一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用技术领域
本发明属于分子生物学领域和基因工程技术领域，具体涉及一种具有杀菌活性的
仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
仿刺参(Apostichopus japonicus)属棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲
(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，刺参科(Stichopodidae)，主要分布在北纬
35°～44°的西北太平洋沿岸，山东、辽宁和河北是我国仿刺参的主要养殖区。仿刺参位列
“海八珍”之首，具有很高的营养价值和医药价值。近年来，随着人们社会生活条件的提高和
健康意识的增强，仿刺参市场需求量逐年增加，不断刺激养殖规模加大，仿刺参因此成为我
国水产养殖业中单一产值最大的养殖品种。但是养殖过程中遇到的病害问题一直是困扰产
业进一步发展的重要制约因素。利用生物技术的手段进行疾病防治越来越引起人们的重
视。
肽聚糖(Peptidoglycan)是存在于革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁中的一种复合糖
类。主链是β-1,4-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的杂多糖。肽聚糖是
许多细菌细胞壁的主要成分，尤其在革兰氏阳性细菌中，其所含的肽聚糖占细胞壁干重的
50～80％。
肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein,PGRP)是识别和结合肽
聚糖的模式识别分子。通过识别入侵菌原菌的肽聚糖，进而激活Toll信号通路(Toll-like
receptors)途径和免疫缺陷(Immune Deficiency,IMD)途径等免疫信号通路并介导吞噬作
用，因此在抵抗病原入侵的过程中发挥着重要的作用。
1996年，Yoshida H首次在家蚕血淋巴中发现肽聚糖识别蛋白，随后在鱼类、软件
动物和一些脊椎动物中也相继被发现。根据它们的序列结构特点，肽聚糖识别蛋白可以分
为两个亚型，即长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖识别蛋白(PGRP-S)。而目前对
于仿刺参肽聚糖识别蛋白尚未有报道。发掘仿刺参的功能基因，制备生物抗菌药物，有助于
解决当前养殖中抗生素抗药性问题，因此具有十分重要的理论和现实意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请提供一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白的
制备及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白，仿刺参肽聚糖识别蛋白(AJ-PGRP)
为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。
肽聚糖识别蛋白(AJ-PGRP)的制备方法为：
(1)以仿刺参cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，待用；
(2)PCR产物经纯化后与载体pEASY-E1载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌，测
序鉴定重组子；
(3)将上述表达载体pEASY-AJ-PGRP转入Trans BL21(DE3)化学感受态细胞，筛选
转化子，将转化子接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG诱导表达，而后用亲和层析
柱纯化重组蛋白，即得到序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列的肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP。
所述引物分别为：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGTGCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTAT
AATTTCTTG-3’。
本发明还公开了仿刺参肽聚糖识别蛋白的应用，所述序列表SEQ ID NO.1中氨基
酸序列的AJ-PGRP用于制备广谱抗菌类制剂或饲料添加剂。
本发明还公开了所述仿刺参肽聚糖识别蛋白用于制备抗金黄色葡萄球菌、大肠杆
菌、灿烂弧菌和枯草芽孢杆菌的制剂。
本发明具有的优点：本发明利用体外重组表达技术首次获得了仿刺参肽聚糖识别
蛋白AJ-PGRP，该重组蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有凝集作用，对金黄色葡萄球
菌、大肠杆菌、灿烂弧菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用，在开发新型广谱抗菌药物开发和饲
料添加剂等方面具有潜在应用价值。
本发明获得的仿刺参肽聚糖识别蛋白AJ-PGRP对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具
有凝集作用，同时对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有明显抑制作用，在开发新型广谱抗菌
药物开发和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测到的蛋白表达图，其中1为诱导表达的目的蛋白，2为MARKER；
图2为本发明实施例提供的对细菌的凝集作用图；
图3为本发明实施例提供的抑菌活性图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：仿刺参AJ-PGRP编码区的原核重组表达，具体步骤如下：
1.原核重组表达载体的构建
本发明采用北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司的pEASY-E1原核
表达载体。利用特异性引物PCR扩增AJ-PGRP的全部编码区。PCR反应程序设置为：①94℃预
变性4min，②94℃变性30s；③52℃复性30s；④72℃延伸1min。⑤72℃终延伸10min。将步骤
②③④进行40个循环。将PCR产物进行纯化回收，与pEASY-E1载体连接。连接产物转化大肠
杆菌Trans BL21(DE3)，挑选5～10个单个菌落接种于LB液体培养基，并送测序公司测序，以
验证阅读框的正确性，所述特异性引物分别为：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGT GCCTT-3’，R1:
5’-ATGGTGATGTAT AATTTCTTG-3’。
重组蛋白的表达：将验证正确的菌株接种于50mL的LB液体培养基，置于振荡培养
箱中，37℃200rpm中培养12～16小时，然后将此培养液以1:100的比例接种于新LB的200mL
液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.8。加入IPTG，使之终浓度达到1mM，18℃继续培养10小
时。使用His.Bind树脂纯化重组蛋白，pH梯度下洗脱，即可得到序列表SEQ ID NO.1中氨基
酸序列的蛋白。
SEQ ID NO.1
MDEPPRAFPITLVVLGIILAMSCADKSAYAKTDAACPVIVSRSDWQAKPPKNRTDMATPVPFVILHHTL
WDECYDFESCCAEMRKIQDFHQGNRSWDDIGYNFCVGQDGRIYEGRGWDTVGAHAPWYNLRSIGICIMGNFTVKLPN
QKSVDAVSSLIKCAIEENKLKDSYILYGHRQVRDTGCPGDALFKEIQSWPHWKPGQHYPPNQSKPVSQQEIIHHH
序列特征：
长度：221个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线型
特征：分子量为25.07kDa，等电点为6.54，具有一个保守的PGRP结构域。
来源：仿刺参
实施例2：仿刺参AJ-PGRP编码区的原核重组蛋白的细菌凝集活性分析
对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)(G+菌)和灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、大肠杆菌(Escherichia coli)(G-菌)的
凝集实验
将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃培养至
OD值至0.6，灿烂弧菌采用TCBS培养基在25℃培养至OD值至0.6，然后用生理盐水稀释至OD
值为0.001，然后5000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用含10mM ZnCL2的TBS缓冲液洗涤两次
后重悬，使菌浓度调至2×109个细胞/mL。将20μL重组蛋白分别加入96孔板中，然后加入10μ
L菌液，室温孵育1h，阴性对照组将重组蛋白用牛血清白蛋白(BSA)代替。结果发现重组蛋白
可以凝集上述4种检测菌。
实验表明重组AJ-PGRP蛋白能够有效凝集革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
实施例3：仿刺参AJ-PGRP原核重组蛋白的抑菌活性分析
对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌(G+菌)和灿烂弧菌、大肠杆菌(G-菌)的生长抑制
实验
将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃培养
至OD值至0.6，灿烂弧菌接种到TCBS培养基在25℃培养至OD值至0.6，取200uL培养液加入到
事先高温灭菌、冷却至50℃的35ML LB固体培养基中，倒入90mm的玻璃平皿中，待其完全凝
固后，用打孔器打2个直径为5mm的孔，分别加入45uL的空载体表达蛋白和重组蛋白(含20uM
ZnCl2)。将平皿30℃培养48小时。观察发现在加了重组蛋白的孔周围形成了明显的抑菌圈，
对革兰氏阳性菌的抑菌圈比革兰氏阴性菌大。只加了空白载体的孔周围没有形成抑菌圈。
实验表明重组AJ-PGRP蛋白能够有效抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌也有明
显的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要
付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种具有杀菌活性的仿刺参肽聚糖识别蛋白及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 221
<212> PRT
<213> 仿刺参（Apostichopus japonicus）
<400> 1
Met Asp Glu Pro Pro Arg Ala Phe Pro Ile Thr Leu Val Val Leu Gly
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Met Ser Cys Ala Asp Lys Ser Ala Tyr Ala Lys Thr
20 25 30
Asp Ala Ala Cys Pro Val Ile Val Ser Arg Ser Asp Trp Gln Ala Lys
35 40 45
Pro Pro Lys Asn Arg Thr Asp Met Ala Thr Pro Val Pro Phe Val Ile
50 55 60
Leu His His Thr Leu Trp Asp Glu Cys Tyr Asp Phe Glu Ser Cys Cys
65 70 75 80
Ala Glu Met Arg Lys Ile Gln Asp Phe His Gln Gly Asn Arg Ser Trp
85 90 95
Asp Asp Ile Gly Tyr Asn Phe Cys Val Gly Gln Asp Gly Arg Ile Tyr
100 105 110
Glu Gly Arg Gly Trp Asp Thr Val Gly Ala His Ala Pro Trp Tyr Asn
115 120 125
Leu Arg Ser Ile Gly Ile Cys Ile Met Gly Asn Phe Thr Val Lys Leu
130 135 140
Pro Asn Gln Lys Ser Val Asp Ala Val Ser Ser Leu Ile Lys Cys Ala
145 150 155 160
Ile Glu Glu Asn Lys Leu Lys Asp Ser Tyr Ile Leu Tyr Gly His Arg
165 170 175
Gln Val Arg Asp Thr Gly Cys Pro Gly Asp Ala Leu Phe Lys Glu Ile
180 185 190
Gln Ser Trp Pro His Trp Lys Pro Gly Gln His Tyr Pro Pro Asn Gln
195 200 205
Ser Lys Pro Val Ser Gln Gln Glu Ile Ile His His His
210 215 220