一种多层结构的复杂组织器官前体的制备方法 【技术领域】
本发明属于生物组织和器官的人工制造技术领域，特别涉及利用合成高分子材料、细胞一基质材料制备组织器官前体的工艺方法，属于生物组织工程技术领域。
背景技术
世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人数逾千万，仅美国每年以外科手术治疗此类病人约800万。然而，活体供体器官有限，现有的机械装置不具备器官的所以功能，不能防止患者的病情进一步恶化。据此，以提高此类疾患治疗水平为宗旨的组织工程(TissueEngineering)技术应运而生。组织工程是一门由生物学、医学、材料学、工程学等多学科交叉产生的高新技术学科。其含义是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物[Merem RM.Med & Biol Eng& Comput.1992；30：8-12]。近十年来，科学家们运用组织工程技术，利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖，获得患者所需的、具有相同功能的器官，又不存在排斥反应，已取可喜的成果，不少新近成立的生物技术公司正准备正在投入巨资实现商品化。在美国，已形成价值40亿美元的产业，并以每年25％的速度递增。如Pro Osteon珊瑚骨移植材料产值超过1000万美元[Miller M，Biotech Bioeng，1996；50：4347-4348]。但现存的组织工程技术面临许多困难和限制，组织工程应用研究所取得的成功均是在那些结构与生理功能较为简单的组织器官如骨骼、软骨、皮肤。传统组织工程方法一般先制备结构支架，在进行细胞培养过程中由于上层细胞消耗大部分的氧气和营养，限制了这些组分向底层扩散，从而限制了细胞向支架深层的迁移等。这种先制备支架，再培养细胞的方法，耗时又费力，细胞在向支架内迁移的过程中很可能就已经变型、老化，达不到及时治疗临床病人的要求。传统的支架制备技术很难形成具有分支贯通的营养供应通道。同时传统的组织工程技术不能满足将不同的细胞在空间准确定位与定点放置，构建复杂组织器官的功能梯度结构的需求。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种复杂组织器官前体的制备方法，旨在前人工作的基础上，利用分步模具/萃取法，实现细胞和支架材料在空间的准确定位，利用模具组合、高分子凝固成形等原理实现复杂组织器官的重建，克服组织工程存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞分布不均匀，细胞很难渗入到深层结构中等缺点，从而达到修复再生的目的。
本发明的技术方案如下：
一种多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
1)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液；
2)将动物体细胞悬浮液与质量百分浓度为10％～30％的天然高分子溶液按1～9∶9～1体积比混合制成细胞基质溶液；
3)将合成高分子溶液罐注到预先设计的内模具中，形成单层合成高分子材料内支架，通过水溶液将内支架中的有机溶剂萃取掉；
4)预先设计好不同直径的中间模具，将至少两个中间模具套在单层合成高分子材料内支架的外部，将细胞基质溶液罐注到内支架和中间模具之间，以及中间模具和中间模具之间的缝隙中，形成细胞基质中间层；再经物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，形成稳定的合成高分子材料内支架与细胞基质中间层的双层结构；
5)将细胞基质中间层的双层结构装入预先设计好的外模具中，再将合成高分子溶液灌入双层结构与外模具的缝隙中，形成外层合成高分子材料层；
6)用细胞培养液萃取外层合成高分子材料层中的溶剂，去除模具，即制成多层结构的复杂组织器官前体。
本发明所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或两种材料的复合物。所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。用于溶解所述合成高分子材料地有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4-二氧六环；用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液。
本发明的技术特征还在于：在细胞基质溶液中还可加入体积百分比为1％～30％的冻存保护剂甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。还可在细胞基质溶液中加入体积百分比为0.001％～0.1％细胞生长因子。如内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子。
本发明所制备的复杂组织器官前体中合成高分子支架材料具备优异的机械性能，可以与体内的管道系统相连接。其中细胞基质溶液具有优异的生物相容性，多种细胞可以在其中形成多种组织。本发明可以实现不同细胞/天然高分子材料与合成高分子支架材料在空间的准确定位，克服了组织工程目前存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长，细胞在支架中分布不均匀，细胞很难渗入到深层结构中等缺点。本发明利用分步模具/萃取法、高分子凝固成形等原理可以达到复杂器官中不同部位不同细胞类型及结构类型的要求，实现复杂组织器官的重建，从而达到修复再生的目的。
【具体实施方式】
本发明提供的一种多层结构的复杂组织器官前体的制备方法，其具体工艺步骤如下：
1)将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为1％～30％的合成高分子溶液；所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或两种材料的复合物；用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4-二氧六环；
2)将动物体细胞悬浮液与质量百分浓度为10％～30％的天然高分子溶液按1～9∶9～1体积比混合制成细胞基质溶液；所述的天然高分子采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的一种或两种以上的复合物；其中所述的明胶与壳聚糖、明胶与纤维蛋白原或明胶与海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖、纤维蛋白原或明胶与海藻酸钠的质量比0.5～100∶1；用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH＝6～8的0.09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液。，
3)将合成高分子溶液罐注到预先设计的内模具中，形成单层人工合成高分子材料内支架，通过水溶液将支架中的有机溶剂萃取掉；
4)预先设计好不同直径的中间模具，将至少两个中间模具套在单层人工合成高分子材料内支架的外部，将细胞基质溶液罐注到内支架和中间模具之间，以及中间模具和中间模具之间的缝隙中，形成细胞基质中间层；再经物理或化学交联方法使细胞基质溶液中的天然高分子交联，利用浓度为0.1～1％的戊二醛溶液、凝血酶、1～20％乳酸钙、氯化钙或三磷酸钠水溶液交联形成，稳定的人工合成高分子材料内支架与细胞基质中间层的双层结构；；
5)将双层结构装入预先设计好的外模具中，再将合成高分子溶液灌入双层结构与外模具的缝隙中，形成外层合成高分子材料层，用细胞培养液萃取外层合成高分子材料层中的溶剂，去除模具，即制成多层结构的复杂组织器官前体。
本发明的优选方案是所述天然高分子溶液中还可加入体积百分比为1％～30％的冻存保护剂甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物，或同时或单独加入体积百分比为0.001％～0.1％细胞生长因子如内皮细胞生长因子、细胞转移因子重量百分比为1％的溶液。
下面通过几个具体的实施例对本发明作进步的说明
实施例1：(1)制备一系列口径不等的圆柱形模具；(2)配备浓度为10％(W/V)的PLGA/四乙二醇(Tetraglycol)溶液，加入1％(W/W)的肝素。在封闭式内模具中注入复合肝素的PLGA/四乙二醇溶液，然后在蒸馏水中萃取溶剂形成PLGA内支架；(3)配制纤维蛋白原溶液，将第一中间模具套在PLGA内支架外部。在第一中间模具与PLGA支架中注入纤维蛋白原/脂肪干细胞混合物(细胞密度为1×105个/mL)，加入肝细胞生长因子(HGF0.5ng/mL)、人血小板衍化生长因子(BB或PDGF-BB 50ng/mL)、转化生长因子β1(TGFβ1 10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF 2.5ng/mL)。把附着PLGA支架的细胞/基质材料置于外模具中，使细胞天然高分子材料分布均匀，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使细胞/天然高分子材料层形成稳定结构；(4)将第二中间模具套在上述双层结构外部，在双层结构与第二中间模具间注入明胶/纤维蛋白原与内皮细胞的混合物，细胞密度为1×107个/mL，用凝血酶溶液(20IU/mL)浸泡成形物2分钟；(5)将外模具套在上述三层结构外部，在三层结构与外模具间注入PLGA/Tetraglycol溶液，然后按照(1)相同的方法成形外层PLGA层，经过PBS萃取后完成人工血管前体的制备。
实施例2：(1)用硅橡胶制备带分支管道的内模具、中间模具及外模具；(2)在内模具中注入5％的聚氨酯/乙二醇溶液，经过PBS萃取形成内支架；(3)将第一中间模具套在PLGA内支架外部，在内支架与第一中间模具中注入含1％紫杉醇的纤维蛋白原/内皮细胞混合物(细胞密度为1×107个/mL)，形成双层结构材料；(4)将第二中间模具套在上述双层结构外部，在第二中间模具与双层结构材料中注入明胶/纤维蛋白原与脂肪干细胞的混合物，细胞密度为1×106个/mL，形成三层结构材料；(5)将第三中间模具套在上述三层结构外部，在第三中间模具与三层结构材料中注入纤维蛋白原/肝细胞混合物(细胞密度为1×107个/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物1分钟，形成四层结构材料；(6)将外模具套在上述三层结构外部，在外模具与四层结构材料间注入5％的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5％的紫杉醇，搅拌均匀，然后按照(1)相同的方法成形外层聚氨酯层，经过PBS萃取后完成可植入型人工肝脏前体的制备。
实施例3：(1)制备一系列口径不等的圆柱形模具；(2)在内模具中注入30％的聚乳酸/异丙醇溶液，经过PBS萃取形成内支架；(3)将第一中间模具套在内支架外部，在内支架与第一模具间注入1％柠檬酸钠的胶原/内皮细胞混合物(细胞密度为1×107个/mL)，37℃下放置10分钟，使胶原/内皮细胞混合物结构稳定，去掉模具；(4)将第二中间模具套在上述内支架外部，在内支架与第一中间模具间注入胶原/内皮细胞混合物；(5)将第三中间模具套在上述在内支架与胶原/内皮细胞混合物双层结构外部，在第三中间模具与双层结构间中注入胶原/平滑肌细胞混合物(细胞密度为1×107个/mL)；37℃下放置10分钟，使胶原/平滑肌细胞混合物结构稳定，去掉模具；(6)将第四中间模具套在上述内支架与胶原/内皮细胞混合物、胶原/平滑肌细胞混合物三层结构外部，并在内支架与胶原/内皮细胞混合物、胶原/平滑肌细胞混合物与第四中间模具间中注入胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞(1∶1)的混合物，细胞密度为1×106个/mL，37℃孵箱中放置10分钟，使其四层材料结构稳定，去掉模具；(7)将外模具套在上述内支架与胶原/内皮细胞混合物、胶原/平滑肌细胞混合及胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞混合物外部，在四层材料与外模具间注入浓度为30％的聚乳酸/异丙醇溶液，加入30％的柠檬酸钠，搅拌均匀，然后按照(1)相同的方法成形外层聚乳酸层，经过PBS萃取后完成可植入型人工心脏前体的制备。
实施例4：(1)用聚四氟乙烯制备带分支管道的内模具、中间模具及外模具，在内模具中间模具间注入30％PU/四乙二醇溶液，经过PBS萃取形成内支架；(2)将第一中间模具套在内支架外部，在内支架及第一中间模具间注入下列溶液。纤维蛋白原和明胶两种天然生物材料分别溶于磷酸缓冲液(PBS)溶液中制成10％和30％的高分子溶液，再按1∶1(v/v)比例混合均匀。然后按体积比加入10％的二甲基亚砜、5％葡聚糖；将脂肪干细胞与肾小球细胞按1∶1比例混合均匀，加入高分子溶液中，得到脂肪干细胞-肾小球细胞-明胶-纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物(细胞密度为1×104个/mL)；在内支架与第一中间模具间注入上述混合物并用凝血酶溶液(30IU/mL)固定2分钟；(3)将第一中间模具套在上述双层结构外部，在双层结构与第一中间模具间注入30％PU/四乙二醇溶液，经过PBS萃取溶剂，形成三层结构；(4)将上述三维结构体在4℃下放置半小时，然后-20℃冰箱中办小时，最后放入-70℃低温冰箱液氮中低温保存，使用时快速复温，培养以备使用。
实施例5：(1)制备一系列口径不等的椭圆形模具，在内模具中注入含3％紫杉醇的30％聚酯/四异二醇溶液，蒸溜水萃取溶剂，形成内支架；(2)将第一中间模具套在内支架外部，在内支架及第一中间模具间注入下列混合物。将纤维蛋白原溶于磷酸缓冲液(PBS)溶液中制成10％高分子溶液。然后按体积比加入体积百分比为20％的甘油、5％葡聚糖；将脂肪干细胞与胰岛细胞按2∶1比例混合均匀，加入高分子混合溶液中(细胞密度为1×107个/mL)，得到脂肪干细胞-胰岛细胞、明胶-纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物；将上述混合物注入到内支架与第一中间模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)固定2分钟，形成双层结构材料；(3)将上述双层材料放入外模具中，注入含3％紫杉醇的30％聚酯/四异二醇溶液，经过蒸溜水萃取溶剂，形成三层结构材料；(4)将三层结构材料在4℃下放置半小时，然后-20℃冰箱中办小时，最后放入-196℃液氮中低温保存，使用时快速复温，加入培养液于37℃、5％CO2条件下培养备用。