一种丝素蛋白纳米球的制备方法(一)技术领域
本发明涉及一种适用于控制药物缓释的丝素蛋白基纳米球的制备方法，属于生物
医学技术领域。
(二)背景技术
目前，从生物医用材料的发展趋势看来，人工合成聚合物等不可降解或者降解产
物的生物相容性欠佳的材料将逐步减少，而具备良好的生物相容性及体内可吸收性的天然
生物材料将受到青睐。天然生物材料在结构、力学、和生物降解性能可控的情况下，在临床
应用中具备巨大潜力。
在众多天然生物材料中，来源于天然蚕丝的丝素蛋白，由于其易加工、生物相容性
好，力学强度高，降解速率慢，降解产物为氨基酸等优点，近年来，在组织工程领域被广泛研
究。例如，通过编织可以制备网状支架材料用于软组织加强，通过冷冻干燥技术可以制备多
孔海绵状支架材料用于骨组织修复，通过高压电喷技术可以制备出微球结构支架材料用于
药物缓释等。其中，在药物缓释载体中，丝素蛋白由于降解缓慢，且降解产物为氨基酸，人体
可吸收，无毒副作用，提供了一种新的选择。同时，将丝素蛋白与药物复合制备成球状适合
注射，同时丝素蛋白分子的特殊分子结构有利于稳定敏感性分子的结构，保护蛋白类功能
分子生物活性，有利于临床应用。
在以往的丝素蛋白微球、纳米球的制备过程中，多采用高压电喷法、反相乳液法、
喷雾干燥法等方法制备。其中，高压电喷法需要在高压静电场中进行，对设备要求较高，产
量较低；反相乳液法容易在材料中引入有机杂质；喷雾干燥法制备的丝素蛋白球粒径均一
性有待改进，且工艺复杂，设备要求高。在此，本发明提供了一种简便的丝素蛋白纳米球制
备方法，可稳定制备粒径均一的丝素蛋白纳米球。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种简便的丝素蛋白纳米球制备方法，快速、稳定地获得粒径
均一、分散性良好的丝素蛋白纳米球，同时最大程度减少有机试剂在制备过程中的应用，以
减少生产过程中的污染同时提高产物的生物安全性。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种丝素蛋白纳米球的制备方法，所述方法为：将质量浓度0.1％～
5％的丝素蛋白水溶液与无水乙醇(优选4℃预冷1h)充分混合，-25℃～-18℃下冷冻12～24
小时，再在4～40℃下解冻，离心(优选4000-15000rpm)，取沉淀用去离子水清洗(优选去离
子水体积用量为沉淀体积的5-20倍)，重复离心和水洗(优选重复3-10次)，取最后一次水洗
后的沉淀干燥(优选下列方式之一进行干燥：20-25℃室温干燥、40℃真空热干燥或--30℃
冷冻干燥)，即为丝素蛋白纳米球；所述无水乙醇与丝素蛋白水溶液体积比为1～10:10。
进一步，所述丝素蛋白水溶液按如下方法制备：将蚕茧剪碎后浸入质量浓度0.2％
无水碳酸钠水溶液(优选无水碳酸钠水溶液体积用量以蚕茧质量计为0.1g/L)，煮沸60～
120分钟，过滤，取滤饼用去离子水清洗，50℃干燥，获得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维溶
于9.3mol/L溴化锂水溶液或三元溶液(优选在65-70℃溶解，所述溴化锂水溶液或三元溶液
体积用量以能够溶解为准，优选以蚕茧质量计为5-10ml/g)中，以去离子水为透析液进行透
析，取透过液用去离子水配制成质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液；所述三元溶液由
氯化钙、乙醇、水以体积比为1:2:8混合而成。
进一步，所述丝素蛋白水溶液中添加有功能药物，所述功能药物为生长因子bFGF-
2、促生长因子IGF-1、表皮细胞生长因子EGF、重组人骨形态发生蛋白BMP2、成骨蛋白OP-1、
阿霉素或盐酸吉西他滨中的一种。
进一步，所述功能药物添加量以丝素蛋白水溶液体积计为10-100μg/L，优选10-75
μg/L。
进一步，所述功能药物加入到丝素蛋白水溶液中，2-8℃、30-150rpm充分混合5-6
分钟，即获得含功能药物的丝素蛋白水溶液。
进一步，所述方法按如下步骤制备：(1)将桑蚕或柞蚕的蚕茧剪碎加入质量浓度
0.2％无水碳酸钠水溶液中煮沸60～120分钟，过滤，滤饼用去离子水洗涤，50℃干燥，获得
丝素蛋白纤维；
(2)将丝素蛋白纤维溶于9.3mol/L溴化锂水溶液或三元溶液中(优选在65-70℃溶
解)，加入透析袋中，以去离子水为透析液透析2-4天，取透过液用去离子水配制成质量浓度
0.1％～5％的丝素蛋白水溶液；所述透析袋截留分子量为3500；
(3)将功能药物溶于步骤(2)丝素蛋白水溶液，于2-8℃、30-150rpm充分混合5-6分
钟，获得含药丝素蛋白水溶液；所述功能药物为生长因子bFGF-2或重组人骨形态发生蛋白
BMP2；
(4)将丝素蛋白水溶液或含药丝素蛋白水溶液与无水乙醇以体积比1～3:1混合，-
20℃下冷冻12～24小时；再于20～35℃下解冻，4000-15000rpm离心后，取沉淀用5-20倍体
积的去离子水清洗，重复离心和水洗过程3-10次；取最后一次水洗后的沉淀，通过20-25℃
室温干燥、40℃真空热干燥或-30℃冷冻干燥，获得所述丝素蛋白纳米球。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：前期的制备方法多采用高压电
喷法或反相乳液法制备，操作较为复杂，且使用大量有机试剂。本发明制备过程操作简便，
不涉及高压、极端温度等条件，使用设备简单易得，适合稳定批量生产；其次，所用试剂安全
性高污染小，对制备过程环境影响小，材料中残留的试剂可通过水洗除去，有利于提高产物
的生物安全性。
(四)附图说明
图1丝素蛋白纳米球的扫描电镜图。
图2丝素蛋白纳米球在大鼠皮下注射。(a)皮下注射造模；(b)皮下注射1周后；(c)
皮下注射3个月后。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于
此：
实施例1：
将50g桑蚕蚕茧剪碎，放入5L沸腾的质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中，持续煮
沸90分钟进行脱胶处理，过滤，收集滤饼，用去离子水反复清洗5遍，除去表面残留的碳酸
钠，后50℃干燥，即为丝素蛋白纤维。将干燥后的丝素蛋白纤维溶解于250mL 9.3mol/L溴化
锂水溶液(65℃)，完全溶解后，将丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量：3500)中，于去离
子水中透析3天，每天换水2次，除去溴化锂。用去离子水将透析后获得的丝素蛋白水溶液浓
度调整至质量浓度1％。
无水乙醇于4℃冰箱中预冷1小时。取10mL无水乙醇加入100mL、质量浓度1％丝素
蛋白水溶液中，迅速混合均匀，容器封口后放入-20℃冰箱中冷冻18小时后，取出混合液，于
20℃解冻，得到的悬浊液使用离心机于12000rpm离心30分钟后，去掉上清，用100mL去离子
水清洗沉淀物，重复该清洗、离心步骤5遍，最后将沉淀物于20℃晾干，即可得到丝素蛋白纳
米球。使用扫描电子显微镜观察获得的丝素蛋白纳米球(图1)，其分散良好，直径为100nm～
200nm。
实施例2：
将50g柞蚕蚕茧剪碎，放入5L沸腾的质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中，持续煮
沸120分钟进行脱胶处理，过滤，收集滤饼，用去离子水反复清洗获得的丝素蛋白纤维5遍，
除去表面残留的碳酸钠，后50℃干燥，即为丝素蛋白纤维。将干燥后的丝素蛋白纤维溶解于
500ml、70℃三元溶液(氯化钙/乙醇/水体积比为1:2:8)中，完全溶解后，将丝素蛋白溶液装
入透析袋(截留分子量：3500)中，于去离子水去离子水中透析4天，每天换水2次，除去残留
溶剂。用去离子水将透析后获得的丝素蛋白水溶液浓度调整至质量浓度5％。
将5μg bFGF-2溶于100mL、质量浓度5％丝素蛋白水溶液中，于4℃，30rpm速度下混
合30分钟，得含bFGF-2丝素蛋白溶液。
无水乙醇于4℃冰箱中预冷1小时。取30mL无水乙醇加入100mL含bFGF-2的丝素蛋
白溶液中，迅速混合均匀，容器封口后放入-20℃冰箱中冷冻24小时后，取出混合液，于25℃
解冻，得到的悬浊液使用离心机于12000rpm离心30分钟后，去掉上清，用100mL去离子水清
洗沉淀物，重复该清洗、离心步骤5遍，最后将沉淀物于25℃晾干，即可得到含bFGF2丝素蛋
白纳米球，直径为50nm～150nm。
实施例3：
将50g桑蚕生丝放入5L沸腾的质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中，持续煮沸60分
钟进行脱胶处理，过滤，取滤饼，用去离子水去离子水反复清洗5遍，除去表面残留的碳酸
钠，后50℃干燥，即为丝素蛋白纤维。将干燥后的丝素蛋白纤维溶解于500ml、70℃三元溶液
(氯化钙/乙醇/水体积比为1:2:8)中，完全溶解后，将丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子
量：3500)中，于去离子水中透析4天，每天换水2次，除去残留溶剂。用去离子水将透析后获
得的丝素蛋白水溶液浓度调整至质量浓度2％。
将1μg BMP-2溶于质量浓度2％、100mL丝素蛋白水溶液中，于4℃，30rpm速度下混
合30分钟，得含BMP-2丝素蛋白溶液。
无水乙醇于4℃冰箱中预冷1小时。取30mL无水乙醇加入100mL含BMP-2丝素蛋白溶
液中，迅速混合均匀，容器封口后放入-20℃冰箱中冷冻12小时后，取出混合液，于35℃解
冻，得到的悬浊液使用离心机于12000rpm离心30分钟后，去掉上清，用100mL去离子水清洗
沉淀物，重复该清洗、离心步骤5遍，最后将沉淀物于40℃真空热干燥，即可得到含BMP-2丝
素蛋白纳米球，直径为100nm～200nm。
实施例4：
将50g柞蚕生丝放入5L沸腾的质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中，持续煮沸90分
钟进行脱胶处理，过滤，取滤饼，用去离子水去离子水反复清洗5遍，除去表面残留的碳酸
钠，后50℃干燥，即为丝素蛋白纤维。将干燥后的丝素蛋白纤维溶解于250mL 9.3mol/L溴化
锂水溶液中(65℃)，完全溶解后，将丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量：3500)中，于去
离子水中透析4天，每天换水2次，除去残留溶剂。用去离子水将透析后获得的丝素蛋白水溶
液浓度调整至质量浓度0.1％。
将7.5μg BMP-2溶于100mL丝素蛋白水溶液中，于4℃，30rpm速度下混合30分钟，得
含BMP-2丝素蛋白溶液。
无水乙醇于4℃冰箱中预冷1小时。取100mL无水乙醇加入100mL丝素蛋白水溶液
中，迅速混合均匀，容器封口后放入-20℃冰箱中冷冻24小时后，取出混合液，于4℃解冻，得
到的悬浊液使用离心机于12000rpm离心30分钟后，去掉上清，用100mL去离子水清洗沉淀
物，重复该清洗、离心步骤5遍，最后将沉淀物于-30℃低温真空冷冻干燥，即可得到含BMP-2
丝素蛋白纳米球，直径为50nm～250nm。
实施例5
软组织修补填充：将经实施例2制备获得的丝素蛋白纳米球分散在注射用生理盐
水中，注射到大鼠皮下用于促进软组织再生。大鼠经腹腔麻醉后腹部备皮，在其腹中线的
左、右两侧各标记2个注射区域(每只鼠4个注射位点)，相邻两点间距离2cm以上。提起注射
区皮肤，使用1mL注射器插入针头至真皮深层间，避开血管，注射200μL样品(图2中a)。1周
后，处死大鼠，观察注射部位丝素蛋白纳米球的分布以及周围软组织状况(图2中b)。注射部
位在1周后仍可清楚的观察到植入的丝素蛋白纳米球隆起，但隆起体积较注射当日减小
16％左右，周围组织未见红肿等炎症反应，说明丝素蛋白纳米球已部分被吸收，且植入体内
不会引起明显的不良反应，具有良好的生物相容性。植入3月后，外观自然，且未发生化脓等
不良反应，仍可观察到少量纳米球存在(图2中c)，植入部位被新生纤维组织填充，表明是一
种良好的药物载体。