一种胆盐水解酶突变体及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103992991 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103992991 A (21)申请号 201310557568.9 (22)申请日 2013.11.11 C12N 9/14(2006.01) C12R 1/25(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 陈坚 张娟 董自星 周晓玲 堵国成 李华钟 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 11419 代理人 何自刚 王玉松 (54) 发明名称 一种胆盐水解酶突变体及其应用 (57) 摘要 。

2、本发明公开了一种胆盐水解酶突变体及其应 用， 属于基因工程技术领域。本发明通过对胆盐 水解酶氨基酸序列比对分析和 3-D 结构的同源模 拟及叠加分析， 确定胆盐水解酶底物特异性氨基 酸突变位点， 利用定点突变技术将底物特异性氨 基酸突变为非极性氨基酸， 将突变体导入宿主菌， 获得突变菌株。突变体所产胆盐水解酶均为活性 酶， 且与野生型相比， 突变体对甘氨结合胆盐的水 解能力都有下降的趋势， 而对牛磺结合胆盐的水 解能力则有增加的趋势。这为提高 BSH 对牛磺结 合胆盐的水解能力和揭示其对底物的结合机制奠 定了基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附。

3、图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103992991 A CN 103992991 A 1/1 页 2 1. 一种胆盐水解酶突变体， 其特征在于， 改变胆盐水解酶氨基酸序列的底物特异性。 2. 根据权利要求 1 所述突变体， 其特征在于， 植物乳杆菌胆盐水解酶第 65 位酪氨酸为 突变为非极性氨基酸。 3. 根据权利要求 1 所述突变体， 其特征在于， 植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解 酶第 65 位酪基酸为突变为非极性氨基酸。 4. 根据权利要求 1 所述突。

4、变体， 其特征在于， 植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解 酶第 65 位酪氨酸为突变为丙氨酸、 苯丙氨酸或异亮氨酸中的任一一种。 5. 根据权利要求 4 所述突变体， 其特征在于， 植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解 酶第 65 位酪氨酸为丙氨酸。 6. 根据权利要求 4 所述突变体， 其特征在于， 植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解 酶第 65 位酪氨酸为苯丙氨酸。 7. 根据权利要求 4 所述突变体， 其特征在于， 植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解 酶第 65 位酪氨酸为异亮氨酸。 8. 一种获得权利要求 1。

5、 所述突变体的方法， 其特征在于， 将植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 底物特异性氨基酸突变为非极性氨基酸。 9. 根据权利要求 8 所述方法， 其特征在于， 植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解酶 第 65 位酪氨酸为突变为非极性氨基酸。 10.根据权利要求8所述方法， 其特征在于， 植物乳杆菌L.plantarum BBE7胆盐水解酶 第 65 位酪氨酸为突变为丙氨酸、 苯丙氨酸或异亮氨酸中任一一种。 权 利 要 求 书 CN 103992991 A 2 1/7 页 3 一种胆盐水解酶突变体及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种胆盐水解酶突变体及其应用，。

6、 属于基因工程技术领域。 背景技术 0002 通过底物特异性的研究发现， 胆盐水解酶有很强的底物选择性， 其水解甘 氨 结 合 胆 盐 （glyco-conjugated bile salts）的 能 力 远 远 高 于 水 解 牛 磺 结 合 胆 盐 （tauro-conjugated bile salts） 的能力， 这与报道的大多数 BSH 的底物特异性一致。然 而正常人体中甘氨结合胆盐与牛磺结合胆盐的比例为 3:1， 这将导致牛磺结合胆盐不能被 BSH 很好的水解。 0003 胆盐水解酶的底物是由类固醇核部分和氨基酸基团 （甘氨酸 / 牛磺酸） 两部分组 成的。Huijghebaert。

7、 和 Hofmann 发现， 修饰底物的酰胺键或减少底物氨基酸部分末端基团 的负电荷会显著降低胆盐水解酶对相应底物的水解能力。Batta 等也发现胆酰甘氨酸水解 酶 （CGH） 能有效水解由带有一到两个亚甲基的甘氨酸或牛磺酸类似物制成的底物。而且 目前大多数文献中的动力学数据都表明 BSH 优先识别底物的氨基酸基团。然而 Moser and Savage 等发现 BSH 优先识别底物的类固醇核部分。此外， Batta 等和 Rossocha 等的研究证 实， 类固醇部分的羟基取代基或异构化的羟基取代基对 BSH 的底物特异性没有影响， 而且 BSH 是通过疏水相互作用而不是氢键与底物的类固醇部。

8、分结合的。因此， 关于 BSH 对底物 的识别位点还存在一定的争议， 胆盐水解酶可能对类固醇核部分和氨基酸基团都有识别作 用。也有可能是 BSH 对底物没有特异性的结合条件， 只要氨基酸部分和类固醇部分合适且 与底物结合口袋互补就行。为了增强 BSH 水解牛磺结合胆盐的能力以及揭示 BSH 与底物的 结合机制， 有必要寻找和研究决定其底物特异性的氨基酸残基 （specifi city-determining residue,SDR） 。 0004 本发明根据现有的报道， 通过氨基酸序列比对分析以及同源建模等发现， L.plantarum BBE7 BSH 65 位氨基酸的极性对 BSH 的底物。

9、特异性有一定的影响。并利用定点 突变研究了突变体对酶的底物特异性的影响。 发明内容 0005 本发明提供了一种胆盐水解酶突变体及其应用， 主要涉及改变胆盐水解酶氨基酸 序列的底物特异性。 0006 所述突变体是胆盐水解酶， 来源于植物乳杆菌 L.plantarum BBE7， 突变位点为第 65 位酪氨酸， 突变后 65 位氨基酸是非极性氨基酸， 具体为丙氨酸、 苯丙氨酸或异亮氨酸中 的任一一种。 0007 另外， 本发明还提供了一种获得胆盐水解酶突变的方法， 是利用定点突变技术将 胆盐水解酶底物特异性氨基酸突变为非极性氨基酸。具体为将植物乳杆菌 L.plantarum BBE7 胆盐水解酶第。

10、 65 位酪氨酸突变为非极性氨基酸 ： 丙氨酸、 苯丙氨酸或异亮氨酸中任 一一种。 说 明 书 CN 103992991 A 3 2/7 页 4 0008 通过本方法除可将 L.plantarum BBE7BSH65 位氨基酸分别突变成了 3 个非极性氨 基酸外， 还可突变为 2 个极性氨基酸。方法的具体操作步骤如下 ： 0009 1、 利用在线工具 ClustalW2(http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) 对 底物特异性已知的 BSH 的氨基酸序列进行比对和分析。 0010 2、 采用在线软件Swiss Model(http:/swissmode。

11、l.expasy.org/)对L.plantarum BBE7的BSH进行3-D结构的同源模拟。 并利用软件Accelrys Discovery Studio Client 2.5 对该结构与 C.perfringens 13 CBAH 的结构 （PDB code:2BJF,2BJG） 进行叠加和分析。 0011 突变菌株的构建， 包括如下步骤 ： 0012 1） 以质粒 pET-20b(+)-dmsA-bsh 为模板， 分别以下几对引物进行 PCR 扩增 ； 0013 65A-F ： 5 -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACGCCGATG-3 0014 65A-R ：。

12、 5 -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGGCGTAAAG-3 0015 65C-F ： 5 -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTGTGATG-3 0016 65C-R ： 5 -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCACAGTAAAG-3 0017 65F-F ： 5 -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACTTCGATG-3 0018 65F-R ： 5 -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGAAGTAAAG-3 0019 65I-F ： 5 -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACA。

13、TTGATG-3 0020 65I-R ： 5 -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCAATGTAAAG-3 0021 65N-F ： 5 -CTGCTGATGTAGAAAGCTATCCACTTTACAACGATG-3 0022 65N-R ： 5 -CAAGCCTTTTTCATTCATCGCATCGTTGTAAAG-3 0023 PCR 反 应 体 系 ： 0.2mL PCR 管 中 按 顺 序 加 入 以 下 试 剂 ： 5PrimeSTAR Buffer 10L;dNTP Mixture 4L; 模板 DNA 1L ； 上下游引物各 2L ； PrimeSTAR HS DNA。

14、 聚合酶 0.5L ； 加双蒸水至终体积为 50L。 0024 PCR 扩增条件 ： 94预变性 10min ； 98变变性 10s， 57退火 30s， 72延伸 1min （30 个循环） ； 72延伸 10min。 0025 2） 将PCR产物直接用限制性内切酶Dpn I进行消化 （37,1h） ， 取10L酶切产物 转化 E.coli JM109 感受态细胞， 直接挑取含有抗生素的 LB 固体平板上的单菌落进行培养， 并送生工生物工程 （上海） 股份有限公司进行测序 ； 0026 3） 将测序正确的质粒转化 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞， 即得到突变菌株。 0。

15、027 突变体的表达与纯化 ； 0028 1） 培养基 ： 种子和斜面培养基为 LB 培养基 （1L） ： 胰蛋白胨 10g， 酵母抽提物 5g， NaCl10g， 用 1N NaOH 将 pH 调至 7.0 ； 斜面培养基添加琼脂 15g ； 基本发酵培养基为 TB 培养 基 （1L） ： 去离子水900mL， 胰蛋白胨12g， 酵母抽提物24g， 甘油10mL， 高压灭菌， 冷却至60， 加 100mL 灭菌磷酸钾缓冲液 ； 0029 2）培养方法 ： 将 20、 200rpm 下过夜培养的种子以 2% 的接种量转入基本发酵 培养基， 于 37、 200rpm 条件下培养至 OD600=0。

16、.6， 加入 0.4mM IPTG 于 20诱导 35h ； 通过 SDS-PAGE 和酶活测定， 分析突变体的表达情况。 0030 SDS-PAGE 蛋白电泳的方法 ： SDS-PAGE 胶的组成为 ： 上层浓缩胶为 5%， 下层分离胶 为 12%， 电泳缓冲液为 Tris-HCl 缓冲液 （pH8.0） 。具体方法见碧云天 SDS-PAGE 配制试剂盒 说明书。 酶活的测定方法是分别将10mM的底物甘氨胆酸 （GCA） ， 甘氨脱氧胆酸 （GDCA） ， 甘氨 说 明 书 CN 103992991 A 4 3/7 页 5 鹅脱氧胆酸 （GCDCA） ， 牛磺胆酸 （TCA） ， 牛磺脱氧胆。

17、酸 （TDCA） 和牛磺鹅脱氧胆酸 （TCDCA） 添 加到反应体系中， 37反应 30min， 用茚三酮法进行比酶活的测定， 比酶活最高者为 100%。 0031 具体方法为 ： 取 0.1mL 样品加入 1.8mL 0.1M 磷酸盐缓冲液 （pH6.0） 和 0.1mL 结合 胆盐 （200mM） 中混合， 并置于 37孵育 30min， 取 0.5mL 上述反应液加入 0.5mL15%(w/v) 三 氯乙酸终止反应， 混合均匀后， 离心 10min( 离心机最大转速 ,4 ) 取上清。将 0.1mL 上清 液与 1.9mL 茚三酮显色液 （包括 0.5mL1% 茚三酮 （溶解于 0.5M。

18、 柠檬酸缓冲液 （pH5.5） 中） 、 1.2mL 甘油和 0.2mL 0.5M 的柠檬酸缓冲液 （pH5.5） ） 混合， 震荡混匀， 沸水浴 14min。冷却 3min 后测定 570nm 下的吸收值。标准曲线用甘氨酸或牛磺酸制作。并用 Brandford 蛋白浓 度测定试剂盒测定蛋白的含量， 计算比酶活。 0032 3） 利用硫酸铵沉底、 透析、 Ni2+亲和层析和凝胶过滤层析纯化突变体。 0033 突变体的分离纯化方法如下 ： 0034 结合缓冲液 （24mL） ： 3mL8 磷酸盐缓冲溶液， 0.24mL 2M 咪唑， 加水至 24mL， 调 pH 至 7.4 7.6。此缓冲液含有。

19、 20mM 的磷酸盐 （1） ， 500mM NaCl 和 20mM 咪唑。 0035 洗脱缓冲液 （8mL） ： 1mL8 磷酸盐缓冲溶液， 2mL2M 咪唑， 加水至 8mL， 调 pH 至 7.4 7.6。此缓冲液含有 20mM 的磷酸盐， 500mM NaCl 和 500mM 咪唑。 0036 8磷酸盐缓冲溶液 （pH7.4） ： 1.42g Na2HPO42H2O （177.99g mol-1） ， 1.11g NaH2PO4H2O （137.99g mol-1） ， 23.38g NaCl （58.44g mol-1） ， 加入 90mL 蒸馏水， 充分溶解， 将 pH 调至 7.。

20、4， 再定容至 100mL， 用 0.45m 滤膜过滤。 0037 2M 咪唑 （pH7.4） ： 13.62g 咪唑 （68.08g mol-1） ， 加入 90mL 蒸馏水， 完全溶解， 用 HCl 调 pH 至 7.4， 定容至 100mL， 用 0.45m 滤膜过滤。 0038 1） 盐析 0039 在 800mL 发酵上清液中加入 10%（v/v） 的甘油， 随后将其放在磁力搅拌器上进行 搅拌， 再缓慢加入研磨的、 干燥的硫酸铵粉末至其饱和度为 40%。在冰上放置 1h 后， 离心 （7000rpm ； 30min ； 4C） 取上清， 加硫酸铵至其饱和度为 80%。在 4C 放置 。

21、4h 以上， 离心收集沉 淀， 并将其溶解到 20mL 50mM 磷酸钠缓冲液 （pH7.0） 。 0040 2） 透析 0041 将硫酸铵沉淀后的样品用透析袋 （截留分子量为 50kDa） 在 50mM 磷酸钠缓冲液 （pH7.0） 中透析 24h， 每隔三四个小时换一次缓冲液， 直至样品中硫酸铵全部透析出来。 0042 3） Ni2+亲和层析 0043 用 5 10mL 的结合缓冲液以 1mL min-1的流速平衡 HisTrap FF crude 柱 （1mL） ， 将 样品以 1mL min-1的流速进样至层析柱上， 随后用 10mL 的结合缓冲液洗脱未结合蛋白， 再用 洗脱缓冲液对目。

22、的蛋白进行梯度洗脱， 并进行收集 （固定体积和峰收集） ， 最后对收集液进 行 SDS-PAGE 电泳分析和酶活测定。 0044 4） 凝胶柱纯化 0045 利用超滤离心管将含有重组 BSH 的组分离心 （4000rpm ； 4） 浓缩至 2mL 左右。然 后用Superdex G-200预装柱对浓缩的样品进行纯化， 所用的缓冲液为20mM的磷酸钠缓冲液 （pH6.0） ， 流速为 0.5mL min-1。收集含有 BSH 的组分。 0046 3、 突变体底物特异性的测定。 0047 通过对不同底物酶活的测定， 分析野生型 BSH 和突变型 BSH 的底物特异性。 说 明 书 CN 10399。

23、2991 A 5 4/7 页 6 0048 本发明的有益效果 ： 与野生 BSH 相比， 突变体 Y65A， Y65F 和 Y65I 对甘氨结合胆盐 的水解能力都有下降的趋势， 而对牛磺结合胆盐的水解能力则有增加的趋势。 这为提高BSH 对牛磺结合胆盐的水解能力和揭示其对底物的结合机制奠定了基础。 附图说明 0049 图 1 ： 与已知的胆盐水解酶的氨基酸序列比对图。 0050 图2 ： L.plantarum BBE7 BSH和脱氧胆酸 （DCA） 、 牛磺酸 （Taurine） 的复合体的结构 及保守氨基酸空间位置。 0051 图 3 ： E.coli BL21(DE3)pLysS 表达突。

24、变体的 SDS-PAGE 分析。 0052 图 4 ： SDS-PAGE 分析纯化的突变体。 0053 图 5 ： 野生 BSH 与突变体的底物特异性。 具体实施方式 0054 实施例 1 ： pET-20b(+)-dmsA-bsh 构建方法 0055 具体操作如下 ： 0056 质粒 pUC57-Tat(Tat-dependent protein targeting in prokaryotes and chloroplasts) 为模板， 扩增 dmsA 基因， PCR 条件为 ： 95预变性 10min ； 98 10s， 55 30s， 72 20s， 30 个循环 ； 72延伸 10。

25、min。同时以 L.plantarum BBE7 的基因组 DNA 为模 板， PCR 扩增 （延伸时间为 1min） 不含终止密码子的 bsh 基因， 将这两个片段进行胶回收， 以 等摩尔的这两个片段为模板， 得到融合片段 dmsA-bsh。 0057 2) 用 Nde I 和 Xho I 进行双酶切， 与经过相应酶切的质粒 pET-20b(+) 进行连接， 得到重组质粒 pET-20b(+)-dmsA-bsh。并将重组质粒转化 E.coli JM109 感受态细胞， 并筛 选阳性重组子进行测序。 0058 实施例 2 ： 氨基酸序列比对分析 0059 利用在线工具 ClustalW2(ht。

26、tp:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) 对底 物特异性已知的 BSH 的氨基酸序列进行比对和分析。进行比对分析的胆盐水解酶基因包括 以下 23 种， 具体氨基酸序列见图 1 ： 0060 LSB-30514_bsh1,L.salivarius B-30514 BSH1(AFP87505.1); 0061 LSUCC118_bsh1,L.salivarius UCC118 BSH1(ACL98201.1);LSLGM14476_bsh1,L. 0062 salivarius LGM14476 BSH1(ACL98197.1);LSLGM14476_bsh2。

27、,L.salivarius LGM14476(ACL98205.1); 0063 LSJCM1046_bsh1.L.salivarius JCM1046BSH1(ACL98194.1); 0064 L P S T - I I I - b s h 1 , L . p l a n t a r u m s u b s p . p l a n t a r u m S T - I I I BSH1(ADO00098.1);LPBBE7_bsh,L. 0065 plantarum BBE7BSH; 0066 LPWCFS1_bsh1,L.plantarum WCFS1(CCC80500.1); 0067 。

28、LP80_bsh,L.plantarum80(AAB24746.1); 0068 LRCRL1098_bsh,L.reuteri CRL 1098(ACH81023.1); 0069 LJ100_chshalpha,L.johnsonii100-100CBSH-(AAG22541.1); 说 明 书 CN 103992991 A 6 5/7 页 7 0070 LJ100_chshbeta,L.johnsonii100-100CBSH-(AAC34381.1); 0071 LJPF01_bshA,L.johnsonii PF01 BSHA(EGP12224.1); 0072 LJPF01_bsh。

29、B,L.johnsonii PF01 BSHB(EF536029.1); 0073 LJPF01_bshC,L.johnsonii PF01 BSHC(EGP12391.1); 0074 LANCFM_bshA,L.acidophilus NCFM BSHA(YP_193782.1); 0075 LANCFM_bshB L.acidophilus NCFM BSHA(AAV42923.1); 0076 LGAM1_bsh,L.gasseri Am1 BSH(FJ439777.1); 0077 CPERF13_cbah1,Clostridium perfringens 13 CBAH-1(P54。

30、965.3); 0078 BLBB536_bsh,Bifidobacterium longum BB536 BSH(AEK27050.1);BLSBT2928_ bsh,B. 0079 longum SBT2928 BSH(AAF67801.1); 0080 BBATCC11863_bsh,B.bifi dum ATCC 11863 BSH(AAR39435.1); 0081 BABI30_bsh,B.animalis subsp.lactis Bi30 BSH(AEK27050.1)。 0082 氨基酸序列比对表明， 这些序列之间的相似度为 30.57%-99.69%， 平均值为 46.78。

31、%。根据 C.perfringens CBAH 的晶体结构的数据， 确定了保守的活性位点氨基酸、 底 物结合口袋和二级结构。从图 1 中可以看出， 活性位点氨基酸在所有的 BSH 中都是高度保 守的。而底物结合口袋 （6,7 和 11） 的氨基酸都不是保守的， 除了严格保守的 Leu142 （具体原因尚不清楚） 。在所有的 BSH 中， 底物结合口袋的氨基酸主要是疏水氨基酸， 这表明 BSH 可能通过疏水相互作用与底物的疏水性的类固醇部分结合。 0083 此外， 位于 C.perfringens CBAH 中的 68 位氨基酸 （Ala68） （在 L.plantarum BBE7 BSH 中。

32、是 Tyr65） 的极性对 BSH 的底物特异性有一定的影响， 这可能是因为 Ala68 位于形成 底物结合口袋的 7 上。当这个氨基酸为非极性氨基酸 （丙氨酸 （A） 和苯丙氨酸 （F） ） 时， BSH 偏向于水解牛磺结合胆盐 ； 而当这个氨基酸为极性氨基酸 （酪氨酸 （Y） 和半胱氨酸 （C） ） 时， BSH 则偏向于水解甘氨结合胆盐， 这与 Chae 等的研究结果一致。此外， 尽管存在少数例 外， 如 BABI30_bsh 的 68 为氨基酸为非极性的苯丙氨酸， 而它却偏向于水解甘氨结合胆盐， 但这至少可以表明 68 位氨基酸是许多决定底物特异性的氨基酸残基 （SDR） 中的一个， 。

33、可能 还有其它的 SDR 需要进一步挖掘。 0084 实施例 3 ： 同源结构模拟和叠加 0085 利用在线软件 Swiss Model 对 L.plantarum BBE7 BSH 的 3-D 结构进行了同源模 拟， 用于同源建模的模板是 C.perfringens 13 CBAH 的突变体 C2a（PDB ID:2rf8B） 。二者 序列的同源性为 37.69%。模拟后 BSH 模型的估计绝对模型质量 （QMEAN Z-Score） 和 碳 原子的均方根偏差 （Root-Mean-Square Deviation,RMSD） 分别为 -3.61 和将该模 型与 CBAH 和底物的复合体结构。

34、 （PDB code:2BJF,2BJG） 进行叠加 （RMSD 为） ， 得到了 L.plantarum BBE7BSH 和脱氧胆酸 （DCA） 、 牛磺酸 （Taurine） 的复合体的结构 （图 2a） 。图 2a 中L.plantarum BBE7 BSH与C.perfringens 13 CBAH结构的叠加， 深灰为BSH， 浅灰为CBAH ； 图 2b 描述了 L.plantarum BBE7 BSH 中保守的氨基酸 （Cys2， Arg16， Asp19， Asn79， Asn170 和 Arg223） 以及 Tyr65 与底物 DCA 的空间位置关系， 其中 Tyr65 位于底。

35、物 DCA 的异戊酸侧 链以及催化中心 Cys2 附近。而且这个异戊酸侧链离 C12 位的羟基取代基很近， 在这里增加 亲水性的 （极性的） 氨基酸会改变酶的底物亲和力。此外， Tyr65 还与 -11 有紧密的相互 说 明 书 CN 103992991 A 7 6/7 页 8 作用， 而 -11 位于 核心结构内， 因此它对 Ntn 水解酶家族的酶的底物结合和催 化都起到重要作用。 0086 综合氨基酸序列比对以及同源结构模拟和叠加的结果， L.plantarum BBE7 BSH 的 65 位氨基酸的极性和空间位置决定了它对酶的底物特异性有一定的影响。 0087 实施例 4 ： 定点突变及。

36、突变体的表达和纯化 0088 采用一步法对 65 位的氨基酸进行了定点突变， 将它分别突变成两个极性的氨基 酸 （C 和 N） 以及三个非极性的氨基酸 （A,F 和 I） 。通过蛋白电泳和酶活测定发现， 突变体 Y65A， Y65F 和 Y65I 都以活性酶的形式被分泌到胞外 （图 3-3a， 其中 （a） 全细胞 ；（b） 破壁 沉淀 ； 1， Y65C ； 2， Y65N ； 3， Y65A ； 4， Y65F ； 5， Y65I ； 6， 含有 pET-20b(+) 的 E.coli BL21(DE3) pLysS ； M， 蛋白分子量标准） ， 而突变体 Y65C 和 Y65N 则以包。

37、涵体的形式存在于胞内 （图 3-3b） 。而且这两个突变体的信号肽 DMSA 与 BSH 形成的前体 （分子量约为 42kDa） 没有被信 号肽切割， 也在胞内形成了包涵体 （图 3-3b） 。这可能是因为 C 和 N 为极性氨基酸， 而 A， F 和 I 为非极性氨基酸。而且 Tyr65 离催化反应中心 Cys2 很近。因此， L.plantarum BBE7 BSH65 位氨基酸的极性对蛋白的正确折叠至关重要， 这也进一步证实了底物结合口袋的氨基酸一 般为非极性的疏水氨基酸。 0089 采用 Ni2+柱和凝胶柱分别对突变体 Y65A， Y65F 和 Y65I 进行了纯化。SDS-PAGE 。

38、电 泳分析的结果表明， 纯化后的重组酶均达到了电泳纯 （图 4， 其中 1， Y65A ； 2， Y65F ； 3， Y65I ； M， 蛋白分子量标准） 。 0090 实施例 5 ： 突变体底物特异性的测定 0091 分别将 10mM 的底物甘氨胆酸 （GCA） ， 甘氨脱氧胆酸 （GDCA） ， 甘氨鹅脱氧胆酸 （GCDCA） ， 牛磺胆酸 （TCA） ， 牛磺脱氧胆酸 （TDCA） 和牛磺鹅脱氧胆酸 （TCDCA） 添加到反应体 系中， 37反应 30min， 用茚三酮法进行比酶活的测定。比酶活最高者为 100%。 0092 通过酶活测定分析了野生 BSH 与突变体的底物特异性， 具体结。

39、果见图 5， 其中 GCA 为甘氨胆酸 ； GDCA 为甘氨脱氧胆酸 ； GCDCA 为甘氨鹅脱氧胆酸 ； TCA 为牛磺胆酸 ； TDCA 为牛 磺脱氧胆酸 ； TCDCA 为牛磺鹅脱氧胆酸 ； 误差线表示的是标准偏差。从图中可以看出， 与野 生 BSH 相比， 突变体 Y65A、 Y65F 和 Y65I 对甘氨结合胆盐的水解能力都有所下降， 其中 Y65A 和 Y65I 的下降趋势最明显， Y65I 对 GCDCA 的比酶活比野生 BSH 下降了 70.46%。这三个突 变体对牛磺结合胆盐的水解能力却明显增加， Y65I 的增加趋势最明显， 它对 TDCA 的比酶活 比野生 BSH 增加了。

40、 4 倍多。此外， 这三个突变体对甘氨结合胆盐和牛磺结合胆盐的水解能 力的总体趋势为 ： Y65IY65AY65F。除了 Y65F 外， Y65A 和 Y65I 对甘氨结合胆盐和牛磺结 合胆盐的水解能力与它们的疏水性参数大小 （I(4.5)A(1.8)） 有关。 0093 突变体的底物特异性的结果还表明， 突变体对含有不同类固醇核的底物的水解能 力如下 ： (G/T)CDCA(G/T)DCA(G/T)CA。这可能是因为 CDCA 的 C12 位和 DCA 的 C7 分别比 CA 少了一个羟基， 导致了它们的疏水性强于 CA。且 DCA 缺少的羟基在 C7 位， 离 Tyr65 比较 远， 对它。

41、们之间的相互作用的影响比 CDCA 小。 0094 综上所述， 将 65 位的氨基酸突变为非极性氨基酸时， BSH 对牛磺结合胆盐的水解 能力增强， 而对甘氨结合胆盐的水解能力减弱 ； 且底物的 C7 和 C12 位羟基取代基对酶的底 物特异性也有一定的影响， 为揭示其对底物的结合机制奠定了基础。 0095 可以理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据本发明的技术方案及其发 说 明 书 CN 103992991 A 8 7/7 页 9 明构思加以等同替换或改变， 而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保 护范围。 说 明 书 CN 103992991 A 9 1/4 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103992991 A 10 2/4 页 11 0003 序 列 表 CN 103992991 A 11 3/4 页 12 0004 序 列 表 CN 103992991 A 12 4/4 页 13 序 列 表 CN 103992991 A 13 1/2 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 103992991 A 14 2/2 页 15 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103992991 A 15 。