％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约20％至约40％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，荧光增白剂、抑泡剂、香料)。
8)一种配制为颗粒的洗涤剂组合物，其包含约8％至约14％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的脂肪酸皂；约4％至约10％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约30％至约50％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如，C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如，PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，抑泡剂、香料)。
9)一种配制为颗粒的洗涤剂组合物，其包含约6％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子型表面活性剂；约2％至约6％的脂肪酸皂；约14％至约22％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如，C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如，NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活化剂(例如，NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸酯或PEG)；0.0001至0.1％的酶(按纯 酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，荧光增白剂、香料)。
10)一种含水液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约23％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；0％至约3％的脂肪酸皂(例如，月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的水溶助长剂(例如，甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
11)一种含水液体洗涤剂组合物，其包含约20％至约32％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6至12％的醇乙氧基化物(例如，C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如，B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物诸如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，水溶助长剂、分散剂、香料、荧光增白剂)。
12)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子型表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；约5％至约15％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；0％至约5％的硫酸钠(例如，Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaA1SiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例如，NaBO3.4H2O)；约0％至约5％的漂白活化剂(TAED或NOBS)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0至3％的微量成分(例如，香料、荧光增白剂)。
13)如上述组合物1)-12)中所述的洗涤剂组合物，其中所述直链烷基苯磺酸盐中的所有或部分被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
14)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如，NaA1SiO4)；约10％至约20％的层状二硅酸盐(例如，来自赫斯特(Hoechst)的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如，Na2CO3)；0％至约6％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸系和PVP)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至5％的微量成分(例如，荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
15)一种配制为堆密度为至少600g/L的颗粒的洗涤剂组合物，其包含约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶硅酸盐(例如，Na2O、2SiO2)；约13％至约22％的过碳酸钠；1至8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，聚羧酸系和PVP)；0.0001至0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；以及0至3％的微量成分(例如，荧光增白剂、膦酸盐、香料)。
16)如上面1)-15)中所述的洗涤剂制剂，其含有稳定化的或包封的过酸作为额外组分或作为已经述及的漂白系统的替代物。
17)如上面1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
18)如上面1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤剂组合物，还额外含有锰催化剂。例如锰催化剂是“Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching,”Nature369:637-639(1994)(“用于低温漂白的有效锰催化剂”，《自然》，第369卷，第637-639页，1994年)中描述的化合物中的一种。
19)配制为非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，其包含液态非离子型表面活性剂，如直链烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂还可包含阴离子型表面活性剂和/或漂白系统。
可以洗涤剂中常规采用的浓度掺入淀粉酶多肽。目前考虑的是，在洗涤剂组合物中，可以对应于每升洗涤液体0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)淀粉酶多肽的量添加酶。
在另一个实施例中，其他酶(例如2,6-β-D-果聚糖水解酶)可掺入到包含α-淀粉酶多肽的洗涤剂组合物中，并且用于家居和/或工业纺织物/要洗的衣物上存在的生物膜的除去/清洁。
例如，可以将洗涤剂组合物配制成手洗(人工)或机洗(自动)的衣物洗涤剂组合物，包含适于预处理玷污的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者可配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制以用于人工或自动的盘碟洗涤操作。
在一个具体的方面，洗涤剂组合物可包含除了α-淀粉酶多肽外的2,6-β-D-果聚糖水解酶，以及一种或多种其他清洁酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶，另一种淀粉分解酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶、芳基酯酶、过水解酶和/或过氧化物酶，和/或它们的组合。
通常，所选酶的特性应与所选的洗涤剂相容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等)，且所述酶应以有效量存在。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物起源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体，以及天然制成的蛋白质。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛起源)和镰孢菌属蛋白酶(参见例如WO 89/06270和WO 94/25583)。可用的蛋白酶的例子也包括但不限于WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体。可商购获得的蛋 白酶包括但不限于：DURALASETM、KANNASETM和BLAZETM(诺和诺德公司和诺维信公司)；MAXACALTM、MAXAPEMTM、 PURAFECT OXPTM、FN2TM和FN3TM(美国丹尼斯科公司)。其他示例性的蛋白酶包括来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)的NprE和来自纤维单胞菌属(Cellulomonas)物种菌株69B4的ASP。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰、蛋白分解改性或蛋白质工程改造的突变体。可用的脂肪酶的例子包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(同义词为嗜热真菌属)的脂肪酶，例如来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)(参见例如EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如WO 96/13580)的脂肪酶；假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)的脂肪酶；参见例如EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、假单胞菌属物种菌株SD 705脂肪酶(参见例如WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)脂肪酶(参见例如WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶；参见例如Dartois et al.Biochemica et Biophysica Acta,1131:253-360(1993)(Dartois等人，《生物化学与生物物理学报》，第1131卷，第253-360页，1993年))、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的脂肪酶(参见例如JP 64/744992)、或短小芽孢杆菌(B.pumilus)的脂肪酶(参见例如WO 91/16422)。设想用于剂中的其他脂肪酶变体包括例如在如下专利中所述的那些：WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105。一些可商购获得的脂肪酶包括和LIPOLASE ULTRATM(诺和诺德公司和诺维信公司)。
聚酯酶：合适的聚酯酶可包含在组合物中，例如WO 01/34899和WO 01/14629中描述的那些。
淀粉酶：组合物可与其他淀粉酶(如非生产增强型淀粉酶)组合。这些淀粉酶可包括市售的淀粉酶，例如但不限于和BANTM(诺和诺德公司和诺维信公司)；和(来自美国丹尼斯科公司)。
纤维素酶：可向组合物添加纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属(Thielavia)、支顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如美国专利No.4,435,307、No.5,648,263、No.5,691,178、No.5,776,757、和WO 89/09259中公开的特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织物具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的例子为例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他例子为纤维素酶变体，例如WO 94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利No.5,457,046、5,686,593、和5,763,254中所述的那些。市售的纤维素酶包括和(诺和诺德公司和诺维信公司)；和(美国丹尼斯科公司)；和KAC-500(B)TM(花王公司(Kao Corporation))。
过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的合适过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。可用的过氧化物酶的例子包括WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶及其变体。市售的过氧化物酶包括例如GUARDZYMETM(诺和诺德公司和诺维信公司)。
可通过添加含有一种或多种酶的分开的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而在洗涤剂组合物中包含洗涤剂酶。洗涤添加剂(即，分开的添加剂或组合添加剂)可配制为例如颗粒、液体、浆液等。示例性的洗涤添加剂制剂包括但不限于颗粒(尤其是无粉尘颗粒)、液体(尤其是稳定的液体或浆液)。
可以例如，如美国专利No.4,106,991和No.4,661,452所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子是平均摩尔量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产品(如聚乙二醇(PEG))；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。例如，GB1483591给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的实例。可例如通过加入多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制备物。可根据EP 238,216中公开的方法来制备受保护的酶。
洗涤剂组合物可以是任何简便形式，如条棒状、小块、粉末、颗粒、糊状物或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。还考虑包含约30％或更少水的紧致洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型的。表面活性剂可以很宽的范围(约0.1重量％至约60重量％)存在。
当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸或皂。
当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自赫斯特(Hoechst)的SKS-6)。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。示例性的聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙 烯基吡啶-N-氧化物)、聚乙烯基咪唑、聚羧酸系(如聚丙烯酸系)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，该稳定剂例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如硼酸芳族酯)或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸)。可如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。
目前设想在洗涤剂组合物中，尤其是酶变体可以对应于每升洗涤液约0.01至约100mg酶蛋白(例如每升洗涤液约0.05至约5.0mg酶蛋白或每升洗涤液0.1至约1.0mg酶蛋白)的量添加。
4.2 清洁组合物
在洗涤剂应用中，α-淀粉酶多肽通常用于包含丙二醇的液体组合物中。酶溶于例如丙二醇中，通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中混合而使其溶解。
可将本文论述的α-淀粉酶多肽配制于用于清洁盘碟的洗涤剂组合物中或其他清洁组合物中。这些组合物可以是粉末、凝胶或液体。组合物可以只包含酶，或与其他淀粉分解酶和/或与其他清洁酶或漂白剂活化酶和其他组分共同用于清洁组合物。
因此，盘碟洗涤剂组合物可包含表面活性剂。表面活性剂可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合物。洗涤剂可含有0重量％至约90重量％的非离子型表面活性剂，如低泡沫至不起泡的乙氧基化丙氧基化直链醇。
洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助洗剂盐。洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助洗剂。当存在含磷的无机碱性洗涤剂助洗剂时，其例子包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。当存在含磷的有机碱性洗涤剂助洗剂时，其例子包括水溶性膦酸盐。当存在不含磷的无机助洗剂时，其例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。
合适有机助洗剂的例子包括碱金属、铵和取代铵、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧基甲氧基琥珀酸盐、聚乙酸铵、羧酸盐、聚羧酸盐、氨基聚羧酸盐、聚乙酰基羧酸盐和多羟基磺酸盐。
其他合适的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性质的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，以及它们的盐。
清洁组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型的漂白剂的例子是杂环N-溴酰亚胺类和N-氯酰亚胺类，例如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)形成的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。
清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选与漂白前体一起，或以过氧酸化合物的形式。合适的过氧漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物二者)、碱金属过碳酸盐、碱金属过硅酸盐和碱金属过磷酸盐。示例性活化剂材料为TAED和三乙酸甘油酯。酶漂白活化体系也可存在于制剂中，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(参见例如WO 2005/056783)。
可使用酶的常规稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂为例如多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。
清洁组合物也可包含其他常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充剂材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
虽然本发明的组合物和方法结合以下详情进行了描述，但应当理解可进行各种改变。
4.3 评估洗涤剂组合物中的淀粉酶活性的方法
许多淀粉酶清洁测定法是本领域已知的，包括样片测定法和微样片测定法。所附的实例仅仅描述了几个这类测定法。
下列带编号的段落进一步描述了本发明组合物和方法的方面和实施例：
1.在一个方面，提供变体α-淀粉酶多肽，其在有效氨基酸位置包含至少一个可组合突变；其中：(i)所述可组合突变为与亲本α-淀粉酶相比，改善了变体α-淀粉酶的至少一种所需特性，而与亲本α-淀粉酶相比，未显著降低变体α-淀粉酶的表达、活性或稳定性的 突变，(ii)所述有效位置为可用多个不同的氨基酸残基置换的氨基酸位置，所有这些置换导致符合(i)的要求的变体淀粉酶，并且(iii)所述可组合突变列在表C或表D中，其使用SEQ ID NO:2进行编号。
2.在段落1的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变具有表A中列出的性能特性。
3.在段落1的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些特性中的任一者，PI大于或等于1.0。
4.在段落1的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI。
5.在段落1的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变产生变体，其中关于(i)蛋白质表达、(ii)活性、(iii)微样片活性、和(iv)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于亲本淀粉酶的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI。
6.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为+++、++++或+++++。
7.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为++++或+++++。
8.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变的可持续性得分为+++++。
9.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，可组合突变的有效性得分为1或2。
10.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％氨基酸序列同一性。
11.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性。
12.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
13.在前述段落任一者的变体淀粉酶的一些实施例中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
14.在另一个方面，提供包含前述段落任一者的变体淀粉酶的组合物。
15.在段落14的组合物的一些实施例中，所述组合物可有效用于从衣物、盘碟或纺织物移除含淀粉污渍。
16.在一些实施例中，段落14或15的组合物还包含表面活性剂。
17.在一些实施例中，段落14-16任一者的组合物为洗涤剂组合物。
18.在一些实施例中，段落14-17任一者的组合物为衣物洗涤剂或衣物洗涤添加剂。
19.在一些实施例中，段落14-18任一者的组合物为人工或自动盘碟洗涤剂。
20.在另一方面，提供一种用于从表面移除含淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括：在包含有效量的权利要求1-13中任一项所述的变体淀粉酶的含水组合物的存在下温育该表面，允许多肽水解含淀粉污渍中存在的淀粉组分以产生溶解于含水组合物中的较小淀粉衍生分子，以及清洗该表面，从而从该表面移除含淀粉污渍。
21.在段落20的方法的一些实施例中，所述含水组合物还包含表面活性剂。
22.在段落20或21的方法的一些实施例中，表面为纺织物表面。
23.在段落20-22任一者的方法的一些实施例中，表面是在盘碟上。
24.在段落20-23任一者的方法的一些实施例中，表面是染污的硬质表面。
25.在另一个方面，提供编码段落1-13任一者的多肽的分离的多核苷酸。
26.在另一个方面，提供包含段落25的多核苷酸的表达载体。
27.在另一个方面，提供包含段落26的表达载体的宿主细胞。
为了进一步说明组合物和方法以及它们的优点，给出了以下具体实例，应当理解它们是示例性的，而非限制性的。
实例
实例1：测定法
在如下实例中，如下文陈述使用多种测定法以易于阅读。任何偏离下文提供的方案的地方均在相关部分中指出。在这些实验中，分光光度计用于测量反应完成后形成的产物的吸光度。
A.性能指数
性能指数(PI)将相同蛋白质浓度下变体的性能或稳定性(测量值)与标准酶的性能或稳定性(理论值)相比较。另外，可用标准酶的朗缪尔方程的参数来计算理论值。大于1的性能指数(PI)(PI>1)表示与标准(例如野生型Amy TS23t，SEQ ID NO:2)相比变体的性能改善，而等于1的PI(PI＝1)表示变体与标准表现相同，而小于1的PI(PI<1)表示变体比标准表现差。
B.蛋白质测定法
该测定法用经过过滤的培养上清液来进行，该培养上清液来自在37℃和80％湿度下以300rpm摇动，在96孔微量滴定板(MTP)中培养3天的培养物。将每孔容纳有25μL上清液的新的96孔圆底MTP用于高效液相色谱(HPLC)蛋白质测定方法。将上清液在pH5.5的25mM乙酸钠中稀释三倍，并且分析20μL的每种稀释样品。使用配备有Poroshell300SB-C8(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))柱的Agilent 1100(惠普公司(Hewlet Packard))HPLC。使用pH5.5的25mM乙酸钠将样品结合至柱，并且将其在最高至70％乙腈的梯度上洗脱。在222nm处读取吸光度，使用ChemStation软件(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))求积分，并且基于纯化的Amy TS23t蛋白质的标准曲线来测定样品的蛋白质浓度。
C.Ceralphaα-淀粉酶活性测定法
使用Ceralpha HR试剂盒(爱尔兰威克洛郡的美格兹密公司(Megazyme,Wicklow,Ireland))来进行Ceralphaα-淀粉酶测定法。该测定法涉及利用底物混合物在限定条件下温育培养上清液。通过加入硼酸盐缓冲液(200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10)来终止(和显色)该反应。使用的底物是确定的低聚糖“非还原末端封端的对硝基苯基麦芽庚糖苷”(BPNPG7)与过量水平的α-葡糖苷酶(其对天然底物没有作用，因为存在“封闭基团”)的混合物。内切作用的α-淀粉酶(或G6淀粉酶)水解该低聚糖时，该混合物中存在的过量α-葡糖苷酶瞬时且定量地将对硝基苯基麦芽糖片段水解为葡萄糖和游离的对硝基苯酚。测量405nm下的吸光度，其直接与所分析的样品中的淀粉酶的水平相关。
用于该测定法的设备包括Biomek FX自动化工作站(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))、SpectraMAX MTP读板仪(340型-分子仪器公司(Molecular Devices))和iEMS保温箱/振动器(赛默科技公司(Thermo Scientific))。使用的试剂和溶液是：
1)对硝基苯基麦芽庚糖苷(BPNPG7)底物(美格兹密公司(Megazyme)Ceralpha HR试剂盒)；
2)50mM MOPS，0.005％80缓冲液，pH 7(稀释缓冲液)；以及
3)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10(终止缓冲液)。
将含有54.5mg BPNPG7底物的小瓶溶解于10mL的密理博(MilliQ)水，然后在30mL的稀释缓冲液中稀释以制成40mL的工作底物(1.36mg/mL)。利用稀释缓冲液将淀粉酶样品(发酵上清液)稀释40倍。通过将5μL稀释的淀粉酶溶液加入MTP的孔中，然后加入55μL稀释的BPNPG7工作底物溶液来进行该测定法。混合所述溶液并将MTP用板密封件密封并置于25℃下的保温箱/振动器(iEMS-赛默科技公司(Thermo Scientific))中4分钟。通过添加70μl终止缓冲液来终止反应并在MTP读板仪中于波长400nm下读取吸光度。将非酶对照用于校正背景吸光度值。
D.CS-28水稻淀粉微样片测定法
该淀粉酶测定法的原理是由于棉花微样片中掺入的水稻淀粉水解而释放橙色染料。测量洗涤液在488nm处的吸光度，并且将其与在所需条件(pH、温度和缓冲液)下分析的样品中的淀粉酶活性水平相关联。
用于该测定法的设备包括Biomek FX自动化工作站(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))、SpectraMAX MTP读板仪(340型-分子仪器公司(Molecular Devices))和iEMS保温箱/振动器(赛默科技公司(Thermo Scientific))。使用的试剂和溶液是：
1)CS-28微样片(水稻淀粉，有色的)。
2)10mM HEPES，2mM CaCl2，0.005％TWEEN80缓冲液，pH8.0，电导率1mS/cm；
3)10mM HEPES，2mM CaCl2，0.005％TWEEN80缓冲液，pH8.0，电导率5mS/cm(用5M NaCl来调节)；
3)25mM CAPS，2mM CaCl2，0.005％TWEEN80缓冲液,pH10.0；电导率5mS/cm(用5M NaCl来调节)；以及
4)10mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.005％TWEEN80。
5.5mm圆直径的CS-28微样片由测试材料中心(Center for Testmaterials)(CFT，荷兰弗拉尔丁恩(Vlaardingen,The Netherlands))提供。将两种微样片放置于96孔Corning9017平底聚苯乙烯MTP的每个孔中。在10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％80溶液中将培养上清液稀释至大约1ppm。
将保温箱/振动器设置为所需温度25℃(室温)或32℃。将171μL的HEPES或CAPS缓冲液加入到含有微样片的MTP的每个孔中，随后将9μL稀释的酶溶液加入到每个孔中，以得到180μL/孔的总体积。将MTP用板密封件密封并置于iEMS保温箱/振动器中，并且在1150rpm、25℃下温育15分钟以在pH8、低(1mS/cm)和高(5mS/cm)电导率下进行清洁，并且在1150rpm、32℃下温育30分钟以在pH10、高电导率(5mS/cm)下进行清洁。在适当条件下温育后，从每个孔转移100μL溶液至新的MTP，并且使用MTP-分光光度计测量488nm处的吸光度。含有两个微样片和缓冲液但是没有酶的对照包括在内，以减去背景清洁性能。
将所获得的吸光度值针对空白值(在缺少酶的情况下温育微样片后获得的值)进行校正，并且所得的吸光度提供水解活性的量度。对每个样品 计算性能指数(PI)。对于关于洗涤性能指数的PI计算，使用朗谬尔方程，基于野生型Amy TS23t酶(SEQ ID NO:2)进行曲线拟合。使用变体的蛋白质浓度，基于曲线拟合来计算预期的性能。将所观察到的性能除以所计算的性能。然后将该值除以野生型AmyTS23t酶的性能。
E.热稳定性测定法–初始活性和残留活性的测定
与参考淀粉酶(野生型Amy TS23t，SEQ ID NO:2)有关的淀粉酶变体的热稳定性是通过在限定条件下在pH7的MOPS缓冲液中温育淀粉酶样品来测定的。对温育温度进行选择使得大约40％的初始参考淀粉酶活性丧失。使用上面小节C中描述的Ceralphaα-淀粉酶方法测定初始淀粉酶活性和残留的淀粉酶活性。
用于该测定法的设备包括Biomek FX自动化工作站(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))、SpectraMAX MTP读板仪(340型-分子仪器公司(Molecular Devices))、Tetrad2DNA Engine PCR仪(伯乐公司(BioRad))、和iEMS保温箱/振动器(赛默科技公司(Thermo Scientific))。使用的试剂溶液是：
1)对硝基苯基麦芽庚糖苷(BPNPG7)底物(美格兹密公司Ceralpha HR试剂盒)；
2)50mM MOPS，1.0mM CaCl2，0.005％80缓冲液，pH7(稀释缓冲液)；以及
3)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10(终止缓冲液)。
在稀释缓冲液中将培养上清液稀释40倍以产生浓度范围为0-4ppm的样品。使用5μL稀释的样品测定初始淀粉酶活性，而使用70μL热温育。将70μl样品置于96孔PCR板(VWR211-0297)的每个孔中，该板用铝密封件密封并将该板在Tetrad2DNA Engine PCR仪中于75℃下温育4分钟。通过以上小节C中描述的Ceralphaα-淀粉酶测定法，使用5μL样品来测定初始(t初始)淀粉酶活性和残留(t残留)淀粉酶活性。
对于每种变体，将残留淀粉酶活性与初始淀粉酶活性的比率用于如下计算热稳定性：热稳定性＝[t残留值]/[t初始值]，所以热稳定性活性比率是基于热温育之后的酶活性除以热温育之前的酶活性来计算。通过将变体酶的活性比率除以经类似处理的野生型AmyTS23t酶(SEQ ID NO:2)的该比率来测定关于热稳定性的性能指数。
F.洗涤剂稳定性测定法
在10％市售的汉高公司(Henkel)的彩亮洗衣凝露(Persil Color Gel)洗涤剂(于2011年购买)的存在下，在限定条件下温育后测量参考淀粉酶及其变体的稳定性。在使用前将该洗涤剂加热失活，使用如以上小节C中描述的Ceralphaα-淀粉酶测定法测定初始淀粉酶活性和残留淀粉酶活性。
用于该测定法的设备包括Biomek FX自动化工作站(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))、SpectraMAX MTP读板仪(340型-分子仪器公司(Molecular Devices))、Tetrad2DNA Engine PCR仪(伯乐公司(Biorad))、和iEMS保温箱/振动器(赛默科技公司(Thermo Scientific))。使用的试剂溶液是：
1)对硝基苯基麦芽庚糖苷(BPNPG7)底物(美格兹密公司Ceralpha HR试剂盒)；
2)液体洗涤剂(彩亮洗衣凝露，酶失活的，在80℃下2小时)；
3)50mM MOPS，0.1mM CaCl2，0.005％80缓冲液，pH 7(稀释缓冲液)；
4)稀释于稀释缓冲液中的10％洗涤剂溶液；
5)200mM硼酸/NaOH缓冲液，pH10(终止缓冲液)。
6)含有0-260μg/mL蛋白质的淀粉酶培养上清液。
将90μL的10％洗涤剂溶液加入96孔PCR板，并且与10μL原始培养上清液混合。将来自PCR板的样品在稀释缓冲液中稀释3倍，并且使用该稀释物的5μL等分试样测定初始淀粉酶活性。将PCR板在Tetrad PCR模块中于64℃下温育5分钟。温育之后，将洗涤剂-酶混合物在稀释缓冲液中稀释3倍，并且测量残留活性。通过以上小节C中描述的Ceralphaα-淀粉酶测定法，使用5μL样品来测定初始(t初始)淀粉酶活性和残留(t残留)淀粉酶活性。
对于每种变体，将残留淀粉酶活性与初始淀粉酶活性的比率用于如下计算洗涤剂稳定性：洗涤剂稳定性＝[t残留值]/[t初始值]，所以洗涤剂热稳定性活性比率是基于热温育后的酶活性除以热温育之前的酶活性来计算。
对于每个样品(变体)计算性能指数(PI)。通过将变体酶的洗涤剂稳定性与经类似处理的野生型AmyTS23t酶(SEQ ID NO:2)的洗涤剂稳定性相比来测定关于洗涤剂稳定性的性能指数。
实例2：表达和分泌Amy TS23tα-淀粉酶及其变体的枯草芽孢杆菌的构建
该实例描述了表达Amy TS23t及Amy TS23t的变体的枯草芽孢杆菌菌株的构建。来自芽孢杆菌属物种菌株TS-23(即，AmyTS23)的成熟α-淀粉酶具有如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1：
NTAPINETMM QYFEWDLPND GTLWTKVKNE AANLSSLGIT ALWLPPAYKG 50
TSQSDVGYGV YDLYDLGEFN QKGTIRTKYG TKTQYIQAIQ AAKAAGMQVY 100
ADVVFNHKAG ADGTEFVDAV EVDPSNRNQE TSGTYQIQAW TKFDFPGRGN 150
TYSSFKWRWY HFDGTDWDES RKLNRIYKFR STGKAWDWEV DTENGNYDYL 200
MFADLDMDHP EVVTELKNWG TWYVNTTNID GFRLDAVKHI KYSFFPDWLT 250
YVRNQTGKNL FAVGEFWSYD VNKLHNYITK TNGSMSLFDA PLHNNFYTAS 300
KSSGYFDMRY LLNNTLMKDQ PSLAVTLVDN HDTQPGQSLQ SWVEPWFKPL 350
AYAFILTRQE GYPCVFYGDY YGIPKYNIPG LKSKIDPLLI ARRDYAYGTQ 400
RDYIDHQDII GWTREGIDTK PNSGLAALIT DGPGGSKWMY VGKKHAGKVF 450
YDLTGNRSDT VTINADGWGE FKVNGGSVSI WVAKTSNVTF TVNNATTTSG 500
QNVYVVANIP ELGNWNTANA IKMNPSSYPT WKATIALPQG KAIEFKFIKK 550
DQAGNVIWES TSNRTYTVPF SSTGSYTASW NVP 583
来自芽孢杆菌属物种菌株TS-23(即，AmyTS23t或BASE)的成熟α-淀粉酶的C-端截短形式具有如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2：
NTAPINETMMQYFEWDLPNDGTLWTKVKNEAANLSSLGITALWLPPAYKGTSQ
SDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTKTQYIQAIQAAKAAGMQVYADVVFN
HKAGADGTEFVDAVEVDPSNRNQETSGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRW
YHFDGTDWDESRKLNRIYKFRSTGKAWDWEVDTENGNYDYLMFADLDMDHPEV
VTELKNWGTWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKYSFFPDWLTYVRNQTGKNLFAVGE
FWSYDVNKLHNYITKTNGSMSLFDAPLHNNFYTASKSSGYFDMRYLLNNTLMK
DQPSLAVTLVDNHDTQPGQSLQSWVEPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYY
GIPKYNIPGLKSKIDPLLIARRDYAYGTQRDYIDHQDIIGWTREGIDTKPNSG
LAALITDGPGGSKWMYVGKKHAGKVFYDLTGNRSDTVTINADGWGEFKVNGGS
VSIWVAK
合成DNA片段(由位于德国雷根斯堡工业园B35,93059(Gewerbepark B35,93059Regensburg,Germany)的金尔特公司(GeneArt AG)/生命技术公司(Life Technologies)制备)用作模板DNA以用于表达Amy TS23t及Amy TS23t的变体的枯草芽孢杆菌菌株的构建。为了表达Amy TS23t，由金尔特公司(GeneArt)使用独特的PstI和HpaI限制位点将Amy TS23t DNA片段克隆在pHPLT载体(Solingen et al.(2001)Extremophiles5:333-341(Solingen等 人，2001年，《极端微生物》，第5卷，第333-341页))中。pHPLT表达载体包含地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)、Lat前导序列、和来自pUB110质粒(McKenzie et al.(1986)Plasmid15:93-103(McKenzie等人，1986年，《质粒》，第15卷，第93-103页))的额外元件，其包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标记(bleo)。pHPLT-Amy TS23t示于图1中。枯草芽孢杆菌菌株(ΔaprE、ΔnprE)使用WO2002/14490中描述的pHPLT-Amy TS23t载体DNA来转化，该专利以引用方式并入本文。
在含有心浸液琼脂(Difco，目录号244400)和10mg/L硫酸新霉素(西格玛公司(Sigma)，目录号N-1876；每毫克含有732μg新霉素)的琼脂板上选择枯草芽孢杆菌转化株。携带有pHPLT-Amy TS23t载体的枯草芽孢杆菌转化株的选择性生长在装有MBD培养基(基于MOPS的确定成分培养基)、5mM CaCl2和10mg/L新霉素的摇瓶中进行。基本上如本领域所知来制备MBD培养基(参见例如Neidhardt et al.(1974)J.Bacteriol.119:736-747(Neidhardt等人，1974年，《细菌学杂志》，第119卷，第736-747页))，不同的是从基础培养基省略掉NH4Cl2、FeSO4和CaCl2，使用3mM K2HPO4，并且为基础培养基补充60mM尿素、75g/L葡萄糖和1％大豆胨。补足微量营养素，营养素为100X储备溶液，其1升含有400mgFeSO47H2O、100mg MnSO4.H2O、100mg ZnSO47H2O、50mg CuCl22H2O、100mg CoCl26H2O、100mg NaMoO42H2O、100mg Na2B4O710H2O、10ml1M CaCl2和10ml0.5M柠檬酸钠。生长导致产生了具有淀粉水解活性的分泌性AmyTS23t淀粉酶。
实例3：Amy TS23t位点评估文库(SEL)的建立
位点评估文库(SEL)的产生由金尔特公司(GeneArt AG)使用专有方法(WO2004/059556A3)来进行。出于蛋白质表达目的而通过PCR优化核苷酸序列的方法和装置，以及DNA分子的制备利用了金尔特公司(GeneArt)拥有的或许可的技术(欧洲专利No.0200362和No.0201184，以及美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.6,472,184)。本实例中描述的Amy TS23t SEL的构建由金尔特公司(GeneArt)使用其专门的和/或有知识产权的基因优化、基因合成和文库建立技术平台来进行。金尔特公司(GeneArt)的用于产生SEL的顺序排列方法在公司的网站 (http://www.geneart.com/english/products-services/directed-evolution/sequential-permutation-libraries/index.html)上有大致描述。
pHPLT-Amy TS23t质粒DNA(图1)用作模板以产生SEL。Amy TS23t SEL由金尔特公司(GeneArt)在本发明人预先选择的所有位置处产生。伴随的DNA密码子各自被置换为随机突变的密码子，所述随机突变的密码子编码至少15种不同氨基酸。密码子诱变的pHPLT-Amy TS23t混合物用于转化(WO2002/014490)所述的枯草芽孢杆菌感受态细胞，以便建立Amy TS23t位点评估文库。
将转化混合物涂布接种于含有10mg/L硫酸新霉素的心浸液琼脂板上。对于每个文库，挑取单一菌落并在10mg/L的新霉素选择下的TSB(基于胰蛋白胨和大豆的肉汤)液体培养基中生长以用于后续DNA分离和基因序列分析。序列分析数据显示的最大值为每个文库19个Amy TS 23t成熟单个变体。为了生成用于生化表征实验的Amy TS 23t和Amy TS23t变体酶样品，在每孔200μL MBD培养基的96孔MTP(Costar3599)中于37℃下进行Amy TS23t SEL变体克隆的选择性生长68小时，所述孔含有10mg/L新霉素和5mM CaCl2。
实例4：可组合突变和有效突变的识别
对于所有测试的Amy TS23t淀粉酶变体，使用实例1中描述的测定法来测定性能指数(PI)值：CS-28微样片测定法(在pH8和pH10下)、洗涤剂稳定性、热稳定性、和蛋白质测定。
有效位置被描述为分子内最适用于形成显示具有改善的特性的组合变体的那些位置，其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变是任何可用于制备组合变体的氨基酸位置处的突变。可组合突变改善分子的至少一种所需特性，而未明显降低表达、活性或稳定性。可组合突变可分组如下：
组A：产生这样的变体的突变：其中关于(i)蛋白质表达、(ii)在pH8(25℃)或pH 10(32℃)下的CS-28微样片活性、和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数(PI)大于或等于0.9，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.0的PI。
组B：产生这样的变体的突变：其中关于(i)蛋白质表达、(ii)在pH8(25℃)或pH 10(32℃)下的CS-28微样片活性、和(iii)洗涤剂稳定性或 热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数(PI)大于或等于0.8，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.2的PI。
组C：产生这样的变体的突变：其中关于(i)蛋白质表达、(ii)在pH8(25℃)或pH 10(32℃)下的CS-28微样片活性、和(iii)洗涤剂稳定性或热稳定性，相对于确定亲本蛋白质的最低性能指数(PI)大于或等于0.5，并且另外关于这些测试中的任一者具有大于或等于1.5的PI。
可组合突变的特性汇总于表4.1中。
表4.1.每组可组合突变的特性
优选的可组合突变是在“有效位置”，如下所述。就本发明的淀粉酶而言，“活性”是指α-淀粉酶活性，其可如本文所述进行测量。
有效位置是耐受用不同氨基酸残基进行置换的氨基酸位置，其中所得的变体符合上文所列出的一组可组合性性能标准。有效位置可以赋给如下有效性得分(Productivity Score)：
●其中给定位置处小于15％的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“1”。
●其中给定位置处小于40％但大于或等于15％的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“2”。
●其中给定位置处小于75％但大于或等于40％的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“3”。
●其中给定位置处75％或更多的置换落入组A、B或C的位置给予有效性得分“4”。
优选的有效位置为可组合突变。
适宜性得分是指根据突变每一者所落入的可组合性性能标准(即，上文所列出的A、B和C)，一个或多个可组合突变用于产生组合变体的能 力。较高的适宜性得分指示更适合用于产生组合变体的突变。适宜性得分在表4.2中有所描述。
表4.2.适宜性得分的定义
A、B和C +++++
A和B ++++
A或(B和C) +++
B ++
C +
表4.3示出了计算得到的Amy TS23t蛋白质中每个位置的有效性得分(4、3或2)。这些位置的子集列于表4.4和4.5中。没有位置计算为具有有效性得分1。对于每个Amy TS23t位置，根据它们得到的适宜性得分(+、++、+++、++++或+++++)列出了变体。位置编号基于成熟Amy TS23t多肽(SEQ ID NO:2)。
表4.3.Amy TS23t蛋白质中的位置的有效性得分。
表4.4.Amy TS23t蛋白质中所选择的位置的有效性得分。
表4.5.Amy TS23t蛋白质中所选择的位置的有效性得分。
出于所有目的，本文引用的所有参考文献均全文以引用方式并入本文。