登革病毒通用序列及其使用方法.pdf

本文公开了计算优化的广泛反应性的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的登革病毒E多肽序列。还公开了与分子佐剂P28融合的登革病毒E蛋白片段（例如E蛋白胞外结构域和DIII结构域）。所公开的核酸和多肽序列可作为疫苗，用于对登革病毒感染的免疫。在一些情况下，所述疫苗包括含有所述通用的登革病毒E蛋白或其片段的病毒样颗粒，或者所述疫苗是编码VLP的DNA分子。

权利要求书一种分离的核酸分子，包含编码登革病毒E蛋白或其片段的核苷酸序列，其中：
（a）编码登革病毒E蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7有至少99%的同一性；或者编码登革病毒E蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的4‑1488位核苷酸、SEQ ID NO:3的4‑1488位核苷酸、SEQ ID NO:5的4‑1491位核苷酸、SEQ ID NO:7的4‑1488位核苷酸有至少99%的同一性；
（b）所述片段包含所述E蛋白胞外结构域，并且编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的1‑1194位核苷酸、SEQ IDNO:3的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的1‑1188位核苷酸、SEQ IDNO:7的1‑1194位核苷酸有至少99%的同一性；或者编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的4‑1194位核苷酸、SEQ IDNO:3的4‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的4‑1188位核苷酸、SEQ IDNO:7的4‑1194位核苷酸有至少99%的同一性；或者
（c）所述片段包含所述E蛋白的DIII结构域，并且编码所述DIII结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19有至少99%的同一性。
权利要求1的分离的核酸分子，其中编码所述E蛋白的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。
权利要求1的分离的核酸分子，其中编码所述E蛋白的核苷酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7组成。
权利要求1的分离的核酸分子，其中所述编码E蛋白胞外结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:3的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的1‑1188位核苷酸或SEQ ID NO:7的1‑1194位核苷酸。
权利要求1的分离的核酸分子，其中编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列由SEQ ID NO:1的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:3的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的1‑1188位核苷酸或SEQ ID NO:7的1‑1194位核苷酸组成。
权利要求1（b）的分离的核酸分子，其还包含编码补体蛋白C3d的P28区的核苷酸序列。
权利要求6的分离的核酸分子，其中所述补体蛋白C3d的P28区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:21。
权利要求1的分离的核酸分子，其中编码所述DIII结构域的核苷酸序列包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQID NO:19。
权利要求1的分离的核酸分子，其中编码所述DIII结构域的核苷酸序列由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:19组成。
权利要求1（c）的分离的核酸分子，还包含编码补体蛋白C3d的P28区的核苷酸序列。
权利要求10的分离的核酸分子，其中所述补体蛋白C3d的P28区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:21。
权利要求1的核酸分子编码的登革病毒E蛋白或其片段。
含有权利要求1的分离的核酸分子的载体。
权利要求13的载体，还包含与编码所述E蛋白或其片段的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
权利要求13的载体，还包含编码登革病毒prM蛋白的核酸序列。
一种登革病毒E蛋白或其片段，由用权利要求13的载体转染宿主细胞在足以允许所述蛋白表达的条件下产生。
一种包含权利要求13的载体的分离的细胞。
一种分离的登革病毒E蛋白或其片段，其中：
（a）所述E蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:8有至少99%的同一性；或者所述E蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的2‑495位氨基酸、SEQ ID NO:4的2‑495位氨基酸、SEQ ID NO:6的2‑493位氨基酸或SEQ ID NO:8的2‑495位氨基酸有至少99%的同一性；
（b）所述片段含有所述E蛋白胞外结构域，并且所述胞外结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸或者SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸有至少99%的同一性；或者所述胞外结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的2‑398位氨基酸、SEQ ID NO:4的2‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的2‑396位氨基酸或者SEQ ID NO:8的2‑398位氨基酸有至少99%的同一性；
（c）所述片段包含所述E蛋白的DIII结构域，并且所述DIII结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20有至少99%的同一性。
权利要求18的分离的登革病毒E蛋白，其中所述E蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8。
权利要求18的分离的登革病毒E蛋白，其中所述E蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8组成。
权利要求18的分离的登革病毒E蛋白片段，其中所述E蛋白胞外结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸、SEQID NO:4的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸或者SEQID NO:8的1‑398位氨基酸。
权利要求18的分离的登革病毒E蛋白片段，其中所述E蛋白胞外结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸、SEQ IDNO:4的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸或者SEQ IDNO:8的1‑398位氨基酸组成。
权利要求18的分离的登革病毒E蛋白片段，其中所述DIII结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20。
权利要求18的分离的登革病毒E蛋白片段，其中所述DIII结构域的氨基酸序列由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20组成。
一种包含权利要求18的登革病毒E蛋白或E蛋白片段的融合蛋白。
一种含有权利要求18(a)的登革病毒E蛋白或权利要求18(b)所述登革病毒E蛋白片段的登革病毒样颗粒（VLP）。
权利要求26的登革病毒VLP，其还包含登革病毒prM蛋白。
一种含有权利要求18(a)的登革病毒E蛋白或权利要求18(b)所述登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP，由用编码登革病毒prM蛋白和所述E蛋白或E蛋白片段的载体转染宿主细胞在足以允许所述prM和E蛋白表达的条件下产生。
一种组合物，含有权利要求12、16和18‑24中任一项的登革病毒E蛋白或E蛋白片段、权利要求25的融合蛋白或权利要求26‑28中任一项的VLP，以及可药用载体。
一种激发受试者体内针对登革病毒的免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求29的组合物，以此激发所述受试者体内针对登革病毒的免疫应答。
一种激发受试者体内针对登革病毒的免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求12、16和18‑24中任一项的登革病毒E蛋白或E蛋白片段、权利要求25的融合蛋白或权利要求26‑28中任一项的VLP，以此激发所述受试者体内针对登革病毒的免疫应答。
一种使受试者对登革病毒免疫的方法，包括给予所述受试者含有权利要求26‑28中任一项的VLP以及可药用载体的组合物，以此使所述受试者对登革病毒免疫。
权利要求32的方法，其中所述组合物还包含佐剂。
权利要求32或33的方法，其中所述组合物通过肌内注射给予。
权利要求32‑34的方法，其中所述组合物含有约1μg到约25μg所述VLP。
权利要求35的方法，其中所述组合物含有约10μg的所述VLP。
一种组合物，其含有权利要求1‑11中任一项的核酸分子或权利要求13‑15中任一项的载体，以及可药用载体。
一种激发受试者体内针对登革病毒的免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求37的组合物，以此激活受试者体内针对登革病毒的免疫应答。
权利要求38的方法，其中所述组合物还包含佐剂。
权利要求38的方法，其中所述组合物通过肌内注射给予。
权利要求38的方法，其中所述组合物通过基因枪给予。
一种四价登革病毒疫苗，包含：
（1）编码与SEQ ID NO:2有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；
（2）编码与SEQ ID NO:4有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；
（3）编码与SEQ ID NO:6有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；以及
（4）编码与SEQ ID NO:8有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；
一种四价登革病毒疫苗，包含：
（1）含有与SEQ ID NO:2有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；
（2）含有与SEQ ID NO:4有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；
（3）含有与SEQ ID NO:6有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；以及
（4）含有与SEQ ID NO:8有至少99%同一性的登革病毒E蛋白或与SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP。
一种激发受试者体内针对登革病毒的免疫应答的方法，包括给予所述受试者权利要求42或43的组合物，以此激发受试者体内针对登革病毒的免疫应答。
一种使受试者对登革病毒免疫的方法，包括给予所述受试者权利要求42或43的组合物，以此使所述受试者对登革病毒免疫。

说明书登革病毒通用序列及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年5月21日提交的美国临时申请No.61/396,082的优先权，其在此以引用方式全文纳入本文。
技术领域
本公开涉及病毒学领域，具体涉及合成的登革病毒抗原及其用于产生免疫应答的用途。
背景技术
虫媒病毒是重要的人病原体，对其目前没有商业批准的疫苗。虫媒病毒以小的（50nm）二十面体颗粒形式存在，所述颗粒含有编码组成病毒体的3个结构蛋白（C、M和E）和基因组复制所需的7个非结构蛋白的单链RNA分子。该病毒家族包括多个对人致病的蚊媒病毒，其包括西尼罗病毒（WNV）、登革病毒（DENV）、日本脑炎病毒（JEV）和黄热病病毒（YFV）。每种病毒均是地方性的，其具有很大且高度易感的人群，导致很大的医疗和经济负担。
DENV具有已确定为全球分布的4种已知血清型（1‑4）。但是，现代旅行已经改变了这种模式，并且将DENV引入到新的群体中。由于登革病毒非同寻常的在人宿主中进行扩增的传播周期，其在过去50年中已经成为全球最流行的人病原体虫媒病毒。目前，有25亿人生活在登革病流行区，并且每年约有1亿人发生登革热、数百万人发生登革出血热和登革休克综合征（Gubler，Clin.Microbiol. Rev.11:480‑496,1998）。
目前尚没有针对4种DENV血清型（DENV 1‑4）中任何一种的市售疫苗，很大程度上是因为疫苗生产卡在如下事实上：针对一种血清型的中和抗体不能有效中和剩余的DENV血清型（Halstead and O’Rourke,J.Exp.Med.146:201‑217,1977）。事实上，由于被称为抗体依赖的增强（ADE）的现象，其在当针对一种DENV血清型的抗体以非中和方式结合到另一种血清型的DENV颗粒时发生，低水平的这些抗体实际上可能增加在二次感染过程中更严重疾病的风险。这种结合可使得Fc受体携带细胞例如巨噬细胞的感染增加，这能够改变所述病毒的感染谱或者引起导致登革出血热或者登革休克综合征的趋化因子的释放（Halstead and O’Rourke,J.Exp.Med.146:201‑217,1977）。因此，需要开发一种广泛保护性的登革病毒疫苗。
发明内容
本文公开了计算优化的广泛反应性（本文称为“通用的”或“共有的”）的DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的登革病毒E多肽序列。本文还公开了融合到分子佐剂P28的登革病毒E蛋白片段（例如E蛋白胞外结构域和DIII结构域）。所公开的核酸和多肽序列可以用作激发针对登革病毒的免疫应答的疫苗。
本文提供了包含编码登革病毒E蛋白或其片段的核苷酸序列的分离的核酸分子。在一些实施方案中，所述登革病毒E蛋白是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4通用的登革病毒E蛋白。在其他实施方案中，所述登革病毒E蛋白片段可包含所述DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4通用的登革病毒E蛋白的E蛋白胞外结构域。在其他实施方案中，所述E蛋白片段是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的DIII结构域。在一些实施方案中，所述核酸分子还编码登革病毒prM蛋白。还提供了包含所述核酸分子的载体和含有所述载体的分离的细胞。
还提供了分离的登革病毒E蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述登革病毒E蛋白是来自DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的通用的登革病毒E蛋白。在其他实施方案中，所述E蛋白片段是所述DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4通用的登革病毒E蛋白的E蛋白胞外结构域。还在其他实施方案中，所述E蛋白片段是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的DIII结构域。还提供了含有所述通用的登革病毒E蛋白或其片段的VLP。在一些情况下，所述VLP还包括登革病毒prM蛋白。还提供了含有通用的登革病毒E蛋白或其片段的融合蛋白。
本公开还提供了含有所公开的核酸分子、载体、登革病毒E蛋白（及其片段）、VLP和融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是含有DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4通用的E蛋白或编码所述4种通用的E蛋白的核酸分子的四价组合物。
还提供了通过给予本文公开的核酸分子、载体、登革病毒E蛋白（或其片段）、VLP或融合蛋白激发免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给予单种类型的登革病毒E蛋白或其片段。在其他实施方案中，所述方法包括给予包括来自所有4种登革病毒血清型的E蛋白（或其片段）的四价组合物。
还提供了通过给予本文公开的VLP或编码VLP的DNA分子来使受试者对登革病毒感染免疫的方法。在一些实施方案中，所述免疫方法包括给予包含来自单血清型登革病毒的VLP（即DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的VLP）的组合物。在其他实施方案中，所述免疫方法包括给予来自所有4种血清型登革病毒的VLP（即DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的VLP）。
通过以下参考相关附图进行的几个实施方案的详细描述，上述的以及其他的特征和优势将会更加清晰。
附图说明
图1A和1B示出了构建体的示意图和疫苗质粒的表达。（A）示出了pSVP构建体中的四种登革病毒亚型prM‑E基因片段（上图）、DIII‑P28构建体中使用的片段（中图）和pEctoE‑P28构建体中使用的片段（下图）的示意图。将所述E基因的DIII结构域（氨基酸586‑705）克隆到tpA前导序列的下游，并且在一些情况下还将P28框内克隆到紧随所述DIII基因的3'末端之后。在所述E基因的第705位处加入人工的BamHI位点和终止密码子以产生截短的Ecto E基因，并且使用BamHI位点将P28克隆进入Ecto E构建体以产生Ecto E‑P28构建体。（B）通过SDS‑PAGE和蛋白质印迹对质粒DNA短暂转染的293T细胞的上清液进行评估，所述质粒DNA在所述上清液中表达来自所述四种登革病毒亚型（D1、D2、D3和D4）的每一种的SVP、DIII‑P28或Ecto E‑P28蛋白。
图2是示出疫苗时间线、疫苗和剂量的示意图和表格。
图3示出了通过真皮内基因枪疫苗接种的疫苗激发抗体。在涂有来自小鼠的登革病毒DIII的板上用ELISA测量了总IgG滴度，所述小鼠在第8周通过基因枪用编码登革病毒E基因片段的DNA质粒（有或无分子佐剂P28）疫苗接种。每个点代表单独的小鼠。将检测不到的抗体滴度人为设定为1的滴度。误差棒代表具有可测滴度的样品中的标准误差。示出了2个实验中的1个代表性数据。表格示出了所述数据的半定量表示。
图4示出了肌内注射纯化的SVP后的疫苗激发抗体。在涂有来自小鼠的登革病毒DIII的板上用ELISA测量了总IgG滴度，所述小鼠在第8周用纯化的SVP肌内疫苗接种。每个点代表单独的小鼠。将检测不到的抗体滴度人为设定为1的滴度。误差棒代表具有可测滴度的样品中的标准误差。示出了2个实验中的1个代表性数据。表格示出了每个SVP的剂量。
图5示出接种后IgG同种型的表格。使用每种疫苗激发抗血清的1:100稀释物测定了相对IgG同种型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）。每个点代表单独的小鼠。将检测不到的抗体滴度人为设定为1的滴度。误差棒代表具有可测滴度的样品中的标准误差。示出了2个实验中的1个代表性数据。使用结合邦弗朗尼（Bonferroni）事后检验的2‑因素非匹配ANOVA确定组间数据显著性，用星号表示：＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。
图6示出了肌内注射所有四种纯化登革病毒SVP的四价混合物后的疫苗激发抗体。在涂有来自小鼠的登革病毒DIII的板上用ELISA测量了总IgG滴度，所述小鼠在第8周用所有四种纯化的SVP肌内疫苗接种。每个点代表单独的小鼠。将检测不到的抗体滴度人为设定为1的滴度。误差棒代表具有可测滴度的样品中的标准误差。示出了2个实验中的1个代表性数据。
图7A‑7E是示出针对登革病毒1(A)、登革病毒2(B)、登革病毒3(C)、登革病毒4(D)和WNV(E)的全长E蛋白的个体交叉反应ELISA滴度的曲线图。在涂有来自小鼠的E蛋白的板上用ELISA测量了总IgG滴度，将所述小鼠在第8周用所有登革病毒候选物进行肌内疫苗接种。
序列表
所列出的核酸和氨基酸序列使用如37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码示出。每个核酸序列只示出了一条链，但是对所示出链的任何提及应认为也包括互补链。在所附的序列表中：
SEQ ID NO:1是DENV‑1共有E蛋白编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是DENV‑1共有E蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是DENV‑2共有E蛋白编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是DENV‑2共有E蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是DENV‑3共有E蛋白编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是DENV‑3共有E蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是DENV‑4共有E蛋白编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是DENV‑4共有E蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是含有DENV‑1共有E蛋白编码序列的构建体（DENV‑1_ss‑prM‑consE.fa）的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是含有DENV‑2共有E蛋白编码序列的构建体（DENV‑2(NGC)NheI–kozak–SS‑prM/E–XhoI in pcDNA3.1(+)）的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是含有DENV‑3共有E蛋白编码序列的构建体（DENV3_(H87)_ss_prM_consE_Xba.fa）的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是含有DENV‑4共有E蛋白编码序列的构建体（H241_EcoRI‑kozak‑ss‑prM‑consE‑.fa）的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是DENV‑1 DIII的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是DENV‑1 DIII的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是DENV‑2 DIII的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是DENV‑2 DIII的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是DENV‑3 DIII的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是DENV‑3 DIII的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是DENV‑4 DIII的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是DENV‑4 DIII的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是C3d肽P28的氨基酸序列。
具体实施方式
I.缩写
ADE    抗体依赖的增强
APC    抗原呈递细胞
COBRA  密码子优化的广泛反应性抗原
DENV   登革病毒
DF     登革热
DHF    登革出血热
DSS    登革休克综合征
E      包膜蛋白
MHC    主要组织相容性复合体
prM    前膜蛋白
VLP    病毒样颗粒
WNV  西尼罗病毒
II.术语和方法
除非另有说明，技术术语依据常规用法使用。分子生物学一般术语的定义可以在1994年牛津大学出版社出版的Benjamin Lewin,Genes V(ISBN 0‑19‑854287‑9)；1994年Blackwell Science Ltd.出版的Kendrew etal.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology(ISBN 0‑632‑02182‑9)；以及1995年VCH Publishers,Inc.出版的Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(ISBN 1‑56081‑569‑8)中查到。
为方便对本公开的多个实施方案的理解，提供下述具体术语的解释：
佐剂：不会特异性增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可包括抗原吸附于上的矿物质（明矾、氢氧化铝或磷酸盐）悬液；或者抗原溶液在矿物油中乳化形成的油包水乳剂（例如弗氏不完全佐剂），有时会包括杀死的分枝杆菌（弗氏完全佐剂）以进一步增强抗原性。也可以使用免疫刺激性寡核苷酸（例如包含CpG基序的寡核苷酸）作为佐剂(例如，见美国专利No.6,194,388;No.6,207,646;No.6,214,806;No.6,218,371;No.6,239,116;No.6,339,068;No.6,406,705;和No.6,429,199)。佐剂还包括生物分子，例如共刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL‑2、RANTES、GM‑CSF、TNF‑α、IFN‑γ、G‑CSF、LFA‑3、CD72、B7‑1、B7‑2、OX‑40L和41BBL。
给予：本文使用的将组合物给予受试者意指：给、施用或将所述组合物与所述受试者接触。给予可以通过多种途径中的任意一种进行，例如局部途径、经口途径、皮下途径、肌内途径、腹膜内途径、静脉途径、鞘内途径以及真皮内途径。
抗体:由B淋巴细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗体是由特异性抗原（免疫原）在人或其他动物中激发的。抗体的特征在于以一些可证明的方式与所述抗原特异性反应，抗体和抗原互相根据对方定义。“激发抗体应答”是指抗原或其他分子引起抗体产生的能力。
抗原：能够在动物中刺激抗体产生或T‑细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注入或吸收进入动物的组合物。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源免疫原诱导的那些。在一些公开的组合物和方法的实施方案中，所述抗原是黄病毒E蛋白。
密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已经被改变以使所述密码子在具体系统（例如物种组中某个具体的物种）中最适合表达的核酸序列。例如，可以将核酸序列进行优化用于在哺乳动物细胞中表达。密码子优化不会改变所编码蛋白的氨基酸序列。
保守置换：将蛋白质序列中的一个氨基酸残基置换为具有类似生物化学性质的不同氨基酸残基。典型地，保守置换对所产生的多肽活性几乎没有影响或者没有影响。例如，理想地，包括一个或多个保守置换（例如不多于2、5、10、20、30、40或者50个置换）的登革病毒蛋白保持野生型蛋白的结构和功能。通过使用例如标准方法例如定向诱变或PCR对编码所述多肽的核苷酸序列进行操作，可以产生含有一个或多个保守置换的多肽。在一个实例中，通过测试抗体交叉反应或者其诱导免疫应答的能力，可以很容易地选择这种变体。
保守置换通常可保留：（a）置换区域中的多肽骨架的结构例如片层或螺旋构象；（b）所述分子在所述靶位点的电荷或疏水性；或者（c）侧链的体积（bulk）。保守置换的实例显示如下。

一般而言预期产生蛋白性质最大改变的置换是非保守的，所述改变例如：（a）亲水残基（例如丝氨酰基或苏氨酰基）置换为疏水残基（例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰）或被其置换；（b）半胱氨酸或脯氨酸置换其他任意残基，或半胱氨酸或脯氨酸被其他任意残基置换；（c）具有正电侧链的残基（例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基）置换带负电的残基（例如谷氨酰基或天冬氨酰基）或具有正电侧链的残基被带负电的残基置换；或者（d）具有大侧链的残基（例如苯丙氨酸）置换不含侧链的残基（例如甘氨酸）或具有大侧链的残基被不含侧链的残基置换。
包膜糖蛋白（E蛋白）：介导黄病毒病毒体结合到宿主细胞上的细胞受体的黄病毒结构蛋白。所述黄病毒E蛋白是膜融合所需的，是诱导针对黄病毒感染的保护性免疫的主要抗原。黄病毒E蛋白可影响宿主范围、组织嗜性以及病毒毒力。黄病毒E蛋白包含三个结构和功能结构域：DI、DII和DIII。在成熟的病毒颗粒中，E蛋白形成首尾相接的同型二聚体，在病毒表面平躺（lying flat）并形成稠格(dense lattice)。在本文中使用的E蛋白片段”包括仍然能够激发免疫应答（例如抗体应答）的E蛋白的任意片段。在一些实施方案中，所述片段包含E蛋白胞外结构域或由其组成，或者包含DIII结构域或由其组成。
黄病毒非结构蛋白：有7种黄病毒非结构（NS）蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，其由黄病毒基因组中结构蛋白基因3’端的部分编码。已经发现，NS1与RNA复制有关，并且已发现其从被感染的哺乳动物细胞分泌(Post et al.,Virus Res.18:291‑302,1991;Mackenzie et al.,Virology 220:232‑240,1996;Muylaert et al.,Virology222:159‑168,1996)。NS1能够激发强的体液免疫应答，是潜在的候选疫苗(Shlesinger et al.,J.Virol.60:1153‑1155,1986;Qu et al.,J.Gen.Virol.74:89‑97,1993)。NS2被剪切成为NS2A和NS2B，NS2A的功能尚不清楚。NS2B与NS3形成复合体并起到NS3蛋白酶的辅助因子的作用，NS3蛋白酶可剪切所述病毒多蛋白的部分。NS3还起到RNA解旋酶的作用，用于在复制过程中将病毒RNA解旋(Li et al.,J.Virol.73:3108‑3116,1999)。虽然NS4A和NS4B的确切功能还有待阐明，但是它们被认为参与RNA复制和RNA运输(Lindenbach and Rice,In:Fields Virology,Knipe and Howley，eds.,Lippincott,Williams,andWilkins,991‑1041,2001)。最后，NS5蛋白是参与基因组复制的RNA‑依赖的RNA聚合酶(Rice et al.,Science 229:726‑733,1985)。NS5还显示出具有通常会在RNA加帽酶中发现的甲基转移酶活性(Koonin,J.Gen.Virol.74:733‑740,1993)。
黄病毒结构蛋白：黄病毒的壳体蛋白（C）、前膜蛋白（prM）、包膜蛋白（E）是病毒结构蛋白。黄病毒基因组由约11kb长的正义RNA组成。所述基因组具有5’帽子，但是没有3’多聚腺苷酸尾(Wengler et al.,Virology 89:423‑437,1978)，被翻译成一个多蛋白。所述结构蛋白(C、prM和E)位于所述多蛋白的氨基末端，其后是非结构蛋白(NS1‑5)。所述多蛋白被来自病毒和宿主的蛋白酶剪切成为个体蛋白。C蛋白可形成病毒壳体，而prM和E蛋白嵌入周围的包膜中(Russell et al.,TheTogaviruses: Biology，Structure，and Replication,Schlesinger，ed.,Academic Press,1980)。E蛋白的作用是结合到宿主细胞受体，导致受体介导的内吞。在低pH的内体中，E蛋白发生构型改变，引起病毒包膜和内体膜之间的融合。prM蛋白被认为可以稳定E蛋白直到病毒离开被感染的细胞，此时prM被剪切成为成熟的M蛋白(Reviewed inLindenbach and Rice,In:Fields Virology,Knipe and Howley，eds.,Lippincott,Williams,and Wilkins,991‑1041,2001)。
融合蛋白：通过表达从编码两种不同的（异源的）蛋白的至少一部分的核酸序列设计的核酸序列产生的蛋白。为产生融合蛋白，所述核酸序列必须位于相同的阅读框，并且不含内部终止密码子。例如，融合蛋白包含融合到异源蛋白的登革病毒E蛋白。
免疫应答：免疫系统细胞例如B细胞、T细胞、巨噬细胞或者多形核细胞对刺激例如抗原或疫苗的应答。免疫应答可以包括参与宿主防御应答的任何体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不限于先天性免疫应答或炎症。本文使用的保护性免疫应答是指保护受试者免受感染（阻止感染或阻止与感染相关的疾病的发展）的免疫应答。测量免疫应答的方法是本领域公知的，包括例如测量淋巴细胞（例如B或T细胞）的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。
免疫原：能够在适合的条件下激发免疫应答例如动物体内的抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或者物质，包括被注射或者吸收进入动物体内的组合物。本文使用的“免疫原性组合物”是指含有免疫原的组合物（例如黄病毒E蛋白）。
免疫：使受试者免于感染性疾病，例如通过疫苗接种。
分离的：“分离的”或“纯化的”生物组分（例如核酸、肽、蛋白质、蛋白质复合体或颗粒）是与天然产生所述组分的生物体的细胞中其他生物组分（即其他染色体的和染色体外的DNA、RNA和蛋白质）基本上分离的、从其中分离产生的或者从其中纯化的。因此，“分离的”或“纯化的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中的重组表达制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸或蛋白质。术语“分离的”或“纯化的”不需要绝对纯，而是一个相对性的术语。因此，例如，分离的生物组分是比在所述生物组分的细胞或其他生产容器内的天然环境中的所述生物组分更富集的生物组分。优选地，对制品进行纯化以使得所述生物组分占所述制品中总生物组分含量的至少50%，例如至少70%、至少90%、至少95%或更高。
可操作地连接的：当第一核酸序列被置于与第二核酸序列有功能性关系的位置时，所述第一核酸序列即与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录和表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且，在需要连接两个蛋白编码区时，在相同的读码框中。
P28：补体蛋白C3d的作为分子佐剂的区。在一些实施方案中，P28区的氨基酸序列是KFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYA(SEQID NO:21)。以前已经证明，融合C3d的P28区可增强所融合的抗原的免疫原性（见，例如，Dunn et al.,Virology J7:95,2010）。
可药用载体：本公开中使用的可药用载体（运载体）是常规的可药用载体。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)中描述了适于一种或多种治疗组合物（例如一种或多种流感疫苗）和另外的药物剂的药用递送的组合物和制剂。
一般来说，载体的性质依赖于所使用的具体给药模式。例如，肠胃外给予的制剂通常包含可注射的流体，其包括可药用的或者生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖、甘油等作为运载体。对于固态组合物（例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式），常规的非毒性固态载体可以包括例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉或者硬脂酸镁。除生物中性的载体以外，待给予的药物组合物可以含有少量的非毒性辅料例如增湿剂或乳化剂、防腐剂，以及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或者脱水山梨醇单月桂酸酯。
前膜蛋白（prM蛋白）：黄病毒结构蛋白。prM蛋白是约25kDa的蛋白，其是膜（M）蛋白的细胞内前体。prM被认为能够在将未成熟的病毒体转运至细胞表面的过程中稳定E蛋白。当病毒离开被感染的细胞时，prM蛋白被剪切成为成熟的M蛋白，其是病毒包膜的一部分（见综述：Lindenbach and Rice,In:Fields Virology,Knipe and Howley，eds.,Lippincott,Williams,and Wilkins,991‑1041,2001）。
预防、治疗或缓解疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展以后缓解其体征或症状的治疗性干预。“缓解”是指减少疾病的体征或症状的数量或者严重性。
启动子：启动子是指导核酸转录的一段核酸控制序列。启动子包括转录起始点附近的必需核酸序列。启动子还任选地包括远处的增强子或抑制子元件。“组成型启动子”是持续活跃的启动子并且其不受外部信号或分子的调节。相反地，“诱导型”启动子的活性受外部信号或分子（例如转录因子）调节。在本文的一些实施方案中，启动子是CMV启动子。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯；相反，其是一个相对性的术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒或者其他活性的化合物全部或者部分地与天然相关的蛋白质或其他杂质分离。在具体的实施方案中，术语“基本纯化的”是指从细胞、细胞培养基或者其他粗制品中分离并进行分级以移除初始制品中的多种组分（例如蛋白质、细胞碎片和其他组分）的肽、蛋白质、病毒或其他活性的化合物。
重组体：重组体核酸、蛋白质或病毒具有非天然存在的序列或者具有通过将两个本来分离的序列片段人工组合而制成的序列。所述人工组合通常通过化学合成或者更通常通过人工操作分离的核酸片段例如通过遗传工程技术来完成。术语重组体包括仅仅通过插入、置换或者缺失天然核酸分子、蛋白质或者病毒的一部分而改变的核酸、蛋白质和病毒。
序列同一性：氨基酸序列或核酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，又称作序列同一性。序列同一性通常以同一性（或者相似性或同源性）百分比度量，百分比越高则两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，所给基因或蛋白质的同系物或变体将具有较高的序列同一性。
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。如下文献中描述了多种程序和比对算法：Smith and Waterman,Adv.Appl. Math.2:482,1981;Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson andLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988;Higgins and Sharp,Gene 73:237‑244,1988;Higgins and Sharp,CABIOS 5:151‑153,1989;Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881‑10890,1988;和Pearsonand Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988.Altschul et al.,Nature Genet.6:119‑129,1994。
可从几种来源（包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网）获得NCBI基本局部比对搜索工具(BLASTTM)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403‑410,1990)，用于连接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。
受试者：活的多细胞脊椎动物，范围包括人和非人哺乳动物例如非人灵长目动物。
四价登革病毒疫苗：是指具有四种不同的抗原决定簇例如四种不同的E蛋白（例如来自DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4每一种的通用E蛋白）的登革病毒疫苗。在一些实施方案中，所述四价登革病毒疫苗是含有DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的VLP或者编码DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的VLP的核酸分子的组合物。
治疗有效量：在用具体试剂治疗的受试者中足以达到需要的效果的所述试剂的量。例如，其可以是可用于在受试者中激发免疫应答和/或用于预防登革病毒感染的登革病毒疫苗的量。理想地，在本公开的上下文中，黄病毒疫苗的治疗有效量是足以在受试者中增加对由黄病毒引起的感染的抗性和/或预防、缓解、治疗由黄病毒引起的感染而且不在受试者中引起实质性细胞毒性效应的量。所述可用于在受试者中增加对感染的抗性和/或预防、缓解、治疗感染的黄病毒疫苗的有效量依赖于例如被治疗的受试者、所述治疗组合物的给予方式以及其他因素。
转化的：“转化的”细胞是已经被通过分子生物学技术导入核酸分子的细胞。该术语涵盖所有通过其可将核酸分子导入所述细胞的技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速导入裸露的DNA。
疫苗：能够激发免疫应答、可被给予以预防、缓解或治疗感染性疾病或其他类型疾病的免疫原性材料的制品。所述免疫原性材料可包括减毒的或灭活的微生物（例如细菌或病毒），或者来自所述微生物的抗原性蛋白质、肽或DNA。减毒疫苗是已经被改良成为产生毒性较小的形式、但仍然保留激发针对所述毒性形式的抗体和细胞介导的免疫的能力的有毒力生物体。灭活疫苗是已经用化学试剂或加热杀死、但能够激发针对有毒力微生物的抗体的曾经有毒力微生物。疫苗能够激发预防性（防止性）应答和治疗性应答。给予方法依据疫苗有所不同，但是可以包括疫苗接种、食入、吸入或其他给予形式。可以将疫苗结合佐剂给予以加强免疫应答。
载体：载体是允许插入外源核酸、但不破坏所述载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列例如复制起点。插入型载体能够将其本身插入宿主核酸。载体还可包括一个或多个选择标记基因以及其他遗传元件。表达载体是包含允许插入的一个或多个基因转录和翻译的必需调节序列的载体。在本公开的一些实施方案中，载体编码黄病毒E蛋白。在一些实施方案中，载体是pTR600表达载体(美国专利申请公开文本No.2002/0106798;Ross et al.,Nat Immunol.1(2):102‑103,2000;Green et al.,Vaccine20:242‑248,2001)。
病毒样颗粒（VLP）：由一种或多种病毒结构蛋白组成、但缺少所述病毒基因组的病毒颗粒。由于VLP缺少病毒基因组，其是非感染性的。此外，VLP通常可以通过异源表达产生并很容易被纯化。如本文所述，可以通过用编码prM和E蛋白的质粒转染宿主细胞来产生黄病毒VLP。将所述被转染的细胞孵育适当的时间（例如约48小时）以使蛋白表达后，可以从细胞培养物的上清液中分离VLP。
除非另有说明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语与本公开所述领域的技术人员的惯常理解具有相同的含义。除非上下文中清楚地说明，否则单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数的指代物。同样地，除非上下文中清楚地说明，否则“或”意欲包括“和”。此外，可以理解的是，核酸或多肽的所有碱基数目或氨基酸数目以及所述分子量或分子质量值都是近似值，并且其仅被提供用于说明。虽然也可以使用与本文所述的方法和材料类似或等价的方法和材料来实施或测试本公开，但是下文描述了适合的方法和材料。术语“包含”意指“包括”。本文提及的所用出版物、专利申请、专利以及其他参考文献在此以引用方式全文纳入本文。如果出现冲突，以本说明书（包括术语解释）为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，而不意图进行限制。
III.几个实施方案的综述
本文公开了计算优化的广泛反应性的（“通用的”或“共有的”）DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的登革病毒E多肽序列。还公开了与分子佐剂P28融合的登革病毒E蛋白片段（例如E蛋白胞外结构域和DIII结构域）。所公开的核酸序列和多肽序列可以用作激发对抗登革病毒的免疫应答的疫苗。
本文提供了包括编码登革病毒E蛋白或其片段的核苷酸序列的分离的核酸分子。在一些实施方案中，所述登革病毒E蛋白是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的通用登革病毒E蛋白。在其他实施方案中，所述登革病毒E蛋白片段包含DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的通用登革病毒E蛋白的E蛋白胞外结构域。在其他实施方案中，所述E蛋白片段是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的DIII结构域。在一些实施方案中，所述核酸分子还编码登革病毒prM蛋白。还提供了包含所述核酸分子的载体和含有所述载体的分离的细胞。
在具体的非限制性的实施方案中，提供了含有编码登革病毒E蛋白或其片段的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中：（a）所述编码登革病毒E蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性；（b）所述片段包含E蛋白胞外结构域，并且编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:3的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的1‑1188位核苷酸或者SEQ ID NO:7的1‑1194位核苷酸具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性；或者（c）所述片段包含所述E蛋白的DIII结构域，并且编码所述DIII结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
在一些实例中，所述与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的编码登革病毒E蛋白的核苷酸序列缺少编码N‑末端甲硫氨酸的起始密码子（每个序列的1‑3位核苷酸）。在一些实例中，所述编码登革病毒E蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的4‑1188位核苷酸、SEQ ID NO:3的4‑1188位核苷酸、SEQ ID NO:5的4‑1191位核苷酸、或者SEQ ID NO:7的4‑1188位核苷酸具有至少99%的同一性。
在一些实例中，编码所述E蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7，或由其组成。在其他实例中，编码所述E蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1的4‑1188位核苷酸、SEQ ID NO:3的4‑1188位核苷酸、SEQ ID NO:5的4‑1191位核苷酸或SEQ ID NO:7的4‑1188位核苷酸，或由其组成。
在一些实例中，所述与SEQ ID NO:1的1‑1194位核苷酸、SEQ IDNO:3的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的1‑1188位核苷酸或SEQ IDNO:7的1‑1194位核苷酸具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的编码E蛋白胞外结构域的核苷酸序列缺少编码N‑末端甲硫氨酸的起始密码子（每个序列的1‑3位核苷酸）。在一些实例中，编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的4‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:3的4‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的4‑1188位核苷酸或者SEQ ID NO:7的4‑1194位核苷酸具有至少99%的同一性。
在一些实例中，编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列包含SEQID NO:1的1‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:3的1‑1194位核苷酸、SEQID NO:5的1‑1188位核苷酸或SEQ ID NO:7的1‑1194位核苷酸，或由其组成。在另外的实例中，编码所述E蛋白胞外结构域的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的4‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:3的4‑1194位核苷酸、SEQ ID NO:5的4‑1188位核苷酸或SEQ ID NO:7的4‑1194位核苷酸具有至少99%的同一性。
在一些实例中，编码所述DIII结构域的核苷酸序列包含SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19，或由其组成。
在所述核苷酸序列编码E蛋白片段（例如所述胞外结构域或DIII结构域）的具体实例中，所述分离的核酸还包含编码补体蛋白C3d的P28区的核苷酸序列。在一个实例中，所述补体蛋白C3d的P28区的氨基酸序列包含KFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYA(SEQ IDNO:21)。在一些情况下，所述核酸包含多个拷贝的所述P28编码序列，例如2、3、4、或5个拷贝。
还提供了包含本文公开的分离的核酸分子的载体，例如真核表达载体。适合的载体是本领域公知的。在一些实例中，所述载体是pTR600表达载体(美国专利申请公开文本No.2002/0106798，在此以引用的方式纳入本文；Ross et al.,Nat Immunol.1(2):102‑103,2000；Green et al.,Vaccine 20:242‑248,2001)。
在一些实例中，所述载体还包含可操作地连接到编码所述E蛋白或其片段的核苷酸序列的启动子。在具体的实例中，所述启动子是巨细胞病毒（CMV）启动子。
在一些实例中，所述载体还包含编码登革病毒prM蛋白的核酸序列。
还提供了在足以允许所述蛋白表达的条件下通过用本文所述的载体转染宿主细胞而产生的登革病毒E蛋白或其片段。还提供了含有本文所述载体的分离的细胞。
本文还提供了分离的登革病毒E蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述登革病毒E蛋白是来自DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的通用登革病毒E蛋白。在其他实施方案中，所述E蛋白片段是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的通用登革病毒E蛋白的E蛋白胞外结构域。还在其他实施方案中，所述E蛋白片段是DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的DIII结构域。还提供了含有所述通用登革病毒E蛋白或其片段的VLP。在一些情况下，所述VLP还包括登革病毒prM蛋白。还提供了含有所述通用登革病毒E蛋白或其片段的融合蛋白。
在具体的非限制性的实例中，提供了分离的登革病毒E蛋白或其片段，其中:（a）所述E蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:8有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性；（b）所述片段含有所述E蛋白胞外结构域，并且所述胞外结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸或者SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性；或者（c）所述片段含有所述E蛋白的DIII结构域，并且所述DIII结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或者SEQ IDNO:20有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
在一些实例中，与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:8有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的所述E蛋白的氨基酸序列缺少N‑末端甲硫氨酸残基。在一些实例中，所述E蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的2‑495位氨基酸、SEQ ID NO:4的2‑495位氨基酸、SEQ ID NO:6的2‑493位氨基酸或SEQ ID NO:8的2‑495位氨基酸有至少99%的同一性。
在一些实例中，所述E蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8，或由其组成。在其他实例中，所述E蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的2‑495位氨基酸、SEQ ID NO:4的2‑495位氨基酸、SEQ ID NO:6的2‑493位氨基酸或SEQ ID NO:8的2‑495位氨基酸，或由其组成。
在一些实例中，所述与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸、SEQ IDNO:4的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸或者SEQ IDNO:8的1‑398位氨基酸有至少99%同一性的胞外结构域的氨基酸序列缺少N‑末端甲硫氨酸残基。在一些实例中，所述胞外结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的2‑398位氨基酸、SEQ ID NO:4的2‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的2‑396位氨基酸或者SEQ ID NO:8的2‑398位氨基酸有至少99%的同一性。
在一些实例中，所述E蛋白的胞外结构域的氨基酸序列包含SEQID NO:2的1‑398位氨基酸、SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸、SEQ IDNO:6的1‑396位氨基酸或者SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸，或由其组成。在其他实例中，所述胞外结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的2‑398位氨基酸、SEQ ID NO:4的2‑398位氨基酸、SEQ ID NO:6的2‑396位氨基酸或者SEQ ID NO:8的2‑398位氨基酸，或由其组成。
在一些实例中，所述DIII结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20，或由其组成。
还提供了含有本文公开的登革病毒E蛋白或E蛋白片段的融合蛋白。
还提供了含有本文公开的登革病毒E蛋白或登革病毒E蛋白胞外结构域片段的登革病毒样颗粒（VLP）。在一些实施方案中，所述登革病毒VLP还包含登革病毒prM蛋白。还提供了包含登革病毒E蛋白或登革病毒E蛋白胞外结构域片段的登革病毒VLP，所述登革病毒E蛋白或登革病毒E蛋白胞外结构域片段是在足以允许所述prM和E蛋白表达的条件下通过用编码登革病毒prM蛋白和所述E蛋白或E蛋白胞外结构域片段的载体转染宿主细胞而产生的。
本公开还提供了含有所公开的核酸分子、载体、登革病毒E蛋白（及其片段）、VLP以及融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是含有DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3、和DENV‑4的通用E蛋白或编码所述通用E蛋白的核酸分子的四价组合物。
在一些实施方案中，所述组合物包含可药用载体。在一些实施方案中，所述组合物包含佐剂。例如，所述佐剂可以是明矾、弗氏完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸（例如CpG寡核苷酸）。
还提供了通过给予本文公开的核酸分子、载体、登革病毒E蛋白（或其片段）、VLP或融合蛋白激发免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给予单一类型的登革病毒E蛋白或其片段。在其他实施方案中，所述方法包括给予包括来自所有四种血清型的登革病毒的E蛋白（或其片段）的四价组合物。
还提供了通过给予本文公开的VLP或编码VLP的DNA分子来使受试者对登革病毒感染免疫的方法。在一些实施方案中，所述免疫方法包括给予包含来自单个血清型登革病毒的VLP（即DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3或DENV‑4的VLP）的组合物。在其他实施方案中，所述免疫方法包括给予来自所有四种登革病毒血清型的VLP（即DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的VLP）。在所述方法的一些实例中，所述组合物还包含佐剂。在一些实例中，所述组合物是通过肌内注射给予的。在其他实例中，所述组合物是通过皮内注射给予的。在一些实例中，所述组合物是通过基因枪给予的。
在激发免疫应答或免疫受试者的方法的一些实施方案中，给予所述受试者约1μg到约25μg的含有所述通用E蛋白或其片段的VLP。在具体的实例中，给予所述受试者约5μg到约20μg VLP，或者约10μg到约15μg所述VLP。在一个具体的非限制性的实例中，给予所述受试者约10μg所述VLP。但是，本领域技术人员能够确定给予受试者的VLP的治疗有效量（例如提供保护免于登革病毒感染的量）。
在一个实施方案中，提供了四价登革病毒疫苗，其包含：（1）编码与SEQ ID NO:2有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；（2）编码与SEQ ID NO:4有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；（3）编码与SEQ ID NO:6有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:6的1‑396位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；以及（4）编码与SEQ ID NO:8有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体。
在另一个实施方案中，提供了四价登革病毒疫苗，其包含：（1）编码与SEQ ID NO:2的2‑495位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ IDNO:2的2‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；（2）编码与SEQ IDNO:4的2‑495位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:4的2‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；（3）编码与SEQ ID NO:6的2‑493位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:6的2‑396位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体；以及（4）编码与SEQ ID NO:8的2‑495位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:8的2‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的载体。
在另一个实施方案中，提供了四价登革病毒疫苗，其包含：（1）含有与SEQ ID NO:2有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:2的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；（2）含有与SEQ ID NO:4有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:4的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；（3）含有与SEQ ID NO:6有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQID NO:6的1‑396位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；以及（4）含有与SEQ ID NO:8有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:8的1‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP。
还在另一个实施方案中，提供了四价登革病毒疫苗，其包含：（1）含有与SEQ ID NO:2的2‑495位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ IDNO:2的2‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；（2）含有与SEQ ID NO:4的2‑495位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:4的2‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；（3）含有与SEQID NO:6的2‑493位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:6的2‑396位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP；以及（4）含有与SEQ ID NO:8的2‑495位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白或者与SEQ ID NO:8的2‑398位氨基酸有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的登革病毒E蛋白片段的登革病毒VLP。
还提供了通过如下方式在受试者中激发针对登革病毒的免疫应答的方法：给予受试者本文所述的四价登革病毒疫苗，以此激发所述受试者中针对登革病毒的免疫应答。还提供了通过如下方式使所述受试者对登革病毒免疫的方法：给予受试者本文所述的四价登革病毒疫苗，以此使所述受试者对登革病毒免疫。
IV.登革病毒共有的E蛋白及其VLP
人体内最常见的由节肢动物传播的病毒性疾病登革热（DF）是由DENV引起的。全世界三分之二的人群生活在DENV流行的地区。四种血清型的DENV主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）传播到人。DENV是黄病毒科（Flaviviridae）的一员，与引起黄热病和日本脑炎、圣.路易斯脑炎以及西尼罗脑炎的病毒有关。DENV感染会引起从急性虚弱的、自我限制性的热性疾病（DF）到危及生命的出血性的/毛细管渗漏综合征（DHF/DSS）的一系列临床疾病。目前尚没有已批准的抗病毒治疗方法或疫苗。DENV每年会引起2500万到一亿DF病例和25万DHF病例，有25亿人具有感染风险。
对有效的DENV疫苗进行设计不仅会激发保护性免疫，而且还会预防由抗体依赖的增强（ADE）引起的疾病增强。本公开将以下两种方法组合以克服这些挑战：（1）通过基于比对中每个位点上最常见氨基酸产生人工序列，使用共有的E蛋白来使疫苗免疫原和流行病毒株之间的序列相异度最小化；以及（2）通过保留E蛋白中诱导体液和细胞免疫应答两者的线性的和构象的表位，使用VLP激发广泛反应性的抗登革病毒免疫。纯化的VLP可以直接作为疫苗给予，或者可以给予编码含有所述VLP的共有E蛋白的核酸分子（例如载体）。使用非感染性的VLP可激发广泛反应性免疫而没有减毒的活病毒疫苗的危险。这些疫苗可产生能够防止产生逃逸突变体的多血清型应答。另外，VLP可为颗粒进入专门的抗原呈递细胞（APC）例如树突细胞和巨噬细胞提供了可能性。
A.使用基于病毒样颗粒的疫苗
由结构蛋白组成、但是缺少病毒基因组的非感染性病毒体——病毒样颗粒（VLP）可以由编码选择的病毒结构蛋白的DNA质粒在多种细胞表达体系中产生。与减毒活病毒相比，基于VLP的疫苗的主要优势在于VLP可表达多个病毒表位，所述表位能够刺激多组免疫应答而无减毒活病毒的许多可能的有害效应。VLP具有激活内源和外源抗原途径两者的潜力，所述途径可导致通过I类和II类主要组织相容性复合体（MHC）分子的病毒肽呈递。这些多表位疫苗比其单组分对应物更有可能会产生能够识别并失活不同DENV株系的广泛免疫应答。另外，对于后续I期临床试验来说，一种表达多种登革病毒VLP的疫苗可能比同时接种多个单独的基因疫苗更经济。
与单一重组蛋白疫苗相比，多种VLP的另一个优势是其使用适合的表面受体结合并进入细胞的能力。在感染后，病毒蛋白可以被加工并被呈递到I类MHC分子，以此促进通过APC的到T细胞的呈递。另外，与抗体结合的不含细胞的VLP可以通过Fc受体被吞噬细胞吸收，因此增强II类MHC呈递。
以其天然构象形式表达的抗原可以比非天然形式的蛋白质激发更有效的抗体应答。许多抗病毒的中和抗体由只在天然形式的包膜中存在（并且其中一部分只在进入过程中结合到受体后出现）的构象表位激发的。许多基于重组蛋白的疫苗可激发高滴度的针对所述包膜（Env）糖蛋白的抗体，但是这些抗体通常只中和同源的病毒而不中和其他病毒分离株。相反地，以天然的三聚体构象存在的Env能够更有效地激发中和抗体。除其他病毒抗原外，含有天然形式的Env的基于颗粒的疫苗具有诱导对多种病毒蛋白的强体液和细胞介导的应答的潜力。
B.使用共有的DENV E蛋白序列
基于计算机模型（树的同一性、祖先和中心）的中心化基因策略已经被用于构建能够产生针对高度多样性的病毒（例如HIV‑1）的增强免疫的疫苗免疫原。已经显示，共有的HIV‑1包膜纳入VLP并介导感染，这表明这些人工序列的生物学相关性（结构/功能）。免疫原性研究表明这些共有序列免疫原能够拓宽识别多种HIV‑1株系的疫苗细胞应答和体液免疫应答。所述共有序列通过基于比对中每个位点上最常见氨基酸产生人工序列来使疫苗免疫原和流行病毒株系之间的序列相异度最小化。共有序列最能代表当前流行的病毒群体。将几种共有序列进行结合具有覆盖不同免疫原例如DENV E蛋白中尽可能多的表位的优势。
使用在天然形式的VLP表面表达的共有E免疫原可激发广泛反应性的抗DENV免疫。这种免疫原设计保留了E中对诱导细胞免疫起关键作用的线性表位和在E寡聚物中发现的构象表位，以激发针对多种病毒分离株的广泛体液应答。另外，共有包膜序列的使用使得不再需要从同一血清型的多种分离株中选择正确的株系用作疫苗免疫原。共有的E蛋白可被用于激发免疫应答以应对多种DENV基因型的株系的暴露。
C.设计VLP
与目前的减毒DENV E疫苗方法不同，本文公开的用于开发、制造和给予DENV疫苗的策略不需要使用任何活的登革病毒。因此，与传染性DENV的可用性、安全性以及操作相关的问题已不再是问题。基于VLP的疫苗对于用于病毒性疾病（包括DENV）的有效、安全、低成本的疫苗来说是一项创新性的技术。
重组VLP疫苗在具有高免疫原性、非传染性结构的情况下还保留了DENV蛋白天然的、构象的抗原表位。VLP疫苗的强免疫原性可以以低剂量的E抗原激发免疫应答和血清保护，这减少了所述疫苗的副作用和反应原性。重组VLP疫苗本质上比来自活的减毒或失活完整病毒的疫苗更安全，其避免了在疫苗的开发和生产过程中与存在感染性病毒相关的安全风险。
V.登革病毒VLP及其给予
本文提供了含有共有的E蛋白（例如具有如SEQ ID NO:2、4、6或8任一序列所列氨基酸序列的E蛋白）或其片段的登革病毒VLP。所述登革病毒VLP由prM和E蛋白组成。登革病毒VLP的生产在本领域已有描述，在本领域技术人员的能力范围之内。如本文所述，可以通过用编码prM和E蛋白的质粒转染宿主细胞来生产登革病毒VLP。将所述转染的细胞孵育适当的时间以使所述蛋白表达以后，可用标准方法将VLP从细胞培养物上清液中分离。
本文还提供了编码登革病毒VLP的核酸分子。因此，在一些实施方案中，提供了编码所述prM和E蛋白的核酸分子，其中所述E蛋白是共有的E蛋白序列（例如，由SEQ ID NO:1、3、5或7任一序列的核酸序列编码的蛋白）或其片段。
本文公开的登革病毒VLP(包括编码登革病毒VLP的核酸分子)可被作为登革病毒疫苗来激发针对任意登革病毒组、亚型或进化枝（包括任何新出现的病毒）的保护性免疫应答。
可以通过通常使用的将重组病毒或核酸分子导入受试者的任意途径将登革病毒VLP或其组合物给予受试者。给予方法包括但不限于真皮内给药、肌内给药、腹膜内给药、肠胃外给药、静脉给药、皮下给药、阴道给药、直肠给药、鼻内给药、吸入给药或者经口给药。肠胃外给药例如皮下给药、静脉给药或者肌内给药通常通过注射完成。注射剂可以以常规形式制备：液体溶液或混悬物、适于注射前在液体中溶解或混悬的固体物形式；或者乳剂。注射溶液和混悬物可以由前文所述的无菌粉末、颗粒和片剂类型制备。所述给予可以是全身给予或局部给予。
登革病毒VLP(或编码登革病毒VLP的核酸分子)或其组合物可以以任意适合的形式给予，例如结合可药用载体。所述可药用载体部分地由要给予的具体组合物以及用于给予所述组合物的具体方法确定。因此，有多种合适的本公开药用组合物的制剂。
用于肠胃外给予的制品包括无菌的水性或非水性的溶液、混悬液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油，以及可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬物，其包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠溶液、乳酸林格氏液或者非挥发油。经静脉的载体包括流体和营养素补充剂、电解质补充剂（例如基于林格氏葡萄糖溶液的那些）等。还可以含有防腐剂和其他添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
所述组合物中的一些可以以可药用的酸加成盐或碱加成盐的形式给予，所述盐通过与无机酸（例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸）和有机酸（例如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、已二酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸和反丁烯二酸）反应形成，或者通过与无机碱（例如例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾）和有机碱（例如单‑、二‑、三烃基和芳香基胺以及取代的乙醇胺）反应形成。
给予核酸分子的具体方法是本领域公知的。在一些实例中，编码所述登革病毒VLP的核酸通过注射（例如肌内注射或皮内注射）或通过基因枪给予。
可以通过单剂量或多剂量进行给予。本公开中给予受试者的剂量应该足以随时间在受试者中引起有益的治疗性应答，或者足以抑制或预防登革病毒感染。依据受试者的种类、年龄、体重和一般情况；要治疗的感染的严重程度；使用的具体组合物；及其给药模式，在不同受试者中所需的剂量也有所不同。本领域技术人员只需通过常规实验即可确定适合的剂量。
在一些实施方案中，所述登革病毒VLP的剂量是约1μg到约100μg。在具体的实例中，所述登革病毒VLP的剂量是约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg或约50μg。
在一些实施方案中，编码所述登革病毒VLP的核酸分子的剂量是约0.02μg到约20μg。在具体的实例中，编码所述登革病毒VLP的核酸分子的剂量是约0.1μg、约0.2μg、约0.4μg、约0.6μg、约0.8μg、约1.0μg、约1.5μg、约2.0μg、约2.5μg、约3.0μg、约5.0μg或约10μg。
本文提供了药用组合物，其包括单独存在或与可药用载体结合的治疗有效量的登革病毒VLP（或编码所述登革病毒VLP的核酸分子）。可药用载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。所述载体和组合物可以是无菌的，所述制剂适合给药方式。所述组合物还可以包括少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是液态溶液、混悬物、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓冲释放制剂或者粉末。所述组合物可以与常规粘合剂和载体例如甘油三酯制成栓剂。口服制剂可包括常规载体例如药品级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠（sodium saccharine）、纤维素和碳酸镁。可以使用任意常规药用载体例如无菌盐水溶液或麻油。所述介质还可以包含常规药物佐剂材料例如调节渗透压的可药用盐、缓冲物、防腐剂等。可以与本文提供的组合物和方法结合使用的其他介质有生理盐水和麻油。
本文所述的登革病毒VLP(或者编码所述登革病毒VLP的核酸分子)可以单独给予或者与其他治疗剂结合给予以增强抗原性。例如，可将所述登革病毒VLP与佐剂例如弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂结合给予。
可选地，可以使用一种或多种细胞因子（例如IL‑2、IL‑6、IL‑12、RANTES、GM‑CSF、TNF‑α或IFN‑γ）、一种或多种生长因子（例如GM‑CSF或G‑CSF）、一种或多种分子（例如OX‑40L或41BBL）或这些分子的组合作为生物佐剂(见，例如，Salgaller et al.,1998,J.Surg.Oncol.68(2):122‑38;Lotze et al.,2000,Cancer J.Sci.Am.6(Suppl1):S61‑6;Cao et al.,1998,Stem Cells 16(Suppl 1):251‑60;Kuiper et al.,2000,Adv.Exp.Med.Biol.465:381‑90)。这些分子可以系统地（或者局部地）给予所述宿主。
虽然本文描述了给予含有共有的E蛋白的VLP，但是本领域技术人员能够理解可以给予共有的E蛋白本身（不存在病毒颗粒的情况下），或者作为融合蛋白来激发受试者中的免疫应答。
提供下述实施例以说明某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限定于所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1DENV‑1VLP疫苗
所述通用登革病毒E序列是通过计算确定每种包膜基因在每个位点上的共同氨基酸结构来设计的。该序列保持了某个组、亚型或进化枝的所有登革病毒株系的表位。这产生具有高抗原活性和高免疫原活性的序列，其结果是用单一序列激发针对所有登革病毒的高度交叉反应的免疫应答。这些序列可用于针对现有的和新出现的登革病毒株系的疫苗开发。
本文公开了可用于激发识别所有登革病毒株系的免疫应答的高免疫原性序列。野生型登革病毒序列能够激发针对同源株系和进化关系相近株系的免疫应答。所述通用序列能够由单个序列激发针对当前流行的株系和将来可能出现的病原株系的免疫。
DNA疫苗质粒的构建和表达
真核表达载体pTR600此前已有描述(Mitchell et al.,Vaccine21:902‑914,2003;Green et al.,J.Virol.77:2046‑2055,2003)，被用于表达DENV‑1的prM和E基因片段。在紧邻TAG终止密码子的5’端通过定点突变引入BamHI限制性酶切位点。将DNA疫苗质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）中扩增，使用阴离子交换树脂柱（Qiagen,Valencia,CA）纯化，然后在dH2O中储存在‑20°C。通过适合的限制性酶消化和测序对质粒进行验证。使用LipofectamineTM 2000依据制造商的说明书（Invitrogen,Carlsbad,CA）将3μg DNA转染到293T细胞。转染后48小时收集细胞培养物上清液。将约1.5体积%的样品点样到10%聚丙烯酰胺/SDS凝胶上。将电泳解析的蛋白质转移到Immobilon PVDF膜(Millipore,Temecula,CA)上，并与登革病毒特异的单克隆抗体（mAb8150,Chemicon,Temecula,CA）在含0.05%Tween‑20和5%脱脂奶粉的PBS中的1:5000稀释物孵育。在充分洗涤后，使用辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠抗血清的1:10000稀释物检测结合的抗体，并用化学发光法（Western LightningTM,Perkin Elmer， Waltham,MA）显示。
接种
将购自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN,USA)的雌性C57BL/6小鼠(每组小鼠n=5‑8、6‑8周龄)通过基因枪（用包被在金弹上的2μg DNA进行粒子轰击）用每种DNA疫苗质粒进行免疫，并在第3周和第6周用相同的剂量进行加强。在一些情况下，将0.2μg或0.02μg疫苗质粒作为一个剂量响应在保持总共2μg总DNA疫苗的载体质粒混合物中给予。在接种后第5周和第8周通过眼球后途径从麻醉的小鼠中收集血液，然后将所述血液在6000rpm下离心10分钟以分离血清。将血清转移到新的小瓶并在‑20℃冷冻。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
进行定量ELISA来评估疫苗接种小鼠的血清中的抗DIII的特异性IgG。将96孔微量滴定板的每个孔用转染过的293T细胞产生的DENV1DIII蛋白在4℃包被过夜，然后用加有Tween‑20(0.05%)和脱脂奶粉(5%)的PBS封闭（25℃下持续2小时）。将每种血清样本连续稀释，并进行孵育（25℃下持续2小时）。用PBS Tween‑20(0.05%)连续洗涤后，将样本与在加入Tween‑20(0.05%)和脱脂奶粉(5%)的PBS中稀释的HRP结合的山羊抗小鼠IgG(1:5000)或者四种IgG亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3）(Southern Biotechnology，Birmingham,AL)中的一种孵育（25℃下持续1小时）。将未结合的抗体移除，在再次洗涤后，将样本与TMB底物孵育，并用酶标仪（Biotek Powerwave XS,Winooski,VT USA）测量405nm下的光密度表示的色度变化。将年龄相当的未疫苗接种血清的OD值从接种小鼠的抗血清的OD值中减去。将结果记录为：几何平均滴度(GMT)±平均值的标准误差(SEM)。
下表1示出了用编码登革病毒‑1VLP的DNA疫苗接种或者用纯化的登革病毒‑1VLP疫苗接种的小鼠的终点（endpoint）稀释滴度。所述滴度范围为1:51200到1:204800。假载体疫苗接种的小鼠或者未疫苗接种的小鼠没有任何超过1:100截值的抗体滴度。
表1.接种小鼠的终点稀释滴度
稀释物WT VLP DNAWT VLP假载体未疫苗接种1∶1000.4430.4820.0590.0561∶2000.4620.480.0630.061∶4000.430.4540.0590.0531∶8000.4020.4330.0610.0531∶16000.3420.3880.0570.0541∶32000.2720.3360.0560.0581∶64000.1960.2570.0630.0571∶128000.1450.1880.0570.0531∶256000.1090.1380.0590.0581∶512000.0820.10.0560.0571∶1024000.0680.0910.060.0561∶2048000.0670.0720.0540.057
实施例2登革病毒血清型1‑4VLP疫苗的构建
对于DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的每一种产生三种不同的疫苗构建体（分别称为pSVP、pDIII‑P28和pEctoE‑P28）。每种构建体的示意图及相应蛋白的表达示于图1。pSVP构建编码prM蛋白和共有的（“通用的”）E蛋白。pEctoE‑P28构建体编码prM蛋白和共有E蛋白的胞外结构域。pDIII‑P28构建体编码登革病毒E蛋白的DIII结构域。pEctoE‑P28和DIII‑P28构建体还编码补体蛋白C3d的四个重复的P28区。P28区的氨基酸序列如本文中SEQ ID NO:21所示。共有的E蛋白、共有的胞外结构域和DIII序列如本文中SEQ ID NO 1‑8及13‑20所示。
pSVP和pEctoE‑P28构建体的表达产生了登革病毒样颗粒（VLP）。因此，这些构建体可被用作DNA疫苗，其被给予后将在宿主中产生VLP，或者这些构建体可被用于转染细胞以产生和分离VLP。然后，可将所述分离的VLP作为基于蛋白的疫苗给予受试者。类似地，所述pDIII‑P28构建体可被作为DNA疫苗给予，这将产生DIII‑P28融合蛋白。在一些实例中，将所述pDIII‑P28构建体与VLP疫苗结合给予（例如，用pDIII‑P28进行初次疫苗接种，用VLP进行加强）。
疫苗构建体和表达
将E基因的DIII结构域（586‑705位氨基酸）克隆到tpA前导序列下游，在一些情况下，还将P28在框内克隆到紧接DIII基因的3'末端。在E基因的705位处设计人工BamHI位点和终止密码子以产生截短的Ecto E基因，并且使用所述BamHI位点将P28克隆进入所述Ecto E构建体以产生Ecto E‑P28构建体。通过SDS‑PAGE和蛋白质印迹对质粒DNA短暂转染的293T细胞的上清液进行评估，所述质粒DNA在所述上清液中表达所述四种亚型（D1、D2、D3和D4）的登革病毒的每一种的SVP、DIII‑P28或Ecto E‑P28蛋白(图1B)。转染每种所述构建体后检测细胞上清液中的蛋白质。
免疫研究
如下描述的用于免疫研究的每种构建体的疫苗接种方案和剂量见下图2。初始研究包括用DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4每一种的DNA构建体pSVP、pDIII‑P28和pEctoE‑P28以及VLP疫苗SVP疫苗接种小鼠。
通过基因枪真皮内给予后，测试所述DNA疫苗构建体激发登革病毒特异性抗体的能力。图3示出了用DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4的三种DNA构建体接种后的终点滴度。如图3所示，所述构建体的每一种在疫苗接种后激发了DIII特异性IgG抗体。
类似地，对用纯化的SVP进行免疫评估了登革病毒特异性抗体的产生。图4示出了用纯化的SVP疫苗接种（通过肌内注射）后的终点滴度。通过在登革病毒DIII包被的板上进行ELISA测量了在第8周用纯化的SVP肌内疫苗接种的小鼠的中总IgG滴度。如图4所示，每种类型的SVP(DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4)都能够激发登革病毒特异的抗体。图5示出了用所述三种DNA构建体和纯化的四价SVP接种后IgG同种型的滴度。
接下来，对四价混合物——来自DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4每一种的组合SVP——测试了肌内注射后激发登革病毒特异性抗体的能力。通过在登革病毒DIII包被的板上进行ELISA（所述板用DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3和DENV‑4任一种的DIII包被）测量了总IgG滴度。图6示出了用所述四价SVP疫苗接种后总IgG的终点滴度。所述四价混合物激发了识别所有四种不同的登革病毒血清型的DIII的抗体。
进行了进一步的研究，以针对全长登革病毒E蛋白评估抗DENV‑1、DENV‑2、DENV‑3、DENV‑4和WNV的各个交叉反应ELISA滴度。通过在登革病毒E包被的板上进行ELISA，测量了在第8周肌内疫苗接种的小鼠的总IgG滴度。如图7A‑7E所示，用每种登革病毒血清型的pSVP(SVP DNA)、纯化的SVP或纯化的EctoE‑P28(Ecto E)，或者用pSVP(SVP‑DNA tet)、SVP(SVP tet)或EctoE‑P28(Ecto E tet)的四价混合物疫苗接种小鼠。另外的小鼠用pDIII‑C3d单独或与SVP结合(pDIII‑C3d/SVP)进行疫苗接种。各种构建体激发了识别相应的E蛋白的抗体，并且在许多情况下，激发了识别其他登革病毒血清型的E蛋白的抗体。此外，用所述四价组合物进行疫苗接种产生了识别所有四种血清型的抗体。
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