一种狂犬病疫苗去除残余DNA的方法 【技术领域】
本发明涉及生物工程领域，具体说，本发明为疫苗生产过程中一种去除残余DNA的方法。
技术背景
目前狂犬病疫苗的提纯一般采用单一的分子筛凝胶层析或者是阴离子和分子筛相结合的方法，这两种方法都存在着一定的缺陷：
采用单一的分子筛凝胶层析方法，由于狂犬病毒分子量大于其它的杂蛋白分子量，洗脱的过程中，在蛋白浓度较低时，狂犬病毒和杂蛋白可以被分开，但是在实际生产的过程中蛋白的含量往往很高，样品粘稠度大，这就使得采用单一分子筛凝胶层析的方法对病毒蛋白的分离效果不佳，难以达到国家现有的质量标准，同时存在着DNA超标的问题，制约了生产规模。
目前也有采用阴离子和分子筛凝胶层析相结合的方法来去除残余DNA的，用硫酸鱼精蛋白来结合样品中残余的DNA，再用不同盐浓度的缓冲液进行梯度洗脱，收获病毒穿透峰，但是发现硫酸鱼精蛋白在结合了DNA的同时也结合了部分病毒糖蛋白，大大降低了抗原的回收率，同时不同的盐浓度和pH对抗原的稳定性也有一定的影响。
本发明就解决了在纯化过程中抗原回收率低和DNA残留量高的问题。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种提纯方法，采用非限制性核酸内切酶对DNA进行降解，结合膜过滤和柱层析技术对狂犬病疫苗进行提纯。从而得到质量更好，纯度更高的狂犬病疫苗，
本发明的目的是这样实现的：
1)在病毒原液、浓缩液或者纯化液中加入1-2000U/ml的非限制性核酸内切酶，(具体加入量可以根据产品残余DNA的量来调整加入的比例，一般一个单位的非限制性核酸内切酶在标准条件下30分钟内可以降解37ug的DNA)，同时加入终浓度为1-10mmol/L的Mg2+化合物做为酶的激活剂，将病毒原液、浓缩液或纯化液置于0-42℃(该酶的最适温度为37℃)中进行DNA的降解来去除残余的DNA。
2)将酶解后的制品用超滤和柱层析的方法进行洗虑、纯化，来去除制品中残余的非限制性核酸内切酶以及降解后的DNA和杂蛋白。
本发明中所应用的非限制性核酸内切酶的特点在于：1)可以降解各种类型的DNA和RNA；2)无蛋白水解酶活性；3)能够在相当宽泛的条件范围内使用；4)具有极高的活性，高达(＞1.0*106Units/mg protein)；5)可以降低细胞裂解液的粘稠度，减少蛋白和核酸的吸附。
本发明的特点在于在浓缩液或纯化液中加入非限制性核酸内切酶，可以有效的降解掉制品中的DNA，而不对其他成分造成任何影响，与现在大多数采用离子交换等方法来去除DNA的相比，本方法不会对抗原造成任何损失和也不会改变抗原的稳定性。
本发明的创新之处在于，采用非限制性核酸内切酶来降解DNA，抗原回收率高，工艺容易放大，DNA去除效果好，同时非限制性核酸内切酶还具有降低样品粘稠度的作用，降低了蛋白的聚合，减轻了柱层析的压力，减少分离纯化的时间，保证疫苗地安全性。
本发明以狂犬病疫苗为实例，同样本发明也适用于其他种类的疫苗及生物制品来去除残余的DNA。
具体实施方式如下
以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本实施例仅采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟知的。或者按照试剂生产商提供的说明书进行。
实施例一
1.用pellicon2系统将病毒收获液进行浓缩和部分杂质的去除。病毒收获液选自采用Celligen Plus生物反应器连续收获的病毒收获液。首先将超滤系统清洗消毒后备用，本实验采用pellicon2超滤系统，膜面积0.5m2，截留分质量300KD，选取30L病毒收获液进行30倍浓缩，浓缩至1L，用β-丙内酯进行病毒灭活。
2.将步骤1所得的浓缩液分成两部分进行实验，编号为①号样品、②号样品，将①号样品采用原始工艺进行单一的超滤纯化，作为实验的对照组，所得浓缩液编号为N-1，纯化液编号为C-1。
3.在②号样品中按50U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为1mmol/L的MgCl2，将样品分别置于4℃、20℃、37℃中进行DNA的降解，每隔1小时进行取样检测DNA残留量，考察时间对降解DNA的影响(如表一所示)，再将酶解后的样品用pellicon2系统以PBS洗虑8个体积，取样检测酶的残留量、抗原含量、蛋白含量及效价，样品编号为N-2。
4.将上面二次洗虑后的浓缩液进行纯化，选用的层析系统为GE公司的AKTAprime Plus，层析柱为XK16/100，柱体积160ml，填料为sepharose 4ff(也可以为sepharose 6ff)，每次上样16ml，用PBS缓冲液进行洗脱，收集吸收峰，样品编号为C-2，取样进行蛋白浓度(lowery)、抗原含量(ELISA)、效价检测(NIH)、酶的残留(ELISA)、DNA残留的检测。结果如表二所示。
表一：37℃酶解时间与DNA残留量的变化
时间 0h 2h 4h 6h DNA残留量(pg) ＞20000 ≤100 ≤10 -
表二：样品①②进行提纯后的对比结果
样品名称 蛋白含量 抗原含量 效价 DNA残留量 酶残留 N-1 31.5mg/ml 67IU/ml 25IU/ml ＞20ng - N-2 27.6mg/ml 78IU/ml 31IU/ml ＜50pg 未检出 C-1 180.2ug/ml 35IU/ml 15IU/ml ＞10ng - C-2(1小时) 170.3ug/ml 43IU/ml 19IU/ml ＜100pg 未检出 C-2(2小时) 165.8ug/ml 39IU/ml 18IU/ml ＜50pg 未检出 C-2(4小时) 167.4ug/ml 40IU/ml 18IU/ml ＜10pg 未检出
从结果可以看出酶不仅对DNA的去除效果十分显著，还起到了降低样品粘稠度的作用，从而使得在层析过程中更容易使抗原蛋白分离出来，提高了杂蛋白的去除率，抗原回收率得到了显著的提高，超滤和层析的结合对酶的去除也十分理想。使得疫苗的纯度更高，更加安全。
另外，可根据产品的特殊需要，也可将酶解反应在低温环境下进行，但在低温环境下需要适当的延长酶解的作用时间，或相应增加酶的加入比例。下表为狂苗浓缩液在4℃和20℃时的酶解效果比较。
4℃
时间 0h 10h 20h 30h 40h DNA残留量(pg) ＞20000 ≤500 ≤100 ≤10 -
20℃
时间 0h 5h 10h 20h 40h DNA残留量(pg) ＞20000 ≤500 ≤100 ≤10 -
实施例二
1.准备10L狂犬病病毒原液，将其成Y-1、Y-2两组进行实验，其中Y-1仍采用原始工艺进行单一的超滤纯化。
2.向Y-2样品中按5U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为2mmol/L的Mg3(PO4)2(为酶提供激活剂Mg2+)，将样品置于20℃中进行DNA的降解。
3.4小时后再将酶解后的样品用pellicon2系统进行浓缩并以PBS洗虑8个体积。
4.将洗虑后的样品采用柱层析的方法进行洗脱，去除样品中的杂蛋白、残余的酶和降解后的DNA。按照实施例一的检测方法取样进行对比。
样品名称 蛋白含量 抗原含量 效价 DNA残留量 酶残留 Y-1 190.3ug/ml 36IU/ml 12IU/ml ＞20ng - Y-2 182.5ug/ml 40IU/ml 13IU/ml ＜50pg 未检出
实施例三
1.用pellicon2系统将病毒收获液进行浓缩和部分杂质的去除。病毒收获液选自采用Celligen Plus生物反应器连续收获的病毒收获液。首先将超滤系统清洗消毒后备用，本实验采用pellicon2超滤系统，膜面积0.5m2，截留分质量300KD，选取30L病毒收获液进行30倍浓缩，浓缩至1L，用β-丙内酯进行病毒灭活。
2.将步骤1得到的样品用柱层析的方法进行纯化，并将其分成两部分进行实验。样品标号为C-1、C-2。
3.向C-2样品中按1500U/ml加入非限制性核酸内切酶，同时向样品中加入终浓度为1.5mmol/L的(CH3COO)2Mg·4H2O(为酶提供激活剂Mg2+)，将样品置于4℃中进行DNA的降解。30小时后取样进行检测对比(方法同实施例一)。
样品名称 蛋白含量 抗原含量 效价 DNA残留量 C-1 197.6ug/ml 39IU/ml 16IU/ml ＞20ng C-2 188.8ug/ml 41IU/ml 17IU/ml ＜10pg
上面虽然以狂犬病疫苗为具体实例对本发明做了详细描述，但应认为，本发明并不局限于狂犬病疫苗。
本实验中的蛋白含量、抗原含量、效价检测项目均按照现行《中华人民共和国药典》2005年版三部以及2010年版的部分修改后的方法进行检查。
DNA检测方法按照中检所现行的方法依法检测。
酶残留检测方法采用非限制性核酸内切酶ELISA检测试剂盒进行定量检测，该试剂盒可以检测到0.2ng/ml的微量非限制性核酸内切酶。也就是说，它的检测精度相当于在其它蛋白浓度高于0.5mg/ml时，检测水平可以达到1ppm。试剂盒同大肠杆菌、毕赤氏酵母、小牛血清、牛血清白蛋白和胎牛血清的交叉副反应的几率小于1％。该试剂盒采用对非限制性核酸内切酶特异性的多克隆抗体(RaB)，并被附于聚苯乙烯微孔板。加入样品后，非限制性核酸内切酶被“捕获”在微孔板上，再加入辣根过氧化物酶(RaB-POD)标记抗体。在每孔加完色原底物TMB后，用0.2MH2SO4终止反应。结果可以在450nm下ELISA检测仪读取。
准备工作：
Buffer l洗脱液：PBS，0.5M NaCl，0.1％Tween20，pH7.2
成分： 0.345g sodium phosphate monobasic，
1.065g sodium phosphate dibasic，
29.22g sodium chloride
1ml Tween 20
溶解于大约800ml双蒸水。调pH至7.2.定容至1000ml。
储存条件：2-8℃
保存时间：8周
Reagent B使用Reagent B(RaB-POD)前，必须用Buffer l以1∶100稀释。
Stop Reagent(终止液) 0.2M H2SO4
Standard Solutions(标准液)reagent A溶于Buffer l，标准液被该混合液分步精确稀释。我们建议至少稀释两步，标准液终浓度应在0.1-25ng/ml。
样品预处理样品至少应用Buffer l以1∶2稀释。稀释液对检测影响可以忽略。
检测过程：(所有操作在室温20-25℃下进行)
第一步“捕获”酶
100ul的样品(参考样品预处理)，标样和对照加入至微孔板，盖上盖子，静置2小时。注意：对照试验必不可少，取100ul的溶解样品溶液，其他操作相同，这样可以确定溶解样品的溶液是否对结果有影响；另外，没有酶的阴性对照也不可或缺。
第二步洗脱
倒置微孔板，倒掉液体。微孔板倒置在多层吸水纸上，并小心敲击以便去除孔内残留的液体。Buffer l加满各孔，1分钟后清空，至少反复三次。
第三步加辣根过氧化物酶标记抗体(RaB-POD)
每孔都加入100ul Reagent B，盖上盖子，静置1小时。
第四步洗脱
按照第二步的方法进行洗脱。
第五步酶显色反应
每孔都加入60ul Reagent C，盖上盖子，避光静置15分钟。
第六步终止反应
每孔都加入140ul终止液，每孔酶显色反应时间必须一致。