一种防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂及其制备方法技术领域
本发明涉及畜禽用医药制剂技术领域，具体涉及防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂
及其制备方法。
背景技术
畜禽呼吸道疾病一年四季常发，尤其冬春秋季较为严重，难以根治，反复发作，困
扰畜牧业的发展，给规模化的养殖场造成巨大的经济损失。畜禽呼吸道是空气进入机体的
通道，时刻受到空气中各种微生物病原菌、粉尘、有害气体以及过高过低温度和湿度等因素
的刺激，损伤呼吸道黏膜，导致上呼吸道和支气管炎症，破坏和影响黏膜正常分泌(如黏液、
溶菌酶、干扰素等)引起支气管炎，进而影响肺组织引起通气不足造成呼吸功能障碍，继而
诱发各类呼吸道疾病甚至引发畜禽死亡。呼吸道黏膜是机体防御病原体入侵的第一道天然
屏障，呼吸道黏膜上的黏液层和黏液纤毛结构对吸入的空气起着重要的净化作用；黏膜上
皮层的杯状细胞和一些腺体所分泌的黏液中含有溶菌酶、抗胰蛋白酶和IGA抗体等活性物
质，对入侵的病原体有强大的杀灭作用；同时，在纤毛的摆动下，结合保护性咳嗽作用而将
病原体排出体外。
改善畜禽呼吸道黏膜屏障，提高呼吸道免疫功能，对于防治畜禽呼吸道疾病和提
高环境应激的抵抗力具有重要意义。目前防治畜禽呼吸道疾病的主要方法是定期消毒，如
喷洒过氧乙酸、苯扎氯铵等化学消毒剂，在杀灭有害微生物的同时也降低了有益微生物含
量，导致畜禽舍内微生态失衡，同时容易导致细菌耐药性的产生，并对畜禽表皮及黏膜造成
化学损伤。此外，还可以使用各种饲料添加剂(天然植物提取液、微生物制剂等)、复合药物
等来防治呼吸道疾病。如利用中草药鱼腥草、甘草等中草药植物提取液防治呼吸道疾病(公
开专利号CN1965993A；CN101711818A；CN105497483A)；采用延胡索酸泰妙菌素、盐酸多西环
素、替米考星、头孢喹诺、黄芪多糖等药物组合治疗畜禽呼吸道疾病(公开专利号
CN101947233A；CN102688477A；CN105168444A)；采用酪酸梭菌作主料，加入葡萄糖作基质制
成呼吸道粉剂，用于广泛的呼吸道耐药菌及真菌感染的防治，用于呼吸道耐药菌及真菌感
染的治疗(公开专利号CN 104784218 A)。然而各种抗菌药物普遍具有毒副作用，药物的残
留影响畜禽产品的质量。
发明内容
本发明的目的在于提供防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂及其制备方法。本发明提
供的生物制剂经喷洒后，能够有效提高呼吸道免疫功能，改善呼吸道菌群结构，增强呼吸道
粘膜屏障，无毒副作用，无药物残留，无耐药性、有效防治畜禽呼吸道疾病，对于促进动物健
康养殖及食品安全具有重大经济效益和社会效益。
本发明提供了一种防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂，包括枯草芽孢杆菌和地衣芽
孢杆菌。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的质量比为1：(0.5～3)。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的质量比为1：1。
优选的是，所述生物制剂的剂型为喷雾制剂。
优选的是，所述喷雾制剂的喷施浓度为所述枯草芽孢杆菌的活菌数目为1×108～
8×1010CFU/m3，所述地衣芽孢杆菌的活菌数目为1×108～8×1010CFU/m3。
本发明还提供了一种防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的制备方法，包括以下步
骤：
在无菌环境中，将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在水中混合，得到防治畜禽呼吸
道疾病的生物制剂。
优选的是，所述水的温度为30～37℃；所述水的用量为45～60ml/g混合菌。
优选的是，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌的质量比为1：(0.5～3)。
本发明提供了一种防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂，包括枯草芽孢杆菌和地衣芽
孢杆菌。本发明的生物制剂能够使畜禽呼吸道组织形态保持良好，显著提高气管免疫功能，
有效增强呼吸道粘膜屏障，降低喉部、气管可培养的好氧总菌的数量，调节呼吸道菌群结
构。即本发明的生物制剂能够有效提高呼吸道免疫功能，改善呼吸道菌群结构，增强呼吸道
粘膜屏障，有效防治畜禽呼吸道疾病。
附图说明
图1为本发明实施例4提供的肉鸡鼻腔组织切片结果图，图1A为试验组，图1B为对
照组；
图2为本发明实施例4提供的肉鸡气管组织切片结果图，图2A为试验组，图2B为对
照组；
图3为本发明实施例4提供的肉鸡肺组织切片结果图，图3A为试验组，图3B为对照
组。
具体实施方式
本发明提供了一种防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂，包括枯草芽孢杆菌和地衣芽
孢杆菌。
本发明对所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的来源没有特殊限定，采用从国家菌
种保藏中心购买得到的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌即可。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的质量比优选为1：(0.5～3)，更
优选为1：1。
在本发明中，所述生物制剂的剂型优选为喷雾制剂。当所述生物制剂为喷雾制剂
时，所述喷雾制剂优选包括还包括水。
在本发明中，所述喷雾制剂的喷施浓度以菌的活菌数计，所述枯草芽孢杆菌的活
菌数目为1×108～8×1010CFU/m3，更优选为2×1010CFU/m3，所述地衣芽孢杆菌的活菌数目
为1×108～8×1010CFU/m3，更优选为2×1010CFU/m3。
在本发明中，所述喷雾制剂的喷洒频率为1～2次/d，喷洒时间优选为11:00～13:
00；喷洒高度优选为距离畜禽体上方45～70cm处，更优选为50cm；形成的雾滴的粒径优选控
制为100～150μm。
本发明还提供了一种上述技术方案所述生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
在无菌环境中，将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在水中混合，得到防治畜禽呼吸
道疾病的生物制剂。
在本发明中，所述水的温度为30～37℃；所述水的用量为45～60ml/g混合菌。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌的质量比为1：(0.5～3)。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌的制备方法的制备方法优选包括菌种活化、种子
液培养、发酵培养和干燥步骤。
所述菌种活化的培养温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述菌种活化的培养
时间优选为18～26h，更优选为24h。
得到活化菌种，本发明优选将活化菌种进行种子液培养。将活化的菌种以1～3％
体积分数的接种量进行接种。所述种子液培养的温度优选为28～35℃，更优选为30℃，所述
种子液培养时间优选为20～28h，更优选为24h；在本发明中，所述种子液培养优选采用振荡
培养方法，振荡条件优选为100～150r/min，更优选为120r/min。
本发明对所述种子培养基没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的种子培养
基即可，如LB液体培养基。
得到种子液后，本发明优选将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。将
种子液按5～8％体积分数的接种量接种，所述发酵培养的温度优选为28～32℃，更优选为
30℃，所述发酵培养的转速优选为150～300r/min，更优选为200r/min；所述发酵培养的初
始pH值优选为7.0。所述发酵的时间优选为36～48h。
所述发酵培养采用的发酵培养基优选包括以下质量含量的组分：牛肉膏0.2～
0.5％，蛋白胨0.3～0.6％，葡萄糖0.8～1.5％，NaCl 0.2～0.8％，余量为水。所述发酵培养
基的pH值优选为7.0～7.2。
所述发酵培养基优选包括牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，
余量为水，pH值为7.0。
得到发酵液后，本发明优选对所述发酵液干燥。在本发明中，所述干燥优选为冷冻
干燥，所述冷冻干燥得到干粉；在本发明中，所述发酵液优选预先在-20℃下冻结成固态，放
入真空冷冻干燥机在-55℃、100pa下使其中的水分升华成气态，最终使发酵液脱水干燥。
得到干粉后，本发明将所述干粉粉碎后过筛，得到芽孢杆菌。在本发明中，所述过
筛优选为过50～100目筛，更优选为60目筛。本发明利用平板计数法测定干粉中的活菌数。
枯草芽孢杆菌菌含量优选为1×1010～6×1010CFU/g。
在本发明中，所述地衣芽孢杆菌的制备方法的制备方法优选包括菌种活化、种子
液培养、发酵培养和干燥步骤。所述地衣芽孢杆菌制备的工艺流程优选与枯草芽孢杆菌的
制备方法相同，所述地衣芽胞杆菌制备的具体条件优选独立地选自上述技术方案。本发明
得到的地衣芽孢杆菌菌含量优选为1×1010～6×1010CFU/g。
下面结合具体实施例对本发明所述的防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂及其制备
方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
菌株的活化及扩大培养
菌种活化:斜面试管(LB固体培养基)接种后，置于生化培养箱中，30℃培养箱24h。
种子液培养:取121℃高压灭菌30min后的无菌水3ml，洗脱斜面培养基上的芽孢杆
菌，制成菌悬液。分别取1mL芽孢杆菌菌悬液，接种于盛有100mL种子培养基(LB液体培养基)
的250mL三角瓶中。置摇床中30℃振荡培养24h，转速为120r/min。获得活力旺盛的、数量足
够的种子培养液。
发酵培养:将芽孢杆菌种子液按5％的接种量接种于发酵罐中，发酵条件为30℃，
200r/min，初始pH7.0，发酵过程中pH、溶氧浓度进行在线监测。发酵培养基为牛肉膏0.3％，
蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，pH7.2。连续发酵45h。
干燥:将发酵完成的液体发酵液在冷冻干燥机中干燥，制成干粉。将解淀粉芽孢杆
菌干粉粉碎后过60目筛，利用平板计数法测定干粉中的活菌数。枯草芽孢杆菌菌、地衣芽孢
杆菌含量均为2×1010CFU/g。
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的配制
分别称取10g地衣芽孢杆菌和10g枯草芽孢杆菌，混合均匀后加入35℃、1000ml温
水，搅拌均匀得到防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂，随后将生物制剂倒入小型喷雾器内。配
制成的悬浊液需在12h之内使用，使用前摇匀。
实施例2
菌株的活化及扩大培养
菌种活化:斜面试管(LB固体培养基)接种后，置于生化培养箱中，32℃培养箱20h。
种子液培养:取121℃高压灭菌30min后的无菌水2.5ml，洗脱斜面培养基上的芽孢
杆菌，制成菌悬液。分别取2mL芽孢杆菌菌悬液，接种于盛有100mL种子培养基(LB液体培养
基)的250mL三角瓶中。置摇床中30℃振荡培养24h，转速为120r/min。获得活力旺盛的、数量
足够的种子培养液。
发酵培养:将芽孢杆菌种子液按8％的接种量接种于发酵罐中，发酵条件为30℃，
180r/min，初始pH7.0，发酵过程中pH、溶氧浓度进行在线监测。发酵培养基为牛肉膏0.3％，
蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，pH7.0。连续发酵40h。
干燥:将发酵完成的液体发酵液在冷冻干燥机中干燥，制成干粉。将芽孢杆菌干粉
粉碎后过80目筛，利用平板计数法测定干粉中的活菌数。枯草芽孢杆菌菌、地衣芽孢杆菌含
量均为3×1010CFU/g。
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的配制
分别称取10g地衣芽孢杆菌和20g枯草芽孢杆菌，混合均匀后加入30℃、1600ml温
水，搅拌均匀得到防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂，随后将生物制剂倒入小型喷雾器内。配
制成的悬浊液需在12h之内使用，使用前摇匀。
实施例3
菌株的活化及扩大培养
菌种活化:斜面试管(LB固体培养基)接种后，置于生化培养箱中，30℃培养箱24h。
种子液培养:取121℃高压灭菌30min后的无菌水2ml，洗脱斜面培养基上的芽孢杆
菌，制成菌悬液。分别取1.5mL芽孢杆菌菌悬液，接种于盛有100mL种子培养基(LB液体培养
基)的250mL三角瓶中。置摇床中28℃振荡培养28h，转速为160r/min。获得活力旺盛的、数量
足够的种子培养液。
发酵培养:将芽孢杆菌种子液按6％的接种量接种于发酵罐中，发酵条件为30℃，
200r/min，初始pH7.0，发酵过程中pH、溶氧浓度进行在线监测。发酵培养基为牛肉膏0.3％，
蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，pH7.0。连续发酵48h。
干燥:将发酵完成的液体发酵液在冷冻干燥机中干燥，制成干粉。将解淀粉芽孢杆
菌干粉粉碎后过100目筛，利用平板计数法测定干粉中的活菌数。枯草芽孢杆菌菌、地衣芽
孢杆菌含量均为5.5×1010CFU/g。
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的配制
分别称取10g地衣芽孢杆菌和25g枯草芽孢杆菌，混合均匀后加入32℃、2000ml温
水，搅拌均匀得到防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂，随后将生物制剂倒入小型喷雾器内。配
制成的悬浊液需在12h之内使用，使用前摇匀。
实施例4
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的应用及效果
选择环境条件一致的动物人工气候舱2间，随机分成试验组和对照组，每间人工气
候舱内分割成4个区域，每个区域为一个试验重复单元。试验组鸡舍使用小型喷雾器，将实
施例1制备得到的防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂均匀喷洒于畜禽舍内环境中，使舍内每
立方米空间含有地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均为8×108CFU/m3；对照组喷洒相同剂量的
蒸馏水。喷洒频率为每天一次，每天中午12:00使用小型喷壶喷洒。喷洒高度为距离鸡体上
方50cm处，雾滴粒径控制为100μm。
测定指标及方法
在肉鸡42日龄，每个重复随机选取2只鸡，放血致死后，分离肉鸡鼻腔、气管和肺部
组织，用4℃预冷生理盐水将表面冲洗干净，固定于4％的多聚甲醛中(48h)，经脱水、透明、
石蜡包埋、切片6μm，苏木精-伊红染色、封片。普通光学显微镜下观察肉鸡鼻腔、气管、肺组
织形态学变化。
采用酶联免疫吸附法测定肉鸡气管洗脱液免疫球蛋白含量；采用平皿培养法测定
肉鸡喉管和气管总需氧菌。
防治畜禽呼吸道疾病生物制剂对肉鸡呼吸道组织形态的影响
鼻腔粘膜可见多种上皮、软组织及骨组织，部分粘膜表面为假复层纤毛柱状上皮，
部分为腺上皮。试验组黏膜上皮完整性较好，纤毛无明显脱落，黏膜下层有腺体增生(图
1A)。对照组黏膜上皮存在间断性脱失现象，纤毛部分脱落，黏膜下层有炎性细胞浸润(图
1B)。气管管腔内侧壁为假复层纤毛柱状上皮。粘膜下层有少许混合腺、动脉、静脉及神经组
织。试验组气管粘膜上皮完整性较好，纤毛形态完好(图2A)。对照组上皮黏膜上皮有脱失现
象，黏膜固有层有炎性细胞渗出(图2B)。试验组肺房完好，无破裂，肺脏内有充血现象，无炎
性渗出现象(图3A)。对照组肺脏内有出血现象，可见轻度水肿及炎性渗出物(图3B)。
表1防治畜禽呼吸道疾病生物制剂对肉鸡
气管洗脱液免疫球蛋白含量的影响
如表1所示，喷洒防治畜禽呼吸道疾病生物制剂后肉鸡气管洗脱液SIgA和IgG含量
分别显著提高14.35％和18.35％(P<0.05)，IgM含量呈上升趋势(0.05<P<0.1)。表明防治畜
禽呼吸道疾病的生物制剂对提高气管免疫功能效果显著。
表2防治畜禽呼吸道疾病生物制剂对肉鸡
呼吸道好氧总菌的影响(log CFU/g)
如表2所示，防治畜禽呼吸道疾病生物制剂能够显著降低肉鸡喉、气管的好氧总菌
数量(P<0.05)，从而调节呼吸道菌群结构。
通过临床试验表明，防治畜禽呼吸道疾病生物制剂能够维持肉鸡呼吸道黏膜完整
性，改善呼吸道免疫功能，改善呼吸道菌群结构，从而提高肉鸡健康水平。
实施例5
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的应用及效果
将实施例2制备得到的防治畜禽呼吸道疾病生物制剂喷施于黄羽肉鸡舍环境中。
选择2栋建筑结构相同，环境条件一致的鸡舍，饲养规模为3000只/栋，其中一栋鸡舍为对照
组，另一栋鸡舍为试验处理组，在养殖过程中使用小型喷雾器，将实施例2制备得到的防治
畜禽呼吸道疾病的生物制剂均匀喷洒于舍内环境中。2栋鸡舍的黄羽肉鸡均采食相同的基
础日粮，自由采食和饮水。饲养试验为期6周。在黄羽肉鸡0-10周龄正常饲养，10-16周龄开
展防治畜禽呼吸道疾病生物制剂喷施。
喷施条件同实施例4，区别之处在于黄羽肉鸡种鸡舍每立方米空间含有地衣芽孢
杆菌8×108CFU/m3和枯草芽孢杆菌1.6×109CFU/m3；对照组喷洒相同剂量的蒸馏水。喷洒频
率为每天一次，每天中午12:00使用小型喷壶喷洒，喷洒高度为距离鸡背上方60cm处，雾滴
粒径控制为130μm。
如表3所示，通过各指标的测定，得出黄羽肉鸡舍连续使用防治畜禽呼吸道疾病生
物制剂，16周末试验组较对照组公母鸡平均体重多28.5克/只，料肉比降低0.17，成活率提
高2.1％，呼吸道发病率降低10％，饲养每只鸡利润提高0.12元，在饲养过程中，可以观察到
能够显著降低鸡只死亡率，提高肉鸡出栏体重。
表3防治畜禽呼吸道疾病生物制剂对黄羽肉鸡生产性能的影响
实施例6
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的应用及效果
将实施例3制备得到的防治畜禽呼吸道疾病生物制剂喷施于蛋鸡舍中。喷施条件
同实施例4，区别之处在于蛋鸡舍内每立方米空间含有地衣芽孢杆菌5×109CFU/m3和枯草芽
孢杆菌1.25×1010CFU/m3；对照组喷洒相同剂量的蒸馏水。喷洒频率为每天一次，每天中午
12:00使用小型喷壶喷洒，喷洒高度为距离猪体上方70cm处，雾滴粒径控制为150μm。
通过各指标的测定，得出蛋鸡舍连续使用防治畜禽呼吸道疾病生物制剂，能够提
高产蛋率5％，提高蛋重2.7％，提高采食量3.5％，显著提高蛋鸡成活率3％。提高蛋鸡细胞
因子水平，其中IL-1提高10％，IL-6提高8.7％，TNF-α提高5％，提高蛋鸡呼吸道菌群香浓指
数3.8％和丰富度6.38％。证明蛋鸡舍使用防治畜禽呼吸道疾病生物制剂，能够有效改善蛋
鸡呼吸道免疫功能，改善呼吸道菌群结构，从而提高蛋鸡健康水平。
实施例7
防治畜禽呼吸道疾病的生物制剂的应用及效果
将实施例3制备得到的防治畜禽呼吸道疾病生物制剂喷施于猪舍环境中。选择2栋
建筑结构相同，环境条件一致的猪舍，其中一栋猪舍为对照组，另一栋猪舍为试验组，选取
体重45kg左右日龄一致的三元杂交生长育肥猪(杜×长×大)80头，随机分在2栋猪舍内，自
由采食和饮水，免疫按照猪场常规程序进行。试验期为30天。喷施条件同实施例4，区别之处
在于猪舍内每立方米空间含有地衣芽孢杆菌5×109CFU/m3和枯草芽孢杆菌1.25×1010CFU/
m3；对照组喷洒相同剂量的蒸馏水。喷洒频率为每天一次，每天中午12:00使用小型喷壶喷
洒，喷洒高度为距离猪体上方50cm处，雾滴粒径控制为120μm。
在养殖过程每日观察并记录各组猪群健康情况(采食、粪便、发病等)。在试验结束
后，测定生产性能和腹泻率，测定血液免疫球蛋白含量。
通过各指标的测定，得出猪舍连续使用防治畜禽呼吸道疾病生物制剂，日增重提
高10.9％，料重比降低5.8％，显著降低育肥猪的腹泻率。提高血清IgM含量9.0％，提高IgG
含量8.4％，提高IgA含量6.1％。在养殖过程中观察到使用防治畜禽呼吸道疾病生物制剂
后，与对照组相比，生猪咳嗽、气喘现象明显减少，呼吸正常，食欲正常，粪便正常，成活率明
显提高。证明猪舍使用防治畜禽呼吸道疾病生物制剂，能够有效改善呼吸道免疫功能，改善
呼吸道菌群结构，从而提高生猪的健康水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。