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1、(10)申请公布号 CN 102864181 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864181 A *CN102864181A* (21)申请号 201210311913.6 (22)申请日 2012.08.29 C12P 7/46(2006.01) C12R 1/67(2006.01) (71)申请人 太仓市茂通化建有限公司 地址 215400 江苏省苏州市太仓市城厢镇伟 阳村 (72)发明人 金雅新 (74)专利代理机构 江苏致邦律师事务所 32230 代理人 徐蓓 (54) 发明名称 一种利用黄曲霉发酵 L- 苹果酸的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种利用黄曲霉。
2、发酵 L- 苹果 酸的方法， 本发明以黄曲霉为出发菌株， 研究了碳 源、 氮源、 温度、 CaCO3对菌株 L- 苹果酸发酵的影 响。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种利用黄曲霉发酵 L- 苹果酸的方法， 其特征在于发酵时， 500 mL 三角瓶中放入 100 mL 发酵培养基， 接入 10% 的孢子悬液， 加入一定量的 CaCO3， 在一定温度下， 以一定转速 的培养。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在。
3、于， 发酵培养基 ： 一定量碳源、 一定量氮源、 KH2PO4 0.01%、 K2HPO4 0.05%、 MgSO47H2O 0.01%、 CaCl2 2H 2O 0.01%、 FeSO47H2O 0.05%、 MnSO4 0.01%、 NaC1 510-6% ； pH 自然。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 孢子悬液的制备过程为 ： 将黄曲霉菌株斜 面菌种接入种子培养基， 30， 200 rpm 培养 30 h。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 种子培养基 ： 葡萄糖10%、 (NH4)2SO4 0.2%、 KH2PO4 0.01%、 K2HPO4 0.05。
4、%、 MgSO47H2O 0.01%、 CaCl2 2H 2O 0.01%、 FeSO47H2O 0.05%、 MnSO4 0.01%、 NaC1 510-6%。 5. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 碳源为葡萄糖。 6. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 氮源为 (NH4)2SO4。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 发酵温度为 32。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， CaCO3浓度为 40 g/L。 权 利 要 求 书 CN 102864181 A 2 1/3 页 3 一种利用黄曲霉发酵 L- 苹果酸的方法 技术领域 0001。
5、 本发明属于发酵技术领域， 具体涉及一种利用黄曲霉发酵 L- 苹果酸的方法。 背景技术 0002 苹果酸， 又名羟基琥珀酸或羟基丁二酸， 分子式为 C4H6O5， 分子量 134.09， 结构式 为 HOOCCHOHCH2COOH。主要有三种苹果酸 ：L- 型苹果酸， 比较广泛的存在于自然界中， 密 度 1.595， 熔点 100， 分解点 140， 比旋光度 -2.3（8.5 克 /100 毫升水） ， 易溶于水、 甲醇、 丙酮等， 不溶于苯 ； 而D- 型苹果酸和DL- 混合型苹果酸则主要为化学合成， 前者密度 1.595， 熔点 101， 分解点 140， 比旋光度 +2.92（甲醇） 。
6、， 溶于水、 甲醇、 乙醇、 丙酮。等 量的左旋体和右旋体混合得外消旋体， 密度 1.601， 熔点 131-132， 分解点 150； 溶于水、 甲醇、 乙醇、 丙酮等， 不溶于苯。由于L- 苹果酸分子中含有羟基和羧基， 因此对极性溶剂的 溶解度大， 化学性质较为活泼。在常温下它极易溶于乙醇及乙醚中， 在水中其溶解度随水 温的升高而增大， 呈强酸性。其酸性随浓度的升高而增加， 可进行两步解离 （K1=3.910-4， K2=7.510-6） 。 0003 L- 苹果酸是生物体代谢过程 TCA 循环中产生的一种重要有机酸， 作为优良的 酸味剂和保鲜剂， 在食品、 医药、 化工、 日化和保健等领。
7、域具有广泛用途。由于L- 苹果酸口 感接近天然苹果的酸味， 且与柠檬酸相比具有酸度大、 味道柔和、 滞留时间长等特点， 具有 特殊的香味并且不损伤口腔和牙齿等特点， 已被广泛用于高档饮料、 食品等行业。 有研究表 明，L-苹果酸有可能替代柠檬酸成为新一代食品添加。 苹果酸与柠檬酸配合使用， 可以模拟 天然果实的酸味特征， 使口感更自然、 协调、 丰满。清凉饮料、 粉末饮料、 乳酸饮料、 乳饮料、 果汁饮料中均可添加苹果酸改善其口感和风味， 苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴 甜 (ASPARTME) 配合使用， 作为软饮料的风味固定剂。也可用作天然果子露保色剂、 蛋黄酱 乳稳定剂、 果酱调整。
8、剂、 甜味辅助剂、 酵母生长促进剂等。在欧美各国及日本的食品饮料生 产中， 苹果酸已成为不可缺少的基本原料之一。目前， 美国年消耗在 1500 万磅以上， 其中 90% 用于食品和饮料加工。另外 ， 苹果酸可形成许多衍生物， 日本近几年已成功地将苹果 酸盐应用于减糖、 减盐食品中， 应用苹果酸某些盐类代替食盐浸渍咸菜时， 其咸味仅有食盐 1/5- 1/7 情况下， 而浸渍效果却是食盐的两倍， 同时可以做为肾炎患者的食盐代用品 ； 在 豆浆中添加苹果酸钙盐， 可有效地改善其口感和风味 ； 利用苹果酸的抗疲劳、 护肝、 肾、 心脏 作用可以开发保健饮料。食品中添加L-苹果酸可使 pH 得到调整， 。
9、加上其本身所具有的抗 菌作用，L-苹果酸亦被广泛应用于其他食品工业， 如用作水产品的保鲜剂等。 0004 苹果酸的生产方法主要有化学合成法、 发酵法、 转化法。 化学合成法生产的苹果酸 在应用上受到限制。转化法主要是固定化酶和固定化细胞转化。20 世纪 80 年代末以来， 对转化工艺的研究获得突破， 并成功地应用于工业化生产。而发酵法生产苹果酸的研究还 未有重大进展， 非糖质原料发酵法尚处于实验室水平。 糖质原料发酵法工艺中， 一步发酵法 和混合发酵法都有较大进展， 但有关的研究报道尚少。而混合发酵法由于涉及到两种微生 物， 培养条件要求比较严格， 发酵周期较长， 产酸率较低， 副产物较多。因。
10、此， 本发明采用米 说 明 书 CN 102864181 A 3 2/3 页 4 曲霉发酵糖质原料生产苹果酸， 通过对发酵温度、 接种量、 起始糖浓度及碳酸钙加入量的优 化， 以淀粉水解液为原料， 其产酸水平最高可达 90 g/L。 发明内容 0005 本发明提供了一种利用黄曲霉发酵 L- 苹果酸的方法， 本发明以黄曲霉为出发菌 株， 研究了碳源、 氮源、 温度、 CaCO3对菌株 L- 苹果酸发酵的影响。 0006 一种利用黄曲霉发酵L-苹果酸的方法， 其特征在于发酵时， 500 mL 三角瓶中放入 100 mL 发酵培养基， 接入 10% 的孢子悬液， 加入一定量的 CaCO3， 在一定温。
11、度下， 以一定转速 的培养。 0007 步骤 1 所述的发酵培养基 （%） ： 一定量碳源、 一定量氮源、 KH2PO4 0.01、 K2HPO4 0.05、 MgSO47H2O 0.01、 CaCl2 2H 2O 0.01、 FeSO47H2O 0.05、 MnSO4 0.01、 NaC1 510-6。 pH 自然。 0008 步骤 1 所述的孢子悬液的制备过程为 ： 将黄曲霉菌株斜面菌种接入种子培养基， 30， 200 rpm 培养 30 h。 0009 步骤 3 所述的种子培养基 （%） ： 葡萄糖 10、 (NH4)2SO4 0.2、 KH2PO4 0.01、 K2HPO4 0.05、。
12、 MgSO47H2O 0.01、 CaCl2 2H 2O 0.01、 FeSO47H2O 0.05、 MnSO4 0.01、 NaC1 510-6。 0010 步骤 2 所述的最佳碳源为葡萄糖。 0011 步骤 2 所述的最佳氮源为 (NH4)2SO4。 0012 步骤 1 所述的最佳发酵温度为 32。 0013 步骤 1 所述的最佳 CaCO3浓度为 40 g/L。 0014 本发明的有益效果在于 ： 本发明所用的菌株黄曲霉属于发酵糖质原料的 L- 苹果 酸产生菌。由于糖质原料价格相对低廉， 因此， 在发酵法生产 L- 苹果酸中糖质原料发酵工 艺具有重要的经济地位。 附图说明 0015 图 。
13、1 不同温度对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响。 具体实施方式 0016 下面的实施例对本发明作详细说明， 但对本发明没有限制。 0017 本发明所用的菌株为黄曲霉， 购买于 ACCC， 编号为 ： ACCC31913。 0018 实施例 1 本实施案例说明不同碳源对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响， 分别添加淀粉、 葡萄 糖、 麦芽糖、 蔗糖、 果糖、 甘露醇和山梨醇做碳源， 温度30， 250 r/min转速下， 发酵6 d。 结 果如表 1 所示。 0019 由表 1 可见， 除山梨糖外， 各类糖类都能作为较好的碳源， 其中以葡萄糖作为碳 源， 其产酸量最高。 0020 表 1 不同。
14、碳源对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响 碳源种类浓度 （g/L）残糖 (g/L)L- 苹果酸 （g/L） 淀粉6013.432.5 葡萄糖607.640.8 说 明 书 CN 102864181 A 4 3/3 页 5 麦芽糖6014.231.1 蔗糖6034.524.1 果糖6018.926.8 甘露醇6046.87.8 山梨醇6056.42.5 实施例 2 本实施案例说明不同氮源对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响， 分别添加氯化铵 1 g/ L， 硝酸铵 1 g/L， 尿素 1 g/L， 硫酸铵 1 g/L， 硝酸钠 1 g/L， 蛋白胨 5 g/L， 玉米浆 5 g/L， 豆 饼粉 。
15、5 g/L， 添加 60 g/L 的葡萄糖， 温度 30， 250 r/min 转速下， 发酵 6 d。结果如表 2 所 示。 0021 由表 2 可知， 采用硫酸铵、 尿素和豆饼粉产酸效果较好， 从成本上考虑选用硫酸铵 为最佳氮源。 0022 表 2 不同氮源对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响 氮源种类浓度 （g/L）残糖 (g/L)L- 苹果酸 （g/L） 氯化铵123.432.5 硝酸铵122.429.6 尿素114.237.6 硫酸铵110.242.4 硝酸铵118.926.8 蛋白胨523.626.3 玉米浆522.826.7 豆饼粉516.538.6 实施例 3 本实施案例说明不。
16、同温度对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响， 温度分别为 ： 24， 26， 28， 30， 32， 34， 添加60 g/L的葡萄糖和1 g/L的硫酸铵， 250 r/min转速下， 发酵 6 d。结果如图 1 所示。 0023 由图 1 可知， 温度在 32以前 L- 苹果酸的产量随着温度的升高而增加， 温度在 34时开始下降， 故选取最佳发酵温度为 32。 0024 实施例 4 本实施案例说明不同碳酸钙添加量对黄曲霉生产 L- 苹果酸产量的影响， 在发酵中碳 酸钙会和生成的苹果酸反应生成难溶的苹果酸钙， 从而达到减弱对关键酶的反馈抑制， 使 代谢向着生成和积累苹果酸的方向进行。同时， L。
17、- 苹果酸与碳酸钙反应放出 CO2， 为 CO2固 定支路提供 CO2， 利于 L- 苹果酸的生成。因此， 培养基中 CaCO3 的存在是 L- 苹果酸有效积 累的必要条件。结果见表 3 所示。 0025 由表 3 所示， 当碳酸钙浓度为 40 g/L 时， L- 苹果酸的产量最高为 43.7 g/L， 残糖 最低为 6.7 g/L。故选择碳酸钙添加浓度为 40 g/L。 0026 表 3 碳酸钙 （g/L）L- 苹果酸 （g/L）残糖 （g/L） 04.6745.3 1013.636.2 2028.724.3 3032.820.8 4043.76.7 5040.110.3 说 明 书 CN 102864181 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102864181 A 6 。