一种猪细小病毒病活疫苗用稀释液技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒病活疫苗用稀释
液。
背景技术
猪细小病毒（Porcine parvovirus , PPV）属于细小病毒科( Paruovirdae )细小
病毒属（Parvovirus），是引起猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一，尤其是初产母猪的繁殖
障碍，表现为母猪受胎率降低，产活仔数减少和/或出现早产、流产、畸形胎、死胎、木乃伊
胎、弱仔等。该病毒在环境中可存活数月之久，且对大多数消毒剂具有较强抵抗力，目前该
病毒已遍布全世界，给养猪业带来巨大的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展。PPV具
有单一的血清型，免疫接种是预防本病的主要措施。
猪细小病毒病活疫苗在使用时需要用疫苗稀释剂进行稀释，目前通常选用注射用
水或生理盐水，但这样稀释出的疫苗，免疫效价整齐度不高，不同批次疫苗间的差异较大，
且接种发病猪后存在应激反应和过敏反应，大大降低了猪细小病毒病活疫苗的免疫效果。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种猪细小病毒病
活疫苗用稀释液，该稀释液可有效减少不同批次疫苗间的差异，提高疫苗抗体效价整齐度，
减少接种发病猪的应激反应和过敏反应。
为解决上述技术问题，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提
取物1-5g、枸杞多糖5-10g 、黄芪皂苷Ⅱ 20-80mg和聚肌胞1-5g。
进一步的，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物2-4g、
枸杞多糖6-8g 、黄芪皂苷Ⅱ 30-60mg和聚肌胞2-3g。
进一步的，本发明每1000ml PH=7的磷酸盐缓冲液中包含：双花连翘提取物3g、枸
杞多糖7.5g 、黄芪皂苷Ⅱ 50mg和聚肌胞2.5g。
其中，本发明所述双花连翘提取物的提取包括以下步骤：按1:1的重量称取金银花
和连翘，混合，加入10-12倍量50-60%的乙醇，超声提取10-15min，收集提取液，重复提取3
次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
其中，本发明所述枸杞多糖的制备包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将
残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：8-15加入蒸馏水，以
300-350W的功率微波提取5-10min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，
用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶
解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
其中，本发明所述pH=7的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：
a．称取下列原料组分：氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢
钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g和六水氯化镁0.05-0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条
件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
本发明中黄芪皂苷Ⅱ由成都曼斯特生物科技有限公司生产销售， 聚肌胞由南京
奥多福尼生物科技有限公司生产销售。
本发明的有益效果：
中药免疫增强剂主要为补益类药物，可以通过激活一种或多种免疫活性细胞，增强机
体的免疫功能，使低下的免疫功能上调至正常水平。还可以作为辅助药物与一些疫苗合用，
增强免疫应答，提高免疫效应。本发明所提供的稀释液中添加有姬松茸多糖、穿心莲提取
物、人参皂苷Rh2和姜黄素，均为中药免疫增强剂，通过各组分科学合理的配比，可有效激活
机体免疫活性细胞，增强免疫性能。因为本发明不仅可以降低疫苗批间差异性，提高整体免
疫水平，还可以提高疫苗的免疫效果，延长疫苗保护期。此外，本发明易生产，成本低廉，且
使用方便。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。本发明中所述实施例仅用于说
明解释本发明而不对本发明的范围构成限制。
实施例1:
1、制备双花连翘提取物，包括以下步骤：
按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入10倍量60%的乙醇，超声提取15min，收集提
取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
2、制备枸杞多糖，包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将
残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：8加入蒸馏水，以300W
的功率微波提取10min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，
用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶
解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠6g、氯化钾0.05g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.05g、氯
化钙0.05g和六水氯化镁0.05g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条
件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：双花连翘提取物1g、枸杞多糖5g 、黄芪皂苷Ⅱ 20mg和聚肌胞1g；
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，
过滤除菌，即得猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
实施例2：
1、制备双花连翘提取物，包括以下步骤：
按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入12倍量50%的乙醇，超声提取10min，收集提
取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
2、制备枸杞多糖，包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将
残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1： 15加入蒸馏水，以
350W的功率微波提取5min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，
用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶
解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯
化钙0.2g和六水氯化镁0.2g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条
件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：双花连翘提取物5g、枸杞多糖10g 、黄芪皂苷Ⅱ 80mg和聚肌胞5g；
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水化，
过滤除菌，即得猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
实施例3：
1、制备双花连翘提取物，包括以下步骤：
按1:1的重量称取金银花和连翘，混合，加入11倍量55%的乙醇，超声提取13min，收集提
取液，重复提取3次，将所得提取液混合，蒸发浓缩，冻干，即可得双花连翘提取物。
2、制备枸杞多糖，包括以下步骤：
（1）将枸杞置于60℃恒温箱中干燥至恒重，粉碎备用；
（2）预处理：称取步骤（1）中粉碎后的枸杞，用90%乙醇回流1h，弃去溶剂，收集残渣，将
残渣风干备用；
（3）微波提取：称取步骤（2）中所制备的枸杞残渣，按料液比为1：10加入蒸馏水，以330W
的功率微波提取8min，离心，去除沉淀，收集上清液；
（4）浓缩步骤（3）中所得上清液，再利用95%乙醇进行沉淀，将所得沉淀溶解于重蒸水，
用Sevag法脱蛋白，脱蛋白步骤重复5次，得粗多糖溶液；
（5）向步骤（4）中所得粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶，在60℃、pH=6.0的条件下酶
解3h，干燥，即可得精制枸杞多糖。
3、配制pH=7的磷酸盐缓冲液：
a．称取下列原料组分：氯化钠8g、氯化钾0.35g、磷酸氢二钠1.1g、磷酸二氢钾0.25g、
氯化钙0.12g和六水氯化镁0.15g，混合均匀备用；
b．向步骤a中所得原料组分的混合物中加入1000mL的双蒸水，充分溶解后，在116℃条
件下高压灭菌30min，即得pH=7的磷酸盐缓冲液。
4、制备稀释液
A．称取原料组分：双花连翘提取物3g、枸杞多糖7.5g 、黄芪皂苷Ⅱ 50mg和聚肌胞
2.5g。
B．将步骤A中所称取的原料组分依次加入1000ml pH=7的磷酸盐缓冲液中，振荡水
化，过滤除菌，即得猪细小病毒病活疫苗用稀释液。
免疫效果对比试验：
利用本发明实施例1至3所制备的猪细小病毒病活疫苗用稀释液分别将猪细小病毒病
活疫苗稀释至1头份/ml，备用。利用PH=7的磷酸盐缓冲液将猪细小病毒病活疫苗稀释至1头
份/ml，备用。将50头经检测猪细小病毒病抗体、抗原呈双阴性的28日龄健康断奶仔猪分为
五组，每组10头，A组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；B
组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；C组注射实施例3制
得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；D组注射用pH=7的磷酸盐缓冲液稀释
后的猪细小病毒病活疫苗1.0ml/头；E组作为空白对照组，注射pH=7的磷酸盐缓冲液1.0ml/
头。各组分别在免疫后7d、14d、21d、28d、60d、90d、150d和180d采血，分离血清，测其 PPV HI
抗体，结果如表1所示。
表1 HI测定结果
注：“-”表示HI抗体效价低于检测限。
安全性试验：
利用本发明实施例1至3所制备的猪细小病毒病活疫苗用稀释液分别将猪细小病毒病
活疫苗稀释至1头份/ml，备用。将70头经检测猪细小病毒病抗体、抗原呈双阴性的28日龄健
康断奶仔猪分为七组，每组10头，第一组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病
活疫苗3.0ml/头；第二组注射实施例1制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗5.0ml/
头；第三组注射实施例2制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗3.0ml/头；第四组注射
实施例2制得的稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗5.0ml/头；第五组注射实施例3制得的
稀释液稀释后的猪细小病毒病活疫苗3.0ml/头；第六组注射实施例3制得的稀释液稀释后
的猪细小病毒病活疫苗5.0ml/头；第七组不注射，作为对照组。免疫后进行跟踪观察5天，观
察记录猪的体温、采食、精神状况及生长发育情况，结果如表2所示。
表2 安全性测试结果
注：无体温升高，采食、精神状况及生长发育情况即可视为正常。
综上可知，本发明不仅生产方便、成本低廉、使用方便安全，还可有效降低不同批
次疫苗间的差异，提高疫苗免疫的整体效果。
需说明的是，本发明中所用黄芪皂苷Ⅱ购买于成都曼斯特生物科技有限公司，聚
肌胞购于南京奥多福尼生物科技有限公司。本发明中未提及的具体实验方法，按常规实验
方法进行。