内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104017748 A (43)申请公布日 2014.09.03 CN 104017748 A (21)申请号 201410106089.X (22)申请日 2014.03.21 CGMCC NO.8812 2014.01.26 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 枣庄学院 地址 277100 山东省枣庄市市中区北安路 1 号 (72)发明人 马耀华 谭小艳 (54) 发明名称 内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方 法与应用 (57。

2、) 摘要 本发明公开了一种内生生防菌株及其制成的 生防菌剂的制备方法与应用， 所述菌株为枯草芽 孢杆菌 （Bacillussubtilis） ， 己于2014年1月26 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心， 其保藏编号为 CGMCCNO.8812， 生防菌 剂浓度为 1108cfu/mL 的内生生防菌株细胞悬 液。能够有效的防止石榴的腐烂、 无污染、 抑菌率 高。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 。

3、CN 104017748 A CN 104017748 A 1/1 页 2 1. 一种内生生防菌株， 所述菌株为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 己于 2014 年 1 月 26 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏编号为 CGMCC NO.8812。 2. 一种根据权利要求 1 所述菌株的制备方法， 其特征是 ： 第一步， 内生生防菌株的分离 和纯化， 采集健康的石榴叶片称取 3.0 g， 用无菌水冲洗 45 次， 无菌剪刀剪成 45 mm 见方 的小块后， 依次用 75% 的酒精浸泡 5 s， 0.1 % 的升汞浸泡 50 s， 无菌水冲洗 。

4、3 次， 然后加 30 mL 无菌水在无菌研钵中研磨 ； 研磨后静止分层， 上清液作为浸出液备用， 其浓度为 0.1 g/ mL， 取上清液1 mL进行梯度稀释至10-5， 从10-3、 10-4、 10-5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板， 以最后一次冲洗液 0.2 mL 涂布平板进行无菌检验， 每处理 3 个重复 ； 在 37恒温培养箱中 倒置培养 2448 h， 挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化 ； 纯 化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基， 37培养 24 h， 4冰箱保存备用 ； 第二步， 内 生生防菌株的筛选， 首先将石榴腐烂病菌在马铃薯葡萄糖培养基平。

5、板上 28培养至产生孢 子， 用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖培养基平板中央， 在距平板中央 3 cm 的两条对称直线处划线接种已分离的内生菌株， 以只接石榴腐烂病菌为对照， 28 恒温 培养箱中培养， 待对照中病菌菌丝即将铺满全皿时， 计算抑制率的大小， 筛选出抑菌效果较 好的菌株 ； 第三步， 将筛选出的内生生防菌株进行保存， 第一种保存方法， 将选择培养的内 生菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨斜面上， 培养24 h后置于4冰箱保存， 半年转管一次防止 培养基干涸菌种死亡， 供临时使用， 第二种保存方法为甘油保存 ： 将内生生防菌株用无菌水 悬浮， 充分混匀制成菌悬液， 取 20 。

6、% 的灭菌甘油与菌悬液在涡旋震荡器上充分混匀转入无 菌的 1.5 mL EP 管中， 于 80 冷冻长期保存。 3. 根据权利要求 2 所述菌株的制备方法， 其特征是 ： 所述灭菌甘油与菌悬液的体积比 为 2 ： 1。 4. 一种根据权利要求 1 所述的内生生防菌株生防菌剂， 其特征是 ： 生防菌剂浓度为 1108 cfu/mL 的内生生防菌株细胞悬液。 5. 一种根据权利要求 4 所述生防菌剂的制备方法， 其特征是 ： 挑取活化的内生生防菌 株少许， 接种到 10 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 37 ， 180 r/min 摇床培养 24 h， 作为种 子液 ； 将种子液按 1%（v/v。

7、） 的比例接种于含 200 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的 1L 三角瓶 中， 37 ， 180 r/min摇床培养48 h， 得到发酵液， 2 500 r/min离心6 min， 收集菌体用无菌水 洗涤， 用清水配成浓度为 1108 cfu/mL 的内生生防菌株细胞悬液， 即为内生生防菌株生防 菌剂。 6. 一种根据权利要求 4 所述的生防菌剂在防治石榴贮藏期果实腐烂病的应用， 其特征 是 ： 将石榴果实用清水洗净、 风干， 将石榴果实浸入生防菌剂中 10 min， 取出后沥干萼筒内 的残留溶液并预冷至 5左右， 再用 0. 0250.03 mm 厚的聚乙烯袋单果包装， 装箱入库， 保 存温。

8、度为 46， 相对湿度为 90%。 权 利 要 求 书 CN 104017748 A 2 1/7 页 3 内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种生物菌种防治石榴腐烂的领域， 尤其涉及一种内生生防菌株及其 制成的生防菌剂的制备方法与应用。 背景技术 0002 石榴 （Punica granatum） ， 别名安石榴， 石榴科石榴属。原产于伊朗、 阿富汗等国 家， 现已在亚洲、 非洲、 欧洲沿地中海各地， 均作为果树栽培， 而以非洲尤多。 在我国， 除了东 北等极寒冷的少数省区外， 均适合石榴栽培， 我国已经形成了最有影响的石榴五大产区， 分 别为陕西临。

9、潼、 山东枣庄、 安徽怀远、 四川会理和云南巧家。石榴是集食用、 药用以及观赏 于一体的水果， 特别是石榴中富含抗氧化物质， 是延缓衰老、 预防动脉硬化且减缓癌变进程 的高水平抗氧化剂。调查表明， 我国石榴 20%30% 在中秋节和国庆节消费， 10% 用于加工， 50%60% 经过储藏延长货架期在春节前后上市。但是石榴采后果实在贮藏过程中， 受到多 种致病菌共同作用导致果实腐烂变质， 通常腐烂率是 30%， 严重时可达 70%， 严重影响了石 榴的经济价值。对于贮藏期石榴果实腐烂病由什么病菌引起有两种观点 ： 大部分学者 （戴 芳澜 1934 ； 周又生 1999 ； Jin&Chang 2。

10、002， 等） 认为是由石榴干腐病菌石榴鲜壳孢 ( Zythia Versoniana Sacc.) 引起 ； 2007 年付娟妮认为是葡萄座腔菌 （Botryosphaeria dothidea） 引起的。目前控制石榴采后腐烂的有效措施是低温贮藏结合化学防腐剂、 热、 辐射、 气调 等。常使用的化学防腐剂有甲基托布津 （Thiophanate-Methyl） 、 多菌灵 （Carbendazim） 、 敌霉烟剂 （TBZ） 等。化学防治是果蔬产后病害防治的主要途径， 但随着发现有致癌作用， 且污染环境的化学杀菌剂越来越多， 使其在果品上的应用受到限制。另外， 一些杀菌剂 的频繁使用也使病菌产。

11、生抗性， 防效大为降低， 如葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） 、 青霉菌 （Penicillium sp.） 、 梨形毛霉菌 （Mufcor piriformis Fischer)早已对苯来特 （Benlate） 有 抗性， 由于在柑桔上长期使用苯并咪哇类杀菌剂 （Benzimidazole fungicide） ， 使原来对其 不敏感的柑桔黑腐病菌 （Alternaria citri Ellis et. Pierce） 和柑桔酸腐病菌 （Oospora citriaurantii ex Persoon） 种群上升成为新问题。随着消费者对无公害农产品、 绿色食品 和有机食品的强烈。

12、需求， 开发高效、 低毒、 无残留的生物农药已成为迫切希望。生物农药是 指利用生物产生的生物活性物质或生物活体作为农药， 以及人工合成的与天然化合物结构 相同的农药， 是不污染环境的绿色农药， 可望成为解决化学农药残留污染的有效途径之一。 近年来植物根部、 叶部病害生物防治的成功实例， 大大激发人们将生物防治扩展到果蔬产 后病害的防治研究领域。特别自 1983 年起美国农部以 Wilson 为主的一批美、 以、 澳、 法等 国科学家， 在这方面做了大量的研究工作， 在美国， 已有防治核果类、 仁果类、 柑桔及一些蔬 菜产后病害的几种拮抗菌取得了专利或正在审定。目前， 将生物防治技术用于石榴贮藏。

13、防 腐的研究， 国内外没有相关报道。 综上所述， 筛选有效的生防细菌， 开发新型、 安全有效的微 生物杀菌剂是控制石榴腐烂病的发生， 减少贮藏期石榴的损失， 促进石榴产业经济稳健发 展的迫切需要。 说 明 书 CN 104017748 A 3 2/7 页 4 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种内生生防菌株及其制成的生防菌剂的制备方法与应用， 能够有效的防止石榴的腐烂、 无污染、 抑菌率高。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 一种内生生防菌株， 所述菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis， 己于2014年1月26 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普。

14、通微生物中心， 其保藏编号为 CGMCC NO.8812。 保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西 路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所。 0005 一种根据所述菌株的制备方法， 其特征是 ： 第一步， 内生生防菌株的分离和纯化， 采集健康的石榴叶片称取3.0 g， 用无菌水冲洗45次， 无菌剪刀剪成45 mm见方的小块后， 依次用 75% 的酒精浸泡 5 s， 0.1 % 的升汞浸泡 50 s， 无菌水冲洗 3 次， 然后加 30 mL 无菌水 在无菌研钵中研磨 ； 研磨后静止分层， 上清液作为浸出液备用， 其浓度为 0.1 g/mL， 取上清。

15、 液 1 mL 进行梯度稀释至 10-5， 从 10-3、 10-4、 10-5稀释悬液中各取 0.2 mL 涂布平板， 以最后一 次冲洗液 0.2 mL 涂布平板进行无菌检验， 每处理 3 个重复。在 37恒温培养箱中倒置培 养 2448 h， 挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化 ； 纯化后的 菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基， 37培养 24 h， 4冰箱保存备用 ； 第二步， 内生生防 菌株的筛选， 首先将石榴腐烂病菌在马铃薯葡萄糖培养基平板上 28培养至产生孢子， 用 接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖培养基平板中央， 在距平板中央 3 cm 的 两条。

16、对称直线处划线接种已分离的内生菌株， 以只接石榴腐烂病菌为对照， 28 恒温培养 箱中培养， 待对照中病菌菌丝即将铺满全皿时， 计算抑制率的大小， 筛选出抑菌效果较好的 菌株 ； 第三步， 将筛选出的内生生防菌株进行保存， 第一种保存方法， 将选择培养的内生菌 株划线接种在牛肉膏蛋白胨斜面上， 培养 24 h 后置于 4冰箱保存， 半年转管一次防止培 养基干涸菌种死亡， 供临时使用， 第二种保存方法为甘油保存 ： 将内生生防菌株用无菌水悬 浮， 充分混匀制成菌悬液， 取 20 % 的灭菌甘油与菌悬液在涡旋震荡器上充分混匀转入无菌 的 1.5 mL EP 管中， 于 80 冷冻长期保存。 000。

17、6 根据所述菌株的制备方法， 其特征是 ： 所述灭菌甘油与菌悬液的体积比为 2 ： 1。 0007 一种根据所述的内生生防菌株生防菌剂， 其特征是 ： 生防菌剂浓度为 1108 cfu/ mL 的内生生防菌株细胞悬液。 0008 一种根据所述生防菌剂的制备方法， 其特征是 ： 挑取活化的内生生防菌株少许， 接 种到 10 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 37 ， 180 r/min 摇床培养 24 h， 作为种子液 ； 将种 子液按 1%（v/v） 的比例接种于含 200 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的 1L 三角瓶中， 37 ， 180 r/min 摇床培养 48 h， 得到发酵液， 2 。

18、500 r/min 离心 6 min， 收集菌体用无菌水洗涤， 用 清水配成浓度为 1108 cfu/mL 的内生生防菌株细胞悬液， 即为内生生防菌株生防菌剂。 0009 一种根据所述的生防菌剂在防治石榴贮藏期果实腐烂病的应用， 其特征是 ： 将石 榴果实用清水洗净、 风干， 将石榴果实浸入生防菌剂中 10 min， 取出后沥干萼筒内的残留溶 液并预冷至 5左右， 再用 0. 0250.03 mm 厚的聚乙烯袋单果包装， 装箱入库， 保存温度为 46， 相对湿度为 90%。 0010 本发明的优点效果在于 ： 本发明发现一株具有高活性的、 稳定的内生细菌菌株 Bacillus subtilis。

19、 NS04。该菌株培养方法简单， 在 PDA 平板上对石榴干腐病菌有较好 说 明 书 CN 104017748 A 4 3/7 页 5 的抑制效果， 抑制率为 55.6%， 对石榴贮藏期果实腐烂病有显著的防效， 不同贮藏期的相 对防效为 100%54.082%， 商品率显著提高 20%12%， 且该菌株为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 来源于石榴叶片内部组织， 完全没有因化学农药使用所带来的一系列问题， 绿 色、 无毒、 环保， 明显将石榴果实的货架期显著延长了 90 d， 提高了果农的经济收入。因此， 菌株 NS04 作为石榴采后果实防腐的生防因子具有广阔的开发前景。

20、。 附图说明 0011 图 1 为普通对照菌落的抑制效果图。 0012 图 2 为内生生防菌株对石榴干腐病菌抑制作用图。 0013 图 3 为内生生防菌株培养 48h 的形态图。 0014 图 4 为内生生防菌株在显微镜下的形态图。 0015 图 5 为内生生防菌株传代对石榴干腐病菌抑制的稳定性图。 具体实施方式 0016 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明 ： 实施例 1 ： 内生生防菌株 NS04 的筛选 ： 1. 内生生防菌株的分离和纯化 采集健康的石榴叶片称取 3.0 g， 用无菌水冲洗 4-5 次， 无菌剪刀剪成 45 mm 见方的小 块后， 依次用 75% 的酒精浸泡 5。

21、 s， 0.1 % 的升汞浸泡 50 s， 无菌水漂洗 3 次， 然后加 30 mL 无 菌水在无菌研钵中研磨 ； 研磨后静止分层， 上清液作为浸出液备用， 其浓度为 0.1 g/mL， 取 上清液 1 mL 进行 10 倍梯度稀释至 10-5， 从 10-3、 10-4、 10-5稀释悬液中各取 0.2 mL 涂布平板， 以最后一次漂洗液 0.2 mL 涂布平板进行无菌检验， 每处理 3 个重复。在 37恒温培养箱中 倒置培养 2448 h， 观察， 若对照没有菌落长出， 说明表面灭菌彻底， 所得到的菌株为内生生 防菌株， 挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基 （NA） 平板上采用平板划线法进行纯。

22、化 ； 纯化后 的菌株接种于 NA 斜面培养基， 37培养 24 h， 4冰箱保存备用。 0017 2. 内生生防菌株的筛选 以大多数学者认为的腐烂病的病菌石榴鲜壳孢 ( Zythia Versoniana Sacc.) 为指示 菌， 采用平板对峙法测定内生细菌对腐烂病菌的抑制作用。首先将石榴腐烂病菌在马铃薯 葡萄糖琼脂培养基 （PDA） 平板上 28 培养至产生孢子， 用接种环挑取少量的病原菌孢子点 接到PDA平板中央， 在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生细菌， 以只 接石榴腐烂病菌为对照， 每处理 3 个重复， 28 恒温培养箱中培养， 待对照中病菌菌丝即将 铺满全皿。

23、时， 计算抑制率的大小。 0018 抑制率 （） （对照菌落直径处理菌落直径） 对照菌落直径 100 ， 菌 落直径单位 ： 厘米 （cm） 。 0019 通过石榴叶片内生菌的分离纯化和筛选， 获得了一株对石榴腐烂病菌有较好抑菌 活性的内生菌菌株， 抑制率为 55.6%， 编号为 NS04（图 1） 。 0020 实施例 2 ： 内生生防菌株 NS04 的保存方法 可以采用两种方法保存该菌种， 将培养24 h的内生细菌划线接种在NA斜面上， 培养24 h 后置 4 冰箱保存， 半年转管一次防止培养基干涸菌种死亡， 供临时使用。甘油保存 ： 将 说 明 书 CN 104017748 A 5 4/。

24、7 页 6 菌株用无菌水悬浮， 充分混匀制成菌悬液， 取 20 % 的灭菌甘油与菌悬液 （V甘油： V菌悬液=2 ： 1） 涡旋震荡器上充分混匀转入无菌的 1.5 mL EP 管中， 于 80 冷冻长期保存。 0021 实施例 3 ： 内生生防菌株 NS04 的鉴定 1. NS04 菌株的形态学、 生理生化特性 形态学和生理生化特性采用常规方法测定， 测定结果表明 NS04 菌株在 NA 平板培养基 上菌落直径约为 0.76 cm， 白色， 不透明， 不规则状， 隆起， 边缘裂叶状， 随培养时间延长菌 落表面出现褶皱 （图 2） 。NS04 单个细胞呈短杆状， 0.630.871.752.51。

25、 m， 单生或对 生 （图 3） ， 革兰氏染色阳性， 有椭圆形或柱状芽孢。NS04 菌株和枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 的生理生化特性基本一致 （表 1） 。 0022 2. NS04 菌株的 16S rDNA 序列分析 生防菌株 NS04 基因组 DNA 的提取采用反复冻融法， 采用 16S rDNA 通用引物， 委托生工 生物工程 （上海） 有限公司合成 ： 上游引物为 F27 ： 5 AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3 下游引物为 R1492 ： 5 TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3 PCR反应体系 （总体系为25 L） 为 ： pre。

26、mix Taq 12 L， DNA模板1 L， 引物各1 L， 双 蒸水 10 L。PCR 反应条件为 ： 94 预变性 4 min， 94 变性 30 s， 54 退火 1 min， 72 延 伸1.5 min， 30个循环后72 延伸10 min。 扩增得到16S rDNA 1 500 bp。 将产物用试剂盒纯 化后送到生工生物工程 （上海） 有限公司测序获得NS04的16S rDNA序列1449 bp， 在GenBank 已登录， 登录号为 JX126865。利用 BLAST 程序进行序列同源性比对分析， 用 Mega（5.0） 的 邻接法构建该菌株系统发育树， 结合形态学、 生理生化特。

27、性并查阅相关资料， 将 NS04 菌株 鉴定为枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 。 0023 实施例 4 ： NS04 菌株的抑菌稳定性 在NA斜面培养基上， 对NS04菌株进行连续传代， 37 恒温培养24 h， 4 冰箱保存， 连 说 明 书 CN 104017748 A 6 5/7 页 7 续移接 10 代， 待 10 代传完后， 将 10 代的菌株采用平板对峙法分别与石榴腐烂病菌做拮抗 实验， 每组 3 重复， 以只接石榴腐烂病菌为对照， 待对照组的病菌长满整个平板时， 记录拮 抗情况， 并测定石榴腐烂病菌的菌落大小， 用以计算抑菌率。测定结果 NS04 菌株的抑菌。

28、率 在 55.56%64.20%， 对石榴腐烂病菌的抑制率差异不显著， 说明 NS04 菌株对石榴腐烂病菌 的抑制作用能稳定遗传 （图 4） 。 0024 实施例 5 ： NS04 菌株生防菌剂的制备方法 将保存的 NS04 菌株移接到 NA 斜面上， 37 ， 培养 24 进行活化， 挑取活化的 NS04 菌株 少许， 接种到 10 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基 （NB） 中， 37 ， 180 r/min 摇床培养 24 h， 作为 种子液 ； 将种子液按 1%（v/v） 的比例接种于含 200 mL NB 培养基的 1L 三角瓶中， 37 ， 180 r/min 摇床培养 48 h， 得。

29、到发酵液， 2 500 r/min 离心 6 min， 收集菌体用无菌水洗涤， 用清水 配成浓度为 1108 cfu/mL 的 NS04 菌株细胞悬液， 即为 NS04 菌株生防菌剂。 0025 实施例 6 ： 生防内生细菌 NS04 防治贮藏期石榴腐烂病的应用 将采摘的新鲜、 健康、 商品成熟的石榴果实 （品种为青皮甜） ， 用清水洗净， 自然风干。设 置 2 个处理 ： 处理 1， 将石榴果实浸入实施例 5 所述的 NS04 菌株的细胞悬液中 10 min ； 处理 2， 将石榴果实浸入70% 甲基托布津可湿性粉剂1 500倍液中1 min， 以石榴果实浸入清水10 min 为对照。取出后。

30、沥干萼筒内的残留溶液并预冷至 5左右， 再用 0. 03 mm 厚的聚乙烯袋 单果包装， 装箱入库。以上每个处理设 3 个重复， 每个重复 50 个果实。装箱之后贮藏在温 度为 ( 51) 、 相对湿度为 90% 的机械冷库内， 第 30 d 开始观测实验结果， 每隔 15d 观测 1 次， 连续观测至 90 d。 0026 测定指标及方法 ： 石榴腐烂病根据果实发病严重度分为 4 级 （表 2） 试验结果表明 ： 贮藏期不同时间 NS04 菌株和甲基托布津可湿性粉剂 1 500 倍液对石 榴贮藏期的果实腐烂病均有较好的防治效果， 随着贮藏时间的延长， 腐烂病情指数呈现增 加的趋势， 其中对照。

31、的腐烂指数显著高于其他处理 （表 3） 。NS04 生防菌株的相对防效为 100%54.082%， 甲基托布津可湿性粉剂 1500 倍液的相对防效为 100%81.633%， 虽然显著 低于甲基托布津可湿性粉剂 1 500 倍液的防效， 但也有效控制了石榴贮藏期果实腐烂病的 发生 （表 4） 。石榴贮藏 75 d 内， NS04 生防菌株处理的果实商品率不小于 95.3%， 和甲基托 布津可湿性粉剂 1 500 倍液处理的果实商品率 （98.7%） 相比在 0.05 水平上无显著差异， 但 石榴贮藏 90 d 时， NS04 生防菌株的果实商品率显著低于甲基托布津可湿性粉剂 1 500 倍 液。

32、 （表 5） ， 但和对照相比商品率显著提高 12%20%， 且该菌株属于枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ， 来源于石榴叶片内部组织， 比化学农药绿色、 无毒、 环保， 明显将石榴果实的货 说 明 书 CN 104017748 A 7 6/7 页 8 架期显著延长了 90 d， 提高了果农的经济收入。因此， 菌株 NS04 作为石榴采后果实防腐的 生防因子具有广阔的开发前景。 0027 本发明的具体情况如下 ： 本发明采用的细菌是分离自植物石榴叶片组织的内生细菌Bacillus subtilis NS04菌 株， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地。

33、址为北京市朝阳区北 辰西路 l 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 1 月 26 日， 保藏号为 CGMCC NO. 8812。 0028 本发明的内生生防菌株经形态学观察、 常规生理生化实验及 16S rDNA 序列分析， 鉴定为Bacillus subtilis的一个新菌株， 具有以下特征 ： 在 NA 平板培养基上培养 24 h 菌 落直径约为0.76 cm， 白色， 不透明， 不规则状， 隆起， 边缘裂叶状， 48 h后菌落表面出现褶皱。 单个细胞呈短杆状， 0.630.871.752.51 m， 单生或对生， 革兰氏染色阳性， 有椭圆形或 柱状芽孢。产过氧化氢酶 ； V-P 反。

34、应阳性 ； 吲哚试验阴性 ； 利用柠檬酸盐 ； 不利用丙酸盐 ； 还 说 明 书 CN 104017748 A 8 7/7 页 9 原硝酸盐 ； 水解淀粉、 明胶、 酪氨酸、 酪素 ； 利用葡萄糖、 L- 阿拉伯糖、 D- 甘露醇、 D- 木糖产 酸 ； 能在 pH 5.7 的营养肉汤中生长 ； 10 NaCl 仍能生长 ； 生长温度范围 10 50。 0029 本发明按照常规方法制备， 以内生生防菌株作为生产菌株， 通过液体发酵， 制备内 生生防菌株生防菌剂 ； 通过室内平板实验， 评价其对石榴干腐病菌菌丝生长的抑制作用 ； 通过冷库内石榴防腐试验， 评价其对贮藏期石榴腐烂病的防治效果。 0030 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的构 思和保护范围进行限定， 在不脱离本发明设计构思的前提下， 本领域中普通工程技术人员 对本发明的技术方案作出的各种变型和改进， 均应落入本发明的保护范围。 说 明 书 CN 104017748 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104017748 A 10 2/2 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 104017748 A 11 。