检测肺癌肿瘤细胞RNA变化的试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102899405 A (43)申请公布日 2013.01.30 CN 102899405 A *CN102899405A* (21)申请号 201210347246.7 (22)申请日 2012.09.19 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 杨祚璋 地址 650118 云南省昆明市昆州路 519 号云 南省肿瘤医院骨科 (72)发明人 杨祚璋 谢琳 徐磊 李国奇 (54) 发明名称 检测肺癌肿瘤细胞 RNA 变化的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了检测肺癌肿瘤细胞 RNA 变化的 试剂盒。该试剂盒包括以下。

2、成分 ： 特异性引物、 特 异性探针、 标准DNA模板、 荧光定量PCR反应液。 本 发明还公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量 PCR 试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量 检测 novel_mir_89 的表达量， 从而检测肺癌骨转 移的发生情况。 本发明操作简便、 快速、 结果稳定、 灵敏度高且特异性强。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种 miRNA novel_mir_30。

3、 的特异性引物及特异性探针， 其特征在于， 所述的特异性 引物包括上游引物和下游引物， 其核苷酸序列分别为 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.3， 特异性 探针的核苷酸序列为 SEQ ID NO.4。 2. 一种检测肺癌骨转移的荧光定量 PCR 试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒含有权利要 求 1 所述的特异性引物和特异性探针。 3. 根据权利要求 2 所述的一种检测肺癌骨转移的荧光定量 PCR 试剂盒， 还包括 ： 标准 DNA 模板、 Hot-start Taq DNA 聚合酶， 其浓度为 2.5U/l， Hot-start TaqDNA 聚合酶的 10buffer， dNT。

4、P 混合物， 每种 NTP 浓度为 10mmol/L。 4. 权利要求 1 的引物和探针在制备检测肺癌骨转移试剂盒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102899405 A 2 1/10 页 3 检测肺癌肿瘤细胞 RNA 变化的试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及小 RNA 检测试剂盒的制备及使用方法， 具体而言， 本发明涉及以新发 现小 RNA 前体的核苷酸序列为基础， 设计特异的寡聚核苷酸引物和荧光标记探针， 采用实 时荧光定量 PCR 技术组装肺癌骨转移的检测试剂盒， 本发明也涉及其检测方法。 背景技术 0002 肺癌是当今世界上肿瘤患者死亡的首位病种， 且其发病率和死亡率呈上升趋势。

5、， 严重威胁着人类健康和生命。2000 年全世界肺癌新发病例 120 万， 死亡 110 万。造成肺癌 高病死率的主要原因是早期肺癌因无症状而发现困难， 当出现症状就诊时， 大多已经比较 严重或已肺外转移， 到了临床不可治愈的阶段。肺癌易发生骨转移， 有研究表明肺癌骨转 移发生率为 22 -81.8。(Lack E， Dickgreber N， Muller T， et a l.Randomized Phase III study of Gemcitabine and Vinorelbine versus Gemcitabine， Vinorelbine， and Cisplatin in t。

6、he treatment of Advanced Non-Small-Cell lung cancer ： From the German and Swiss Lung Cancer Smdy GroupJ.Journal of clinical Oncology， 2004， 22(12) ： 2348-2356) 0003 骨转移的常见临床症状包括 ： 程度不等的疼痛、 病理性骨折、 脊髓受压以及危及生 命的高钙血症等， 统称骨相关事件 (Skeletal related events， SREs)。骨转移瘤所引起的 疼痛等症状往往成为肺癌患者的最大痛苦， 对患者造成严重的心理影响， 是临。

7、床上降低肺 癌患者生活质量和影响患者生存的重要因素。 0004 肿瘤的浸润和转移是决定肿瘤患者预后的一个关键因素。 大部分患者并不是死于 原发部位的肿瘤， 而是死于肿瘤其它部位的扩散转移。 所谓肿瘤的转移， 是指肿瘤细胞从原 发肿瘤部位脱离， 迁徙到其他位点， 不断生长， 最终发展为转移性肿瘤。 人们很早就发现， 肿 瘤的转移不是随机性的， 而是有选择性， 具有嗜器官性的。肿瘤骨转移， 是肿瘤转移研究中 最早观察到的现象之一。骨骼的主要组成是矿物质成分， 其微环境对肿瘤细胞而言可谓严 酷， 但乳腺癌、 前列腺癌、 肺癌却极易发生骨转移， 这暗示能够转移至骨的肿瘤细胞具有改 造局 部微环境的特性。

8、。 0005 肿瘤骨转移过程涉及一系列复杂的分子事件， 是多步骤、 多因素、 多基因共同参与 的复杂过程， 肿瘤细胞首先从原发灶中分离， 通过侵袭透过肿瘤新生血管进入全身循环系 统， 在其中绝大多数癌细胞由于宿主免疫反应和血流物理压力而灭亡， 只有极少量癌细胞 可以存活， 进入骨髓腔的窦状小管， 而后穿过窦状小管的壁， 侵袭骨髓基质， 癌细胞与局部 骨组织微环境发生一系列复杂的相互作用， 导致癌细胞增殖分化， 局部骨质破坏， 形成骨转 移灶。 0006 肺癌骨转移绝大多数为溶骨性转移， 最初人们认为肿瘤骨转移引起溶骨性骨质破 坏是肿瘤细胞直接作用引起的， 然而研究证实到达局部骨组织的肿瘤细胞，。

9、 并不能直接破 坏骨组织， 而是通过分泌多种细胞因子， 包括甲状旁腺激素 (PTH)、 甲状旁腺激素相关蛋白 (PTHrP)、 IL-1、 IL-6、 前列腺素 E2 等， 直接或间接的作用于骨组织中破骨细胞， 激活破骨细 说 明 书 CN 102899405 A 3 2/10 页 4 胞引起局部骨吸收作用异常活跃， 使局部出现溶骨性的骨质破坏， 为肿瘤细胞的 “定居” 和 扩展提供了空间。同时骨基质中富含有多种生长因子， 包括转化生长因子 -(TGF-)、 纤 维母细胞生长因子(FGF)、 胰岛素生长因子(IGF)、 血小板源性生长因子(PDGF)和骨形态发 生蛋白 (BMP) 等。溶骨性骨。

10、破坏的过程中， 大量生长因子获得释放并被激活， 刺激肿瘤细胞 分裂增殖， 同时增多的肿瘤细胞进一步刺激破骨细胞分化， 骨质破坏进一步加重， 这样就形 成了一个恶性循环， 从而导致溶骨性转移灶的形成。 0007 microRNA(miRNA)是天然存在、 长约22个核苷酸的非编码RNA， 它们介导了转录后 的基因调控。 miRNAs在许多生物过程中扮演了重要角色， 包括分化和发育、 细胞信号通路以 及对感染的反应。miRNAs 表现出一种转录后调控基因表达的全新机制， 它通过结合靶基因 的 mRNA 的 3 UTR 抑制基因的表达。miRNAs 已经被证实在发育、 感染、 免疫应答、 炎症反应 。

11、和肿瘤的发生等多种生理与病理过程中发挥作用。从最初发现到现在， 已经在哺乳动物中 发现了 700 多个 miRNAs， 其中绝大部分 miRNAs 的生物学功能是未知的。已有报道， miRNAs 参与免疫应答中多方面的调控作用。研究还发现血清和血浆中可以检测到循环 miRNAs， 且 它们的表达因疾病而异， 这一发现说明循环 miRNAs 的表达特征可作为疾病诊断和预防的 生物标志物， 具有巨大潜力。 而缺乏特异的、 高敏感度的分子标志物是目前制约肺癌骨转移 早期诊断以及有效治疗的关键问 题。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种检测小 RNA 表达水平的荧光定量 PCR 试剂盒及使用方。

12、 法， 该 PCR 试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高， 定量 快速准确、 稳定性好， 具有良好的应用前景。 0009 本发明的另一目的是在于提供一种荧光定量 PCR 试剂盒对肺癌是否发生骨转移 进行快速的检测。 0010 为了实现上述目的， 本发明首先分别提取了肺癌发生骨转移患者肿瘤细胞和肺癌 未发生骨转移患者肿瘤细胞的总RNA， 并从中纯化miRNA， 利用Single-end library建库方 法， 共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞 miRNA 转录组文库。对所得的 miRNA 转录组文库 进行高通量测序， 对高通量测序序列过滤， 去除低质量序列， 使。

13、用 SOAP2 方法跟人类基因组 进行比对。并对测序结果进行分析， 其中通过 fold-change 方法， 对不同样本的表达差异基 因进行了比较， 得到了表达差异显著的 miRNA_novel_mir_30， 其序列见序列表 SEQ NO.5。 0011 本发明根据 novel_mir_30 的序列信息， 设计了四条引物， 第一条为茎环状结构的 反转录引物 RT30， 其序列见序列表 SEQ NO.1 ； 第二条是上游的特异引物 F30， 其序列见序列 表SEQ NO.2 ； 第三条为下游的通用引物R30， 其序列见序列表SEQ NO.3 ； 第四条是在荧光定 量 PCR 中需要的荧光探针引。

14、物 Flu30， 其序列见序列表 SEQ NO.4， 在荧光探针 Flu30 的 5 端标有荧光基因 FAM， 在荧光探针 Flu30 的 3 端标有荧光淬灭基团 TAMRA。 0012 本发明还制备了含有 novel_mir_30 序列的标准 DNA 模板。制备步骤方法如下 ： 提取肺癌未发生骨转肿瘤细胞的总 RNA， 从中纯化出 miRNA， 接着进行逆转录反应， 反转录 体系为 ： 茎环状结构的反转录引物 RT30， SEQ ID NO.1(2mol/L)1l， miRNA4l， dNTP 混 合物 ( 每种 2.5mmol/L)4l， 0.1mol/LDTT2l， SuperScrip。

15、t RNase H 逆转录酶 (200U/ l)2l。反应条件为 ： 37水浴 60 分钟， 95水浴 3 分钟。将逆转录反应得到的 cDNA 进 说 明 书 CN 102899405 A 4 3/10 页 5 行常规 PCR 扩增， PCR 产物检测后切胶回收并纯化， 将纯化产物连接到 PGM-T 克隆载体上， 随后转化到 DH5 感受态细胞中。通过序列为 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.3 的特异性引物 筛选阳性克隆。 阳性克隆扩增后提取质粒DNA， 质粒DNA采用NanoDropND-1000核酸定量仪 定量 (NanoDrop Technologies， Wilming。

16、ton， Delaware) 并做 10 倍系列稀释作为标准品用 于标准曲线的制备。 0013 本发明还制备了一种检测novel_mir_30表达水平的荧光定量PCR试剂盒， 组分如 下 ： 特异性引物、 特异性探针、 标准 DNA 模板、 荧光定量 PCR 反应液。其中所述的特异性引物 包括上游引物和下游引物， 上游引物序列为 SEQ IDNO.2， 下游引物序列为 SEQ ID NO.3， 特 异性探针的核苷酸序列见序列表 SEQNO.4， 在荧光探针的 5 端标有荧光基因 FAM， 在荧光探 针的 3 端标有荧光淬灭基团 TAMRA。 0014 本发明还公开了一种检测肺癌是否发生骨转移的。

17、荧光定量 PCR 试剂盒的使用方 法， 荧光定量PCR体系 ： Hot-start Taq DNA聚合酶(2.5U/l)1l， Hot-start Taq DNA聚 合酶的 10buffer 5l， dNTP 混合物 ( 每种 10mmol/L)1l， 上游引物 (10mol/L)， 下游 引物(10mol/L)， TaqMan探针(5mol/L)各1l， 样品cDNA5l或标准质粒DNA2l， 加 离子水至50l。 荧光定量PCR程序 ： 510min预变性， 接45个循环 ： 9540s， 601min。 0015 本发明还检测了本试剂盒灵敏性， 结果显示本试剂盒检测范围为 107-102。

18、copies/ l， 最小检出浓度为 100copies/l。 0016 通过对阳性样品的检测， 发现本试剂盒检测准确率达96。 连续3次重复实验， 实 验结果稳定。 附图说明 0017 图1小RNA长度在样本A和B的分布。 样本A为肺癌未转移病人的肿瘤细胞miRNA 转录组数据， 样本 B 为肺癌骨转移病人的肿瘤细胞的 miRNA 转录组数据。 0018 图 2 各浓度下标准 DNA 模板的 PCR 扩增曲线。曲线从左到右依次为浓度为 108、 107、 106、 105、 104、 103、 102个拷贝 /l 的标准 DNA 模板的 PCR 扩增曲线。 0019 图 3 标准 DNA 模。

19、板荧光定量 PCR 的标准曲线。 0020 图 4novel_mir_30 在肺癌骨转移病人和正常人中的表达量， 其中在正常人中的表 达量均值为 2112 个， 在肺癌骨转移病人中不表达。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法， 通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。 0022 实施例 1 肺癌骨转移前后肿瘤细胞 microRNA 表达的变化 0023 一材料和方法 0024 1、 材料 0025 肿瘤细胞均来自于云南肿瘤医院 2004 年 -2010 年因肺癌住院病例， 分别取 30 例 肺癌骨转移病人的肿瘤细胞和 30 例。

20、肺癌未转移病人的肿瘤细胞。 0026 2、 方法 0027 2.1 肺癌骨转移前后肿瘤细胞总 RNA 的提取 说 明 书 CN 102899405 A 5 4/10 页 6 0028 按 Trizol 试剂盒说明书提取肺癌骨转移病人和肺癌未转移病人肿瘤细胞的 RNA， 通过凝胶电泳证明 RNA 的完整性， 用核酸蛋白仪测定 RNA 的浓度和纯度。采用上海华舜生 物工程有限公司总 RNA 抽提试剂盒子提取。主要操作步骤如下 ： 0029 (1) 用胞裂解液 BL 裂解组织细胞， 离心取上层细胞。在上层细胞中加入 l ml 的 Trizol， 用带针头的一次性注射器抽打裂解物 10 次。 0030。

21、 (2) 静置 5 分钟后， 加入 200l 的氯仿， 用力颠倒离心管混匀后， 室温静置使之分 层， 12000g 离心 5 分钟， 小心移取水相至 1.5ml 的离心管中。 0031 (3) 加入等体积的异丙醇， 彻底混匀后， 取出 750l 移入吸附柱， 离心 30 秒， 倒掉 收集管中的液体， 将吸附柱移入同一收集管中， 将剩余的全部将入吸附柱中， 离心 30 秒。倒 掉收集管中的液体， 将吸附柱移入同一个收集管中。 0032 (4)加入500L RP液， 离心30秒。 倒掉收集管中的液体， 将吸附柱移入同一收集 管中。 0033 (5) 将 500l 的 W3 液， 静置 1 分钟， 。

22、离心 15 秒。 0034 (6) 将吸附柱移入一个干净的收集管中， 加入 500l W3 液， 离心 15 秒。 0035 (7) 倒掉收集管中的液体， 再将吸附柱移入同一收集管中， 离心 1 分钟。 0036 (8) 将吸附柱放入另一个干净的 1.5ml 的离心管中， 在吸附膜中央加入 50l 纯 水， 室温静置 1 分钟后， 离心 1 分钟。将 RNA 贮存于 -70。 0037 (9)总RNA完整性鉴定 ： 取2l RNA样品在1.5琼脂糖凝胶电泳(80v， 15min)， 分出区带后， EB 染色， 紫外灯下观察电泳区带。 0038 (10) 用核酸蛋白仪测定 RNA 的浓度和纯度 。

23、0039 2.2、 肺癌骨转移前后肿瘤细胞 miRNA 转录组文库的构建及测序 0040 利用 QIAGEN 公司的 RNeasy MinElute Cleanup Kit 从上述得到的总 RNA 纯化 miRNA， 具体步骤见说明书。 0041 利用 Single-end library 建库方法， 共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞 miRNA 转录组文库。 0042 将上述 miRNA 转录组文库进行高通量测序， 对高通量测序序列过滤， 去除低质量 序列， 使用 SOAP2 方法跟人类基因组进行比对。 0043 2.3、 生物信息学分析 0044 生物信息学分析流程 ： 0045 Illu。

24、mina 测序所得 50nt 序列， 通过去接头、 去低质量、 去污染等过程完成数据处 理得到干净序列， 对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。将清理后的干净 序列分类注释， 可以获得样品中包含的各组分及表达量信息。将所有小 RNA 片段注释后， 用 预测软件 Mireap 对未得到注释片段进行新的 miRNA 预测。 0046 具体生物信息学内容如下 ： 0047 数据处理 ： 对原始数据进行去除接头、 污染序列及低质量 reads 的处理， 并统计 sRNA 的长度分布， 标准信息分析 ： 0048 (1) 分析样品间的公共序列及特有序列 ； 0049 (2) 探索 sRNA 在。

25、选定的参考基因组上的分布 ； 0050 (3) 通过与 Rfam(9.1) 数据库以及 Genbank 的比对， 鉴定 rRNA、 tRNA、 snRNA 等非 说 明 书 CN 102899405 A 6 5/10 页 7 编码 RNA ； 0051 (4)通过与miRNA数据库(miRBasel6.0)中指定范围的miRNA进行比对， 鉴定样品 中的已知 miRNA ； 0052 (5) 分析已知 miRNA 的表达模式 ； 0053 (6) 通过与重复序列的比对， 鉴定与重复序列相关的 sRNA ； 0054 (7) 通过与外显子、 内含子的比对鉴定 mRNA 降解片段 ； 0055 (。

26、8) 按照优先级对 sRNA 进行分类注释 ； 0056 (9) 利用 Mireap 对没有注释的 sRNA 进行预测 ： 预测新的 miRNA， 绘制新的 miRNA 的二级结构图 ； 0057 (10) 参照 Audic S. 等人发表在 Genome Research 上的基于测序的差异基因检测 方法， 分析了肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞 miRNA 的差异表达。 0058 二结果 0059 通过使用Illumina Solexa Hiseq2000， 利用Single-end library建库方法， 共得 到两个 miRNA 转录组数据， 分别为 ： A 和 B， A 为肺癌未转移病。

27、人的肿瘤细胞 miRNA 转录组数 据， B 为肺癌骨转移病人的肿瘤细胞的 miRNA 转录组数据。 0060 1.small RNA 测序结果概述 0061 对这些初步的 35nt 左右的原始 reads 做去接头， 去低质量 reads， 去污染等处理， 得到高质量的测序 reads， 其中 A 有 25 100 000 个 reads， B 有 24 600 000 个 reads， 后续 分析均以此为基础。 0062 首先对小 RNA 做长度分布统计， 一般来说， miRNA 集中在 21 或 22nt， siRNA 集中 在 24nt， piRNA 集中在 30nt。2 个样本的 s。

28、mall RNA 均在 22nt 位置呈现出明显的单峰结构 ( 如图 1)， 说明其大多数为 miRNA。A 组中 2024nt 的 sRNAs 占细胞总 sRNA 的 51.61， B 组中 2024nt 的 sRNAs 占细胞总 sRNA 的 52.28。 0063 样品中 reads 做分类注释， 得到 2 个样本中各种小 RNA 的比例 ( 如图 2)。可以看 到 miRNA 的含量最高， 其次是未注释的 RNA(unarm)， 其可能为 siRNA 和未发现的 miRNA。 0064 2. 新 miRNA 候选基因的预测 0065 将clean reads序列做分类注释， 我们获得样。

29、品中各类小RNA的表达信息， 其包括 miRNAs， rRNA， tRNA， scRNA， snRNA， snoRNA， 重复序列相关小 RNA， mRNA 相关 RNA 和未注释的 小 RNA。除表达量最高的 miRNAs 之外， 其次就是未注释的小 RNA。 0066 对新 miRNA 的生物信息学预测， 是基于已知的 miRNA 加工成熟中的特点来实现 的， 长度为 18-25nt， 其对应前体的位置能够形成发夹样结构， 我们是利用 miRNA 预测软件 Mireap(https:/sourceforge.net/projects/mireap/) 进行的， 预测 miRNA 主要是根据。

30、 miRNA 的特殊结构 ： 1、 候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在 ； 2、 sRNA 必须在远离 发夹结构环， 位于发夹结构两臂上 ； 3、 酶切位点的保守性， 一般的 miRNA 酶切位点不会偏移 超过 3 个碱基 ； 4、 发夹前体要有较低的折叠自由能能量。分析发现了一些新的 miRNA 候选 基因， 共 107 条， 其中在骨转移前 88 条， 骨转移后 76 条。 0067 3. 肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞 miRNA 的差异表达分析 0068 为了分析肺癌骨转移前后病人 miRNA 的差异表达， 先将 A、 B 两个 miRNA 转录组的 各个miRNAs标准化， 某m。

31、iRNA标准化表达某miRNA实际数量1000000/转录组中reads 说 明 书 CN 102899405 A 7 6/10 页 8 的总数。如果某个 miRNA 在两个转录组中的标准化 reads 之和小于 1， 则被剔除不再分 析， 如果某个 miRNA 在其中一个转录组中的表达值为 0 则其标准表达值为 0.01。倍数变化 (fold-change) 计算为 Log2( 实验组 / 对照组 )。用下面方法计算 p 值 ： 0069 0070 倍数变化值大于 1 则认为 miRNA 表达上调， 倍数变化值小于 -1 则认为 miRNA 表达 下调， 特别是当 P 值小于 0.05 时，。

32、 具体结果见表 1 ： 0071 表 1 肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞 miRNA 的差异表达 0072 说 明 书 CN 102899405 A 8 7/10 页 9 0073 由于 A 为肺癌未转移病人的肿瘤细胞 miRNA 转录组数据， B 为肺癌骨转移病人的 肿瘤细胞的 miRNA 转录组数据。上述结果显示有 13 个 miRNA 表达下调， 22 个表达上调。 0074 实施例 2microRNA30 在肺癌骨转移病人和正常人中的表达分析 0075 一、 实验材料 0076 分别取 50 例肺癌骨转移病人血液和 50 正常人血液， 对 novel_mir_30 是否在肺癌 骨转病人和。

33、正常人中表达及表达量的变化进行实验验证。 0077 二、 实验方法和结果 0078 1 引物设计与合成 0079 根据 novel_mir_30 序列信息， 设计了四条引物， 第一条为茎环状结构的反转录引 物 RT30， 其序列见序列表 SEQ NO.1 ； 第二条是上游的特异引物 F30， 其序列见序列表 SEQ 说 明 书 CN 102899405 A 9 8/10 页 10 NO.2 ； 第三条为下游的通用引物 R30， 其序列见序列表 SEQNO.3 ； 第四条是在荧光定量 PCR 中需要的荧光探针引物 Flu30， 其序列见序列表 SEQ NO.4， 在荧光探针 Flu30 的 5 。

34、端标有 荧光基因 FAM， 在荧光探针 Flu30 的 3 端标有荧光淬灭基团 TAMRA。上述序列和探针由 Invitrogen 公司合成。 0080 2 定量标准曲线的建立 0081 2.1 标准 DNA 模板的制备 0082 按照说明书， 从肺癌未发生骨转移的肿瘤细胞中， 利用 QIAGEN 公司的 RNeasy Plus Mini Kit 和 RNeasy MinElute Cleanup Kit 纯化 miRNA， 接着进行逆转录反应， 反转 录体系为 ： 反转录引物 RT30SEQ ID NO.1(2mol/L)1l， miRNA4l， dNTP 混合物 ( 每种 2.5mmol/。

35、L)4l， 0.1mol/L DTT2l， SuperScript RNase H 逆转录酶 (200U/l)2l( 购 自 Invitrogen 公司 ) 反应条件为 ： 37水浴 60 分钟， 95 3 分钟。 0083 将逆转录反应得到的 cDNA 进行常规 PCR， 反应体系和条件如下 ： 10Ex Taq buffer 10ul， dNTP Mixture( 各 2.4mM)4ul， Sequence NO.2(10pmol)4ul， Sequence NO.3(10pmol)4ul， cDNA(0.1-2ug)5ul， Ex Taq DNA聚合酶0.5ul， 双蒸水补齐至100ul。

36、。 反应 条件为 94预变性 5min ； 94变性 50s， 50退火 50s， 72延伸 50s， 35cycles ； 最后 72 延伸 10min。 0084 取样5l， 对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 进行切胶回收并纯化(回 收使用试剂盒 ： EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit)， 将纯化产物连接到PGM-T克 隆载体， 随后转化到 DH5 感受态细胞中。通过序列为 SEQID NO.2 和 SEQ ID NO.3 的特异 性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒 DNA， 质粒 DNA 采用 NanoDrop ND-1000。

37、 核 酸定量仪定量 (NanoDrop Technologies， Wilmington， Delaware) 并做 10 倍系列稀释作为 标准品用于标准曲线的制备 ( 标准质粒浓度范围在 108-102copies/l)。 0085 2.2 标准曲线的建立 0086 将构建好的重组质粒测定稀释后， 计算拷贝数 /ul， 10 倍倍比稀释成 108-102 拷贝 /ul 浓度梯度， 每个浓度平行加入 3 个反应管同时进行荧光定量扩增， 反应在 BIO-RAD CFX(Bio-Rad Laboratories USA) 实时荧光定量 PCR 仪上进行， 50l 反应体 系 包 括 ： Hot-s。

38、tart Taq DNA 聚 合 酶 (2.5U/l)1l， Hot-start Taq DNA 聚 合 酶 的 10buffer7l， dNTP混合物1l， 特异性上游引物SEQ ID NO.2， 下游引物SEQ ID NO.3， 荧光探针引物 Flu301l， 去离子水补齐至 50l。反应程序为 ： 95 10min 预变性， 接 45 个循环 ： 95 40s， 60 1min。无菌水用于阴性对照， 重复 3 次， 反应结束后计算机自动绘制 标准曲线， 检测结果由 Bio-Rad CFX Manager 软件和 Excel 进行数据分析， 得到标准曲线， 起始模版在 107-103拷贝 。

39、/ul 时线性较好。 0087 2.3 敏感性实验 0088 取重组质粒按比例稀释为 108、 107、 106、 105、 104、 103、 102个拷贝 /ul， 进行荧光定量 PCR， 以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为 108-100copies/l， 最小检出浓度为 100copies/l。 0089 3qRT-PCR 检测 novel_mir_30 表达量 0090 选取 50 例肺癌骨转移病人的血液和 50 例正常人的血液。12000 转离心 10 分钟， 收集上清。 说 明 书 CN 102899405 A 10 9/10 页 11 00。

40、91 将 得 到 的 血 清 进 行 逆 转 录 反 应， 反 转 录 体 系 为 ： 反 转 录 引 物 RT30SEQ IDNO.1(2mol/L)1l， 血 液 上 清 4l， dNTP 混 合 物 ( 每 种 2.5mmol/L)4l， 0.1mol/ LDTT2l， SuperScript RNase H 逆转录酶 (200U/l)2l( 购自 Invitrogen 公司 ) 反应 条件为 ： 37水浴 60 分钟， 95 3 分钟。 0092 50l qRT-PCR 反应体系包括 ： cDNA 模板 300ng， Hot-start Taq DNA 聚合酶 (2.5U/l)1l， 。

41、Hot-start Taq DNA聚合酶的10buffer7l， dNTP混合物1l， 特异性 上游引物 SEQ ID NO.2， 下游引物 SEQ ID NO.3， 荧光探针引物 Flu30SEQ NO.4， 去离子水补 齐至50l。 荧光定量PCR程序为 ： 9510min预变性， 接45个循环 ： 9540s， 601min， 采 用NanoDrop ND-1000核酸定量仪扩增(NanoDrop Technologies， Wilmington， Delaware)。 0093 对 qRT-PCR 反应结果使用 SPSS For Windows11.5 软件， 相关数据采用 x2 检验。

42、和 Fisher 确切概率法进行处理， P 0.05 有统计学意义 ； qRT-PCR 反应利用 MedCalc 统计分 析软件来计算。 0094 结果显示 ： qRT-PCR 扩增结果稳定， 其中 novel mir30 在正常人中表达， 而在肺癌 骨转移病人中没有表达， 结果见图 3。 0095 实施例 3 一种肺癌骨转移荧光定量 PCR 检测试剂盒的制备与使用方法 0096 1、 novel_mir_30qRT-PCR 试剂盒组成 0097 0098 2.novel_mir_30qRT-PCR 的检测 0099 2.1 血清小 RNA 的制备 0100 选取 120 例肺癌骨转移病人的血。

43、液和 100 例正常人的血液。12000 转离心 10 分 钟， 收集上清。 0101 2.2cDNA 合成 0102 将 得 到 的 血 清 进 行 逆 转 录 反 应， 反 转 录 体 系 为 ： 反 转 录 引 物 RT30 SEQ IDNO.1(2mol/L)1l， 血 液 上 清 4l， dNTP 混 合 物 ( 每 种 2.5mmol/L)4l， 0.1mol/ LDTT2l， SuperScript RNase H 逆转录酶 (200U/l)2l( 购自 Invitrogen 公司 ) 反应 条件为 ： 37水浴 60 分钟， 95 3 分钟。 0103 2.3qRT-PCR 检。

44、测 说 明 书 CN 102899405 A 11 10/10 页 12 0104 qRT-PCR 在 NanoDrop ND-1000 核 酸 定 量 仪 扩 增 (NanoDrop Technologies， Wilmington， Delaware)。 qRT-PCR反应程序为 ： 9510min预变性， 接45个循环 ： 9540s， 60 1min， 体系包括 ： cDNA 模板 300ng， Hot-start Taq DNA 聚合酶 (2.5U/.l)1l， Hot-start Taq DNA 聚合酶的 10buffer7l， dNTP 混合物 1l， 特异性上游引物 SEQ I。

45、D NO.2， 下游引物 SEQ ID NO.3， 荧光探针引物 Flu301l， 去离子水补齐至 50l。 0105 3 检测结果 0106 检测结果见表 2 ： 0107 表 2 肺癌骨转移病人和正常人血液样品 PCR 检测结果 0108 例数 阳性例数 阳性率 肺癌骨转移病人 120 115 96 正常人 100 1 1 0109 以上结果显示在120例肺癌骨转移病人的样本中有115例检测结果呈阳性， 在100 例正常人中有1例假阳性， 本发明的荧光PCR试剂盒对阳性标本检测的准确率为96， 对阴 性标本检测的准确率为 99。 0110 我们对上述样本进行重复 3 次 PCR 检验， 结果重复性达 100， 表明本发明试剂盒 的重复性和稳定性较好。 说 明 书 CN 102899405 A 12 1/2 页 13 0001 序 列 表 CN 102899405 A 13 2/2 页 14 0002 序 列 表 CN 102899405 A 14 1/3 页 15 图 1 说 明 书 附 图 CN 102899405 A 15 2/3 页 16 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102899405 A 16 3/3 页 17 图 4 说 明 书 附 图 CN 102899405 A 17 。