化合物sclerotiorin在制备抗结核病药物中的应用技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及化合物sclerotiorin在制备抗结核病
药物中的应用。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，通常影响肺部，是全世界最主要的
致命传染病之一。结核病在世界的各个地方都会发生，主要集中在亚非拉地区，全世界约有
三分之一的人口有潜伏性结核。根据世界卫生组织2015全球结核病控制报告，在2015年，共
有960万人患结核病，150万人死于结核病。虽然在过去的二十年，中国结核病例及死亡率持
续大幅下降，但中国在世界十大结核病高发国家中排名第三，仅次于印度、印尼。结核病是
一种可治可防的疾病，标准的抗结核药物已经使用了数十年，但结核分枝杆菌对这些药物
的耐药性正在不断增长。世界卫生组织统计，在2014年全世界约有48万人患耐多药结核病，
其中超过一半的病例发生在印度、中国和俄罗斯。在中国，耐药性结核病呈不断上升的趋
势。目前，结核病防治形势仍十分严峻，抗结核药物的研制与开发迫在眉睫。
结核分枝杆菌是一种胞内病原菌，细菌进入肺部后会被巨噬细胞吞噬，在细胞内
生长增殖。由于细菌高脂质含量的细胞壁，抗生素类药物难以渗透细菌发挥作用。细菌生长
缓慢加上细胞壁的保护作用，细菌在遇上逆境时可进入休眠状态，代谢活动降低，生长几乎
停止，抵抗外界不良生长环境，不易被抗菌药物杀灭，能够在宿主细胞内长期潜伏，使得结
核菌很难完全清除。另外，结核分枝杆菌能够通过向细胞内分泌效应蛋白，调整宿主的信号
途径，让自已能够躲避宿主的免疫反应，成功在宿主内生长繁殖；最大程度的抑制结核分枝
杆菌在宿主体内生成是防治结核病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供化合物
sclerotiorin在抑制细胞内结核分枝杆菌生长的应用。
本发明的第二个目的是提供sclerotiorin联合一线抗生素抑制巨噬细胞内结核
分枝杆菌生长的应用。
本发明的第三个目的是提供化合物sclerotiorin在制备抗结核药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供化合物sclerotiorin与一线抗生素联合在制备抗结
核病的药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种抑制结核分枝杆菌胞内增殖的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
化合物sclerotiorin在抑制细胞内结核分枝杆菌生长的应用，所述化合物
sclerotiorin的结构式为：
。
前期研究发现化合物sclerotiorin具有很好的抑制PKnG酶活性的效果，但后期研
究：利用化合物sclerotiorin对结核分枝杆菌的抑菌圈实验和最小抑制浓度（MIC）实验，以
检测化合物对细胞外结核分枝杆菌的生长抑制。实验发现，胞外结核分枝杆菌在
sclerotiorin的处理下没有形成抑菌圈，并且在MIC测定时，最高的化合物浓度（100mg/L）
下菌仍然生长，检测孔颜色反应为粉色，说明化合物对菌的生长没有抑制作用，因此抑制
PKnG酶并不一定就能够减少结核分枝杆菌的增殖。
本发明通过实验发现化合物sclerotiorin能够抑制哺乳动物巨噬细胞内结核分
枝杆菌的增殖，所述化合物sclerotiorin可以是来源于海洋微生物天然代谢活性产物。
化合物sclerotiorin与利福平或者异烟肼联合，也能够显著抑制巨噬细胞的增
殖；具体地，化合物sclerotiorin与利福平或者异烟肼联合对巨噬细胞J774A.1内的牛型结
核杆菌BCG的增殖具有更强的抑制作用：在单独使用20μM，40μM，80μM浓度化合物
sclerotiorin时，细胞内结核菌数减少了23%，58%，81%；在单独使用0.005mg/L，0.025mg/L，
0.05mg/L利福平时，细胞内结核菌数减少了51%，76%，85%；在单独使用0.01 mg/L，0.05 mg/
L，0.1 mg/L异烟肼时，细胞内结核菌数减少了13%，30%，45%。当40 μM化合物sclerotiorin
与0.025mg/L利福平联合，胞内抑菌率达84%，比单独使用同浓度sclerotiorin或利福平的
抑菌率明显提高，且与单独0.05mg/L利福平的效果相当。当40 μM化合物sclerotiorin与
0.05 mg/L异烟肼联合，胞内抑菌率达45%，比单独使用同浓度异烟肼的抑菌率明显提高，与
单独0.1 mg/L异烟肼的效果相当。
因此，本发明还提供化合物sclerotiorin与一线抗生素联用在抑制细胞内结核分
枝杆菌生长的应用，所述一线抗生素为利福平或者异烟肼；所述化合物sclerotiorin的结
构式为：
。
本发明还提供化合物sclerotiorin在制备抗结核药物中的应用，所述化合物
sclerotiorin的结构式为：
。
本发明还提供化合物sclerotiorin与一线抗生素联用在制备抗结核病的药物中
的应用，所述一线抗生素为利福平或者异烟肼；所述化合物sclerotiorin的结构式为：
。
本发明还提供一种抑制结核分枝杆菌胞内增殖的方法，是将20～40μM化合物
sclerotiorin与0.005～0.05mg/L利福平或者0.01～0.1mg/L异烟肼共处理感染106CFU的
结核分枝杆菌的细胞。
具体地，上述方法可以是：以小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1为宿主细胞，用牛型结核
杆菌（Mycobacterium bovis）BCG菌株对细胞进行感染，感染结束后使用20～40μM
sclerotiorin与0.005～0.05mg/L利福平或者0.01～0.1mg/L异烟肼共处理细胞，72小时后
裂解细胞，将裂解液涂布于7H10平板上，37℃倒置培养3～4周，对平板上长出的结核菌落进
行计数以测定胞内细菌的增殖情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究发现化合物sclerotiorin能够抑制结核分枝杆菌在细胞内的增殖，且
与利福平或者异烟肼联合，能够有效地减少巨噬细胞内结核分枝杆菌的增殖，化合物
sclerotiorin是从海洋微生物分离的天然代谢活性小分子产物，其结构已被解析，可通过
大规模发酵分离生产，来源丰富，生产成本低；在40μM 化合物sclerotiorin与0.025mg/L利
福平处理下，或者在40μM 化合物sclerotiorin与0.05 mg/L异烟肼处理下，细胞内的结核
分枝杆菌数量分别减少了84%、45%，且在减少抗生素用量的前提下达到相当的效果；本发明
具有结核病治疗的临床应用潜力。
附图说明
图1为单独使用不同浓度化合物sclerotiorin处理后细胞内结核菌数；其中，横坐
标对应化合物sclerotiorin的浓度，分别为0 μM，20μM，40μM，80μM，纵坐标是细胞内结核菌
数（菌落形成单位，CFU）。
图2为化合物sclerotiorin与利福平联合处理后细胞内结核菌数；其中，横坐标是
利福平的浓度，纵坐标是细胞内活菌数（菌落形成单位，CFU），化合物sclerotiorin浓度为0
μM，20μM，40μM。
图3为化合物sclerotiorin与异烟肼联合处理的细胞内结核菌数；其中，横坐标是
异烟肼的浓度，纵坐标是细胞内活菌数（菌落形成单位，CFU），化合物sclerotiorin浓度为0
μM，20μM，40μM。
图4为化合物sclerotiorin与链霉素联合处理的细胞内结核菌数；其中，横坐标是
链霉素的浓度，纵坐标是细胞内活菌数（菌落形成单位，CFU），化合物sclerotiorin浓度为0
μM，20μM，40μM。
图5为化合物sclerotiorin与乙胺丁醇联合处理的细胞内结核菌数；其中，横坐标
是乙胺丁醇的浓度，纵坐标是细胞内活菌数（菌落形成单位，CFU），化合物sclerotiorin浓
度为0 μM，20μM，40μM。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本
发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单
修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术
人员所熟知的常规手段。
化合物sclerotiorin用DMSO进行溶解，母液浓度为20mM，在-20℃避光下保存。
利福平用DMSO进行溶解，母液浓度为50 mg/mL，在20℃避光下保存。
异烟肼用去离子水溶解，抽滤、灭菌，母液浓度为10 mg/mL，在20℃避光下保存。
牛型结核杆菌（Mycobacterium bovis）BCG菌株的培养：培养结核分枝杆菌所用的
7H9（美国BD公司产品）和7H11（美国BD公司产品）培养基，均添加了终浓度为0.5%的甘油和
10%的OADC增菌液（美国BD公司产品）。另外，7H9培养基还需添加0.05% Tween 80。牛型结核
杆菌BCG接种于7H11平板上，37℃倒置培养2～3周，直至平板上长出一层菌苔。
小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1的培养：小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1生长在含10%牛血
清（FBS，美国Gibco公司产品）的RPMI1640培养液（美国Gibco公司产品），于37℃的CO2培养
箱中培养。当细胞贴壁生长的汇聚度达到80%时，进行传代。传代时，弃去培养瓶中的培养
基，加入2 mL RPMI1640培养基，轻轻晃动以除去未贴壁的细胞。弃上清，加入2 mLRPMI1640
培养基，用细胞刮收集瓶中的J774A.1细胞，置于15 mL离心管中，1000 rpm离心3分钟。弃上
清，加入2 mL含10% 牛血清的RPMI1640培养液，充分吹打重悬细胞。将细胞重悬液加入7 mL
含10% 牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃的 CO2培养箱中静置培养。
实施例1 J774A.1胞内增殖实验
当小鼠肺泡巨噬细胞J774A.1贴壁汇聚度达到80%～90%时，弃培养基，加入预热的
RPMI1640培养基把不贴壁的细胞洗脱下来。加入2 mL RPMI1640培养基，用细胞刮收集细胞
并置于15 mL离心管中，室温1000rpm离心3分钟。弃上清，用1 mL含10% 牛血清的RPMI1640
培养液重悬细胞。取少量重悬细胞，用血球计数器对细胞计数，计算细胞密度。用含10% 牛
血清的RPMI1640培养液将细胞重悬液的密度调节至1×106个/mL，按1 mL/孔将稀释后的细
胞分装至6孔细胞培养板中。将细胞板置于37℃的 CO2培养箱过夜，使细胞充分贴壁。
在7H11平板上，刮取2～3周菌龄的牛型结核杆菌BCG菌苔，并用20 mL预热的PBS缓
冲液重悬，加入5 mL玻璃珠涡旋震荡10分钟。600 rpm离心10分钟，保留上清菌液。用预热的
含10% 牛血清的RPMI1640培养液将菌液稀释至浓度为1×107 CFU/mL，按100 μL/孔将稀释
后的菌液加入至过夜培养的6孔细胞培养板中，置于37℃的 CO2培养箱培养4小时，让细胞
吞噬结核菌。4小时后，弃培养液，按2 mL/孔用预热的PBS洗细胞3次，将没有吞入细胞的结
核菌洗掉。分别加入3 mL含有不同浓度化合物sclerotiorin、sclerotiorin与利福平、
sclerotiorin与异烟肼、sclerotiorin与链霉素、sclerotiorin与乙胺丁醇的细胞培养液，
置于37℃的 CO2培养箱培养72小时。3天后，按2 mL/孔用预热的PBS洗细胞3次，加入1 mL
0.05% SDS，静置5分钟。将细胞裂解液置于15 mL离心管，涡旋震荡5分钟，充分裂解细胞及
悬浮菌体。用7H9培养基对裂解液进行适当稀释，均匀涂布于7H11平板，37℃倒置培养3～4
周后，计算菌落数，结果如表1和表2。
从图1可以看出，单独使用20μM，40μM，80μM浓度化合物sclerotiorin时，细胞内结
核菌数分别减少23%，58%，81%。
从图2和表1可以看出，单独使用0.005mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L利福平时，细胞
内结核菌数减少了51%，76%，85%；当40 μM化合物sclerotiorin与0.025mg/L利福平联合，胞
内抑菌率达84%，比单独使用同浓度sclerotiorin或利福平的抑菌率明显提高，且与单独
0.05mg/L利福平的效果相当。
从图3和表2可以看出，单独使用0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L异烟肼时，细胞
内结核菌数减少了13%，30%，45%。当40 μM化合物sclerotiorin与0.05 mg/L异烟肼联合，胞
内抑菌率达45%，比单独使用同浓度异烟肼的抑菌率明显提高，与单独0.1 mg/L异烟肼的效
果相当，当使用化合物sclerotiorin时，可以减少一半抗生素异烟肼的用量。
对比例1
实验方法同实施例1，不同的是测定化合物sclerotiorin与临床抗结核药物链霉素的
联合作用（图4），结果表明：当把化合物sclerotiorin加入到不同浓度的链霉素后，两种合
用药物的胞内活菌数明显上升，抑菌率下降，即化合物sclerotiorin与链霉素联合不能增
强胞内抑制结核分枝杆菌生长的效果，反而降低药效，相互拮抗。
对比例2
实验方法同实施例1，不同的是测定化合物sclerotiorin与临床抗结核药物乙胺丁醇
的联合作用效果（图5），结果表明：当把化合物sclerotiorin加入到不同浓度的乙胺丁醇
后，两种合用药物的胞内活菌数增加，抑菌率比单独用药有所下降，即化合物sclerotiorin
与乙胺丁醇组合不适于联合治疗。