高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种PR8重组流感病毒，该重组流感病毒含有H10亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。本发明还公开了上述PR8重组流感病毒的制备方法和应用。本发明通过构建重组质粒、共转染细胞和SPF鸡胚扩增得到的PR8重组流感病毒，能高效表达HA蛋白和/或NA基因，可用于大规模制备流感疫苗。

权利要求书一种PR8重组流感病毒，其特征在于，其含有H10亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变。
一种制备权利要求1所述的PR8重组流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建分别包含H10亚型流感病毒的HA和NA基因的重组质粒；
构建包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒，该PR8病毒突变基因片段选自下述突变的NS或NP基因片段：编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段；
将上述H10亚型流感病毒的HA基因的重组质粒和NA基因的重组质粒，与上述包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒、以及分别包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP或NS内部基因的质粒按相应组合一起转染293T细胞，培养转染后的细胞；
将培养的细胞上清接种于鸡胚，在孵化器内培养合适时间后，收获鸡胚尿囊液，检测该尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且经过序列分析确定没有非预期突变后，即获得PR8重组流感病毒。
权利要求1所述的PR8重组流感病毒在制备流感疫苗中的应用。
一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的PR8重组流感病毒。

说明书高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用
本申请是申请日为2011年9月8日，申请号为201110266082.0，发明名称为“高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及到疫苗的生产领域，具体地，是涉及到一种高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用。
技术领域
流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，高致病性禽流感被国际动物卫生组织确定为A类疫病。流感病毒根据基质蛋白(Matrix protein，M)的不同可以分为A、B、C三型。根据流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原性的差异，又可将流感病毒分为不同的亚型，A型流感病毒根据HA划分为16个亚型，根据NA划分为9个亚型。流感病毒具有高度传染性，可通过飞沫传播，因此它能在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行。1983‑1984年，美国宾州的高致病性禽流感暴发，造成1700万家禽死亡，损失近6500万美元。2003年年底，亚洲多个国家和地区暴发了高致病性的禽流感。禽流感的暴发，使1亿多只家禽死亡或被扑杀，部分国家禽肉产量和销售量急剧下降，价格下跌，禽肉及其制品进出口暂时中止；此外，家禽养殖业、饲料行业和旅游业也都受到不利的影响。据粮农组织估计，由此遭受的损失至少为5亿美元。此外，许多亚型的禽流感病毒具有跨宿主传播至人的能力，因而，该病的暴发也同时危害着社会公共安全。二十世纪爆发了三次流感的大流行，分别是1918年西班牙流感(H1N1)、1957年亚洲流感(H2N2)和1968年香港流感(H3N2)，其中最大规模的流行为西班牙流感。该流感疫病造成全球2000万人的死亡，超过第一次世界大战死亡人数，列全球所有传染病死亡的第一位。
流感病毒的基因组由单股，负义RNA片段组成.。A型流感病毒分为8个片段，编码11种功能蛋白，片段1、2、3分别编码三个聚合酶蛋白PB2、PB1和PA；片段4编码血凝素HA；片段5编码核衣壳蛋白NP；片段6编码神经氨酸酶NA；片段7编码基质蛋白M1和离子通道M2；片段8编码非结构蛋白NS1和NS2。其中HA和NA是流感病毒最主要的两种表面糖蛋白，HA蛋白是流感病毒最重要的保护性抗原。
目前，各国对动物和人流感的预防控制采取了不同的措施，但是疫苗接种仍然是预防流感的最佳选择，因此研制有效的流感疫苗对于控制流感流行具有极其重要的意义。全病毒灭活疫苗是目前应用最广泛的疫苗，该疫苗安全性好，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型流感病毒的攻击。目前已上市的流感疫苗基本都是使用鸡胚培养制备，国内外使用鸡胚培养疫苗已经有50年历史。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的鸡胚，鸡胚带有潜在污染可能，而且培养周期过长，不易于扩大产量，不利于应对大规模的流感爆发。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。为加快细胞培养流感疫苗技术的开发，美国政府决定投资11亿美元资助葛兰素史克、edImmune、诺华、DynPort、Solvay和巴斯德6个主要的流感疫苗开发新技术。在2007年，全球最大的生物制药公司之一诺华宣布其人用流感疫苗Optaflu上市，成为唯一获批(欧盟批准)的人用细胞培养流感疫苗，是50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。
无论采用鸡胚法和大规模细胞制备法获得病毒，重要的影响因素便是疫苗种毒本身是不是高产量的病毒株。A/Puerto Rico/8/34(PR8)是一株鸡胚适应病毒株，是目前在鸡胚上高产株之一，疫苗研制中常常将PR8的6个内部基因与流行毒株的HA和NA基因重组(6+2模式)，将重组病毒作为疫苗株来提高病毒滴度。为了进一步提高PR8的病毒滴度，满足在流感大暴发时，巨大的疫苗需求量，科研人员进行了大量的研究，通过优化病毒基因来提高病毒株产量。研究发现该流感病毒一些蛋白的某个氨基酸位点对该病毒的增殖能力具有重要的影响，如PB2上360位的酪氨酸(Tyr)和NS1上55位的谷氨酸(Glu)也起到一定作用。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种PR8突变重组流感病毒，该重组流感病毒可高效表达HA蛋白，适用于大规模生产流感疫苗。
实现上述目的技术方案如下：
一种PR8重组流感病毒，其含有H1亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变，所述H1亚型流感病毒是除PR8病毒以外的H1亚型流感病毒(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H3亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H4亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H5亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H6亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H7亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H9亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
一种PR8重组流感病毒，其含有H10亚型流感病毒的HA和/或NA基因、含有PR8病毒的6个内部基因(PB1，PB2，PA，NP，M，NS基因)，其中NS和NP基因或二者之一含有以下突变位点：NS基因编码的NS2蛋白上具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变，NP基因编码的NP蛋白上具有G132A点突变(编码具有E67S点突变、或E74S点突变、或E67S/E74S点突变的NS2蛋白的NS基因，以及编码具有G132A点突变的NP蛋白的NP基因，其核酸序列分别如SEQ ID.NO：20‑23所示的核酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID.NO：24‑27所示)。
本发明的另一目的是提供制备上述PR8重组流感病毒的方法。
实现该目的的技术方案如下：
一种制备上述PR8重组流感病毒的方法，包括以下步骤：
构建分别包含H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因的重组质粒；
构建包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒，该PR8病毒突变基因片段选自下述突变的NS或NP基因片段：编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段，编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段；
将上述各亚型流感病毒的HA基因的重组质粒和NA基因的重组质粒，与上述包含PR8病毒突变基因片段的重组质粒、以及分别包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP或NS内部基因的质粒按相应组合一起转染293T细胞，培养转染后的细胞；
将培养的细胞上清接种于鸡胚，在孵化器内培养合适时间后，收获鸡胚尿囊液，检测该尿囊液的血凝性，如果有血凝活性，并且经过序列分析确定没有非预期突变后，即获得PR8重组流感病毒。
在本发明的具体实施例中，制备上述PR8重组流感病毒的方法，包括以下步骤：
(一)、构建重组质粒：
A、获得H1、H3、H4、H5，H6、H7、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因；
获得H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10亚型流感病毒的HA和NA基因的方法为：
分别抽提H1、H3、H4、H5、H6、H9和H10亚型流感病毒的总RNA；
分别以总RNA为模板，反转录合成H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的cDNA；
以获得的cDNA为模板，分别用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14以及SEQ ID.NO：11和SEQ ID.NO：12为上下游引物，分别扩增出H1、H3、H4、H6、H9、H10亚型流感病毒的HA基因和H1、H3、H4、H5、H6、H9、H10亚型流感病毒的NA基因；
以H5亚型流感病毒的cDNA为模板，用突变H5HA碱性裂解位点的引物SEQ ID.NO：15和SEQ ID.NO：13、及引物SEQ ID.NO：16和SEQ ID.NO：14分别扩增，再用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14引物进行PCR融合扩增，获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5N1亚型流感病毒的HA基因；
所述H7亚型流感病毒的HA和NA基因的制备为：人工合成H7亚型流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的HA基因，并用SEQ ID.NO：13和SEQ ID.NO：14和SEQ ID.NO：11和SEQ ID.NO：12为上下游引物，分别进行扩增，分别扩增出H7亚型流感病毒的HA基因和NA基因。
B、分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段；
优选地，所述分别获得编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段的制备为：
以含有PR8病毒NP基因的重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：7和SEQ ID.NO：6以及引物SEQ ID.NO：5和SEQ ID.NO：8在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：7和SEQ ID.NO：8为引物，进行第二次PCR扩增融合，获得点突变G132A的PR8病毒NP基因片段；
以PBD‑PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：2以及引物SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD‑PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及SEQ ID.NO：3和引物SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及引物SEQ ID.NO：3和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；C、制备重组质粒：分别将获得的编码含有G132A点突变的NP蛋白的PR8病毒NP基因片段和编码含有E67S、或E74S、或NS2E67/74S点突变的NS2蛋白的PR8病毒NS基因片段和上述获得的HA和NA基因经过酶切、连接及转化，获得相应的重组质粒；所述重组质粒为以下中的一种以上：PBD‑(H1)HA、PBD‑(H1)NA；PBD‑(H3)HA、PBD‑(H3)NA；PBD‑(H4)HA、PBD‑(H4N2)NA；PBD‑(H5)HA、PBD‑(H5)NA；PBD‑(H6)HA、PBD‑(H6)NA；PBD‑(H7)HA、PBD‑(H7)NA；PBD‑(H9)HA、PBD‑(H9)NA；PBD‑(H10)HA、PBD‑(H10)NA；PBD‑PR8NS‑NS2E67/74S、PBD‑PR8NS‑NS2E67S、PBD‑PR8NS‑NS2E74S、PBD‑PR8NP‑G132A、PBD‑PR8PB1、PBD‑PR8PB2、PBD‑PR8PA、PBD‑PR8NP、PBD‑PR8M、PBD PR8NS(Zejun Li，et al.JVI，2005，79(18)：12058‑12064)。
(二)、制备PR8重组流感病毒：将上述获得的重组质粒按照相应组合，转染于293T细胞；转染后的细胞上清用TPCK‑Trypsin处理后，接种SPF鸡胚，培养；收获鸡胚尿囊液，获得上述的PR8重组流感病毒。
本发明的另一目的是上述PR8重组流感病毒的应用。
具体技术方案如下：
上述任一所述的PR8重组流感病毒在制备流感疫苗中的应用。
本发明的发明人发现当PR8病毒株的NS2蛋白第67位氨基酸由E突变为S(E67S点突变)，或NS2蛋白第74位氨基酸由E突变成S(E74S点突变)，或NS2蛋白第64和74位氨基酸同时由E突变成S(E67S/E74S点突变)，病毒突变株在鸡胚上的增殖能力明显提高。此外，NP蛋白的第132位氨基酸由G突变为A时(G132A点突变)，突变体的病毒株在细胞上的增殖能力明显提高。利用这些高增殖能力突突病毒的内部基因和不同亚型(H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10)流感病毒进行人工重组，获得本发明所述的高效表达HA抗原的重组病毒，这些重组病毒可用于大规模制备流感疫苗。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1重组PR8突变病毒及重组PR8病毒在鸡胚上的血凝活性。
图2重组PR8突变病毒及重组PR8病毒在细胞上的血凝活性。
具体实施方式
实施例1  重组质粒的构建与鉴定
1、引物设计
设计流感病毒PR8的NS和NP的突变引物；流感病毒12bp反转录引物、A型流感的通用引物、H5和H7HA裂解位点突变引物由本实验室设计。上述引物具体的序列见表1(本发明中所用到的引物序列，具体见表1)，均由上海Invitrogen公司合成。
2、两点定点突变
采用两步PCR方法对预期突变氨基酸位点的核苷酸进行突变。首先以PBD‑PR8NP为模板，分别用BSPQI‑NP‑forward和PR8‑NP‑400R以及PR8‑NP‑387F和BSPQI‑NP‑reverse为上下游引物，在Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的作用下分别进行PCR扩增。PCR获得的两个片段，通过胶回收试剂盒回收。以回收的两段PCR产物为模板，以BSPQI‑NP‑forward和BSPQI‑NP‑reverse为引物，进行第二次PCR融合。如此获得编码G132A点突变的NP蛋白的NP基因片段。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min‑1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳实验。
用同样的方法，利用表1中NS2突变引物：PR8‑NS2‑193F、PR8‑NS2‑204R，PR8‑NS2‑215F、PR8‑NS2‑224R和NS基因扩增引物：BSPQI‑NS‑forward和BSPQI‑NS‑reverse分别获得含有NS2 E67S、E74S和NS2E67/74S点突变的NS基因PCR扩增产物。
具体如下：以PBD‑PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：2以及引物SEQ ID.NO：1和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以PBD‑PR8NS重组质粒为模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及SEQ ID.NO：3和引物SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码含有E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段；
以上述的编码含有E67S定点突变NS2蛋白的NS基因片段模板，分别用引物SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：4以及引物SEQ ID.NO：3和SEQ ID.NO：10在Pfx DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增；以两段PCR产物为模板，以SEQ ID.NO：9和SEQ ID.NO：10为引物，进行第二次PCR融合，获得编码同时含有E74S和E74S定点突变NS2蛋白的NS基因片段。
3、HA和NA基因的PCR扩增
HA和NA基因来源于不同亚型的流感病毒(HxNy，代表H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2、H10N8亚型流感病毒)。除H7N7亚型流感外，其他病毒用Trizol(Invitrogen)抽提总RNA。
用反转录试剂盒(TakaRa)，根据其说明书，用12bp引物5′‑AGCAAAAGCAGG‑3′(表1)为特异性引物，合成cDNA第一链。以获得的cDNA的第一链为模板，用BSPQI‑HA‑forward、BSPQI‑HA‑reverse和BSPQI‑NA‑forward、BSPQI‑NA‑reverse为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表1)，分别扩增出片段的H1N1、H3N2、H4N2、H6N4、H9N2、H10N8亚型流感病毒的HA和H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H9N2、H10N8亚型流感病毒的NA基因。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
抽提获得H5N1亚型流感病毒HA基因后，用突变H5HA碱性裂解位点的下游引物H5‑reverse和BSPQI‑HA‑forward、突变碱性裂解位点的上游引物H5‑forward和BSPQI‑HA‑reverse分别进行PCR扩增，再用BSPQI‑HA‑forward、BSPQI‑HA‑reverse引物进行融合PCR。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳验证。获得含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的H5的HA基因。
在本研究中人工合成了H7N7流感病毒的NA基因和含有低致病性禽流感毒株碱性裂解位点的HA基因，并用BSPQI‑HA‑forward、BSPQI‑HA‑reverse和BSPQI‑NA‑forward、BSPQI‑NA‑reverse为上下游引物(含有BspQI酶切位点，如表1)，分别进行了PCR扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入以下循环，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min45s，运行30个循环，最后再72℃延伸10min。反应结束后，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳验证。
4、PCR产物的割胶回收
电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒回收DNA。具体方法如下：在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1.5ml的EP管中，加入3倍凝胶体积(100mg＝100ul体积)的Buffer DE‑A(凝胶液)，混合均匀后于75℃加热，间断混合(2‑3min)，直至凝胶块完全熔化(约6‑8min)。加入0.5个Buffer DE‑A体积的Buffer DE‑B(结合液)，混合均匀；当回收的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。将混合液转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，倒掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入500ul Buffer W1(洗涤液)，12000×g离心30s，弃掉收集管中的废液。将制备管置回收集管中，加入700ul Buffer W2(去盐液)，12000×g离心1min，弃掉收集管中的废液，以同样的方法再洗一次。将制备管置回收集管中，12000×g空离1min。最后将制备管置于洁净的1.5ml EP管中，在制备膜中央加入30ul的去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA，置于‑20℃保存备用。
5、酶切、连接及转化
上述PCR纯化产物与PBD载体(Zejun Li，et al.JVI，2005，79(18)：12058‑12064)分别用BSPQI限制性内切酶进行消化，用胶回收试剂盒回收目的片段与PBD质粒的酶切产物，然后用T4连接酶将酶切后的PCR产物与酶切处理的PBD载体进行连接。连接产物转化于感受态细胞JM109(上海索莱生物科技有限公司)，无菌条件下涂布于含Amp的LB固体培养基上，37℃培养8‑20h。
6、重组质粒的鉴定
挑取LB固体培养基上的单个菌落，放入加有约3ml含Amp的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养10h。将菌液用碱性抽提法抽提的质粒，用PCR方法进行验证。鉴定为阳性的质粒进行序列测定，用DNAstar序列分析软件进行序列分析，确定序列正确无误。分别如SEQID.NO：20‑23所示的核酸序列，或其氨基酸序列为SEQ ID.NO：24‑27。此外，各个亚型的HA和NA基因的序列经核实也是正确的。
表1  NS2、NP基因的定点突变引物和A型流感病毒通用引物


实施例2  重组PR8突变病毒的拯救
1、转染质粒准备
用超纯抽提试剂盒(OMEGA)提取上述方法构建的重组质粒，包括：PBD‑(H1)HA、PBD‑(H1)NA；PBD‑(H3)HA、PBD‑(H3)NA；PBD‑(H4)HA、PBD‑(H4)NA；PBD‑(H5)HA、PBD‑(H5)NA；PBD‑(H6)HA、PBD‑(H6)NA；PBD‑(H7)HA、PBD‑(H7)NA；PBD‑(H9)HA、PBD‑(H9)NA；PBD‑(H10)HA、PBD‑(H10)NA；PBD‑PR8NS‑NS2E67/74S、PBD‑PR8NS‑NS2E67S、PBD‑PR8NS‑NS2E74S、PBD‑PR8NP‑G132A、PBD‑PR8PB1、PBD‑PR8PB2、PBD‑PR8PA、PBD‑PR8NP、PBD‑PR8M、PBD PR8NS，并测定质粒浓度。
2、拯救获得重组PR8突变病毒
将上述质粒按照设计好的组合，利用脂质体2000共转染于293T细胞。转染后6h，弃去细胞上清，加入2ml OPTI‑MEM，置于37℃的CO2培养箱中培养72h。转染后的细胞上清用TPCK‑Trypsin处理后，接种于9‑11日龄SPF鸡胚(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，用石蜡封口后置于37℃孵化器内继续孵化。48‑72h后放入4℃过夜，取出，收获鸡胚尿囊液。尿囊液用血凝试验测定有无凝集活性。
本发明拯救获得了含H1亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H1N1‑PR8(简称1‑PR8)，H1N1‑PR8‑NS2E67S(简称1‑67)，H1N1‑PR8‑NS2E74S(简称1‑74)，H1N1‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称1‑67/74)，H1N1‑PR8‑NP‑G132A(简称1‑132)和H1N1‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称1‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H3亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H3N2‑PR8(简称3‑PR8)，H3N2‑PR8‑NS2E67S(简称3‑67)，H3N2‑PR8‑NS2E74S(简称3‑74)，H3N2‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称3‑67/74)，H3N2‑PR8‑NPG132A(简称3‑132)和H3N2‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称3‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H4亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H4N2‑PR8(简称4‑PR8)，H4N2‑PR8‑NS2E67S(简称4‑67)，H4N2‑PR8‑NS2E74S(简称4‑74)，H4N2‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称4‑67/74)，H4N2‑PR8‑NPG132A(简称4‑132)和H4N2‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称4‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H5亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H5N1‑PR8(简称5‑PR8)，H5N1‑PR8‑NS2E67S(简称5‑67)，H5N1‑PR8‑NS2E74S(简称5‑74)，H5N1‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称5‑67/74)，H5N1‑PR8‑NPG132A(简称5‑132)和H5N1‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称5‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H6亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H6N4‑PR8(简称6‑PR8)，H6N4‑PR8‑NS2E67S(简称6‑67)，H6N4‑PR8‑NS2E74S(简称6‑74)，H6N4‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称6‑67/74)，H6N4‑PR8‑NPG132A(简称6‑132)和H6N4‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称6‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H7亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H7N7‑PR8(简称7‑PR8)，H7N7‑PR8‑NS2E67S(简称7‑67)，H7N7‑PR8‑NS2E74S(简称7‑74)，H7N7‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称7‑67/74)，H7N7‑PR8‑NPG132A(简称7‑132)和H7N7‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称7‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H9亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H9N2‑PR8(简称9‑PR8)，H9N2‑PR8‑NS2E67S(简称9‑67)，H9N2‑PR8‑NS2E74S(简称9‑74)，H9N2‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称9‑67/74)，H9N2‑PR8‑NP132A(简称9‑132)和H9N2‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称9‑132/67/74)。
本发明拯救获得了含H10亚型流感病毒的HA和NA基因的PR8重组病毒和PR8突变重组病毒：H10N8‑PR8(简称10‑PR8)，H10N8‑PR8‑NS2E67S(简称10‑67)，H10N8‑PR8‑NS2E74S(简称10‑74)，H10N8‑PR8‑NS2E67S/E74S(简称10‑67/74)，H10N8‑PR8NP‑G132A(简称10‑132)和H10N8‑PR8‑NPG132A‑NS2E67S/E74S(简称10‑132/67/74)。
v3、重组病毒的鉴定
用Trizol抽提重组病毒的尿囊液总RNA，并用12bp引物反转录，获得cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，用BSPQI‑HA‑forward和BSPQI‑HA‑reverse、BSPQI‑NA‑forward和BSPQI‑NA‑reverse、BSPQI‑NP‑forward和BSPQI‑NP‑reverse、BSPQI‑NS‑forward、BSPQI‑NS‑reverse为上下游引物，用PCR的方法分别扩增HA、NA、NP、和NS片段，将这些PCR产物纯化后测序，测序结果证实重组PR8突变病毒所含的片段皆为预期的，没有发现非预期突变。
实施例3  救获的重组病毒生长特性鉴定
1、救获的重组病毒EID50测定
含病毒的鸡胚尿囊液按照10倍倍比稀释，将10‑5～10‑9各稀释度分别接种到3枚9‑11日龄的SPF鸡胚中，37℃继续孵化48h。通过测定感染胚尿囊液的血凝活性来判断其是否感染，利用Reed‑Muench法计算EID50(鸡胚半数感染量)。重组病毒EID50测定结果如表2所示(其中，病毒稀释液体积为100ul)。
表2  重组病毒株的EID50


2、救获的重组病毒TCID50测定
从1∶10‑2开始10倍稀释，把不同稀释度的重组病毒接毒于长满单层MDCK细胞的48孔板中，接毒的过程如下：先用PBS清洗MDCK细胞两遍，然后在每一孔加入100ul病毒，每个稀释度做3个重复，把48孔板放入37℃ CO2培养箱让病毒吸附到细胞上，每隔20min摇晃一次培养板，1.5h‑2h后把细胞培养板中的液体弃掉，用PBS清洗细胞两次，然后加入含有TPCK‑Trypsin的无血清培养基300ul，细胞在CO2培养箱继续培养72h，然后测定每一个孔的血凝活性，利用Reed‑Muench法计算TCID50(组织细胞半数感染量)。重组病毒TCID50测定结果如表3所示(其中，病毒稀释液体积为100ul)。
表3  重组病毒株的TCID50

3、救获的重组病毒在鸡胚上生长特性比较
将含有100EID50的重组病毒稀释液100ul接种9‑11日龄的SPF鸡胚，在接毒后6h，12h，24h，36h，48h时，分别取出3枚，收集尿囊液并测定它们的血凝效价。不同亚型重组病毒在鸡胚上增殖后的血凝滴度呈现相似的结果，接毒后12小时以内接种病毒鸡胚的尿囊液均没有血凝性，24‑48h，含突变病毒PR8‑NS2‑E67/74S的六个内部基因的重组病毒(HxNy‑PR8‑NS2‑E67S/E74S，简称x‑67/74)的血凝效价最高，其他重组病毒血凝效价由高到低依次是：含突变病毒PR8‑NS2‑E67S的六个内部基因的重组病毒(HxNy‑PR8‑NS2‑E67S，简称x‑67)，含PR8‑NS2‑E74S的六个内部基因的重组病毒(HxNy‑PR8‑NS2‑E74S，简称x‑74)，含PR8病毒六个内部基因的重组病毒(HxNy‑PR8简称x‑PR8)，含有PR8‑NP‑G132A的六个内部基因的重组病毒(HxNy‑PR8‑NP‑G132A，简称x‑132)，含有PR8‑NP‑G132A‑NS2‑E67S/E74S的六个内部基因的重组病毒(HxNy‑PR8‑NP‑G132A‑NS2‑E67S/E74S简称x‑132/67/74)。如图1所示，以H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2和H10N8亚型重组病毒，直观地展示了上述结果。
4、救获的重组病毒和PR8在MDCK细胞上生长特性的比较
将含有100TCID50的重组病毒稀释液200ul，接种T25细胞培养瓶中的MDCK细胞。在接毒后6h，12h，24h，36h，48h时，分别收集其细胞上清并测定血凝效价，比较重组病毒在MDCK细胞上的生长情况。不同亚型重组病毒在细胞上增殖后的血凝滴度呈现相似的结果，接毒后12h以内，重组病毒感染细胞上清均无血凝活性。在接毒后24h，36h和48h，含有PR8‑NP‑G132A的六个内部基因的重组病毒(x‑132)血凝价最高，其他重组病毒血凝效价由高到低依次是：含有PR8‑NP‑G132A‑NS2‑E67S/E74S的六个内部基因的重组病毒(x‑132/67/74)、含PR8病毒六个内部基因的重组病毒(x‑PR8)、含突变病毒PR8‑NS2‑E67/74S的六个内部基因的重组病毒(x‑67/74)、含突变病毒PR8‑NS2‑E67S的六个内部基因的重组病毒(x‑67)和含PR8‑NS2‑E74S的六个内部基因的重组病毒(x‑74)。如图2所示，以H1N1、H3N2、H4N2、H5N1、H6N4、H7N7、H9N2和H10N8亚型重组病毒，直观地展示了上述结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所
<120>高效表达HA蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tggcggtcac aattaggtca         20
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ttgtgaccgc catttctcgt ttct    24
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
agttttcaga aataagatgg tt      22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tctgaaaact tctgacctaa tt      22
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aacggctgca ctgactcaca tgat    24
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tcagtgcagc cgttgcatcg tcacca                   26
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cacacagctc ttcggccagc aaaagcaggg ta            32
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cacacagctc ttctattagt agaaacaagg gtattttt      38
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cacacagctc ttctattagc aaaagcaggg tg            32
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg gtgtttt       37
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cacacagctc ttctattagc aaaagcagga gt          32
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg agtttttt    38
<210>13
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
cacacagctc ttctattagc aaaagcaggg g           31
<210>14
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
cacacagctc ttcggccagt agaaacaagg gtgtttt     37
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tagtcctctt ctctctcctt g                      21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
caaggagaga gaagaggact a                      21
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cgaaatccca ggcctatttg gt    22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
accaaatagg cctgggattt cg    22
<210>19
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
agcaaaagca gg               12
<210>20
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(199)..(201)
<400>20
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag     60
ttggagtcct catcggagga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc    120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac    180
agaaacgaga aatggcggtc acaattaggt cagaagtttg aagaaataag atggttgatt    240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg    300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt    360
atttag                                                               366
<210>21
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(220)..(222)
<400>21
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag     60
ttggagtcct catcggagga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc    120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac    180
agaaacgaga aatggcggga acaattaggt cagaagtttt cagaaataag atggttgatt    240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg    300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt    360
atttag                                                               366
<210>22
<211>366
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(199)..(201)
<220>
<221>mutation
<222>(220)..(222)
<400>22
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gacatactgc tgaggatgtc aaaaatgcag     60
ttggagtcct catcggagga cttgaatgga atgataacac agttcgagtc tctgaaactc    120
tacagagatt cgcttggaga agcagtaatg agaatgggag acctccactc actccaaaac    180
agaaacgaga aatggcggtc acaattaggt cagaagtttt cagaaataag atggttgatt    240
gaagaagtga gacacaaact gaagataaca gagaatagtt ttgagcaaat aacatttatg    300
caagccttac atctattgct tgaagtggag caagagataa gaactttctc gtttcagctt    360
atttag                                                               366
<210>23
<211>1497
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(394)..(396)
<400>23
atggcgtccc aaggcaccaa acggtcttac gaacagatgg agactgatgg agaacgccag     60
aatgccactg aaatcagagc atccgtcgga aaaatgattg gtggaattgg acgattctac    120
atccaaatgt gcacagaact taaactcagt gattatgagg gacggttgat ccaaaacagc    180
ttaacaatag agagaatggt gctctctgct tttgacgaaa ggagaaataa atacctggaa    240
gaacatccca gtgcggggaa ggatcctaag aaaactggag gacctatata cagaagagta    300
aacggaaagt ggatgagaga actcatcctt tatgacaaag aagaaataag gcgaatctgg    360
cgccaagcta ataatggtga cgatgcaacg gctgcactga ctcacatgat gatctggcat    420
tccaatttga atgatgcaac ttatcagagg acaagggctc ttgttcgcac cggaatggat    480
cccaggatgt gctctctgat gcaaggttca actctcccta ggaggtctgg agccgcaggt    540
gctgcagtca aaggagttgg aacaatggtg atggaattgg tcaggatgat caaacgtggg    600
atcaatgatc ggaacttctg gaggggtgag aatggacgaa aaacaagaat tgcttatgaa    660
agaatgtgca acattctcaa agggaaattt caaactgctg cacaaaaagc aatgatggat    720
caagtgagag agagccggga cccagggaat gctgagttcg aagatctcac ttttctagca    780
cggtctgcac tcatattgag agggtcggtt gctcacaagt cctgcctgcc tgcctgtgtg    840
tatggacctg ccgtagccag tgggtacgac tttgaaagag agggatactc tctagtcgga    900
atagaccctt tcagactgct tcaaaacagc caagtgtaca gcctaatcag accaaatgag    960
aatccagcac acaagagtca actggtgtgg atggcatgcc attctgccgc atttgaagat   1020
ctaagagtat tgagcttcat caaagggacg aaggtggtcc caagagggaa gctttccact   1080
agaggagttc aaattgcttc caatgaaaat atggagacta tggaatcaag tacacttgaa   1140
ctgagaagca ggtactgggc cataaggacc agaagtggag gaaacaccaa tcaacagagg   1200
gcatctgcgg gccaaatcag catacaacct acgttctcag tacagagaaa tctccctttt   1260
gacagaacaa ccgttatggc agcattcact gggaatacag aggggagaac atctgacatg   1320
aggaccgaaa tcataaggat gatggaaagt gcaagaccag aagatgtgtc tttccagggg   1380
cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcagcgagcc cgatcgtgcc ttcctttgac   1440
atgagtaatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtacga caattaa      1497
<210>24
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(67)..(67)
<400>24
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met
1               5                   10                  15
Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile
            20                  25                  30
Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala
        35                  40                  45
Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys
    50                  55                  60
Trp Arg Ser Gln Leu Gly Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile
65                  70                  75                  80
Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
            100                 105                 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
        115                 120
<210>25
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(74)..(74)
<400>25
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met
1               5                   10                  15
Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile
            20                  25                  30
Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala
        35                  40                  45
Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys
    50                  55                  60
Trp Arg Glu Gln Leu Gly Gln Lys Phe Ser Glu Ile Arg Trp Leu Ile
65                  70                  75                  80
Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
            100                 105                 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
        115                 120
<210>26
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(67)..(67)
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(74)..(74)
<400>26
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Leu Arg Met
1               5                   10                  15
Ser Lys Met Gln Leu Glu Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Met Ile
            20                  25                  30
Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala
        35                  40                  45
Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Asn Arg Asn Glu Lys
    50                  55                  60
Trp Arg Ser Gln Leu Gly Gln Lys Phe Ser Glu Ile Arg Trp Leu Ile
65                  70                  75                  80
Glu Glu Val Arg His Lys Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu His Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu
            100                 105                 110
Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile
        115                 120
<210>27
<211>498
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MUTAGEN
<222>(132)..(132)
<400>27
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1               5                   10                  15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
            20                  25                  30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
        35                  40                  45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
    50                  55                  60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65                  70                  75                  80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
                85                  90                  95
Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
            100                 105                 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
        115                 120                 125
Ala Thr Ala Ala Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
    130                 135                 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145                 150                 155                 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
                165                 170                 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
            180                 185                 190
Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
        195                 200                 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
    210                 215                 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp
225                 230                 235                 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asp Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu
                245                 250                 255
Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
            260                 265                 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
        275                 280                 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
    290                 295                 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305                 310                 315                 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
                325                 330                 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val
            340                 345                 350
Val Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
        355                 360                 365
Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
    370                 375                 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385                 390                 395                 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
                405                 410                 415
Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Val Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn
            420                 425                 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
        435                 440                 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
    450                 455                 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465                 470                 475                 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
                485                 490                 495
Asp Asn