血管内皮生长因子基因肌肉表达质粒及其构建和应用 本发明涉及一种基因药物，可应用于心血管病的防治。
血管内皮生长因子(VEGF)是1989年由Gosdoarowicz等从垂体泸泡细胞培养液中分离纯化出的一种活性多肽，具有促进血管内皮细胞分裂和血管生长的作用。1991年Tischer等分析出VEGF的基因的结构，1992年我们研究室进行了VEGF基因的克隆，并在大肠杆菌中高效表达出VEGF的蛋白质。1994年shmel和Takeshita等应用VEGF蛋白质，进行血管内持续滴注，证明可以防治实验性动物的血管闭塞症和心肌梗塞。但是VEGF蛋白质制备难，价格昂贵，用量大，必须持续不间断的长期血管内注射才能奏效。
本发明的目的在于应用基因重组技术，构建出一种能在肌肉组织中高效表达的VEGF真核表达载体，作为一种基因药物，直接进行肌肉注射和转移，使其在肌肉组织中长期、持续、高效、特异地表达VEGF蛋白质，而应用于心血管病，特别是闭塞性血管病和心肌梗塞的治疗，以基因药物取代多肽类药物。
本发明是以如下方法实现的：
(1)应用RT-PCR技术克隆出人VEGF基因。
(2)将CMV启动子和PolyA尾整合进人的VEGF基因中，形成具有高效表达的PCDNA3/VEGF的真核表达质粒。
(3)将含有CMV启动子和PolyA的人VEGF基因，整合进缺陷型腺病毒载体中，形成具有高效染性VEGF重组的假腺病毒(Adv(5)/VEGF)。
(4)将VEGF真核表达质粒(PCDNA3/VEGF)或重组VEGF基因缺陷性腺病毒(Adv(5)/VEGF)，制备成基因注射液或涂布在手术缝合线上，制备成VEGF的基因缝线。
(5)应用VEGF基因注射液进行肌肉注射或将VEGF基因缝线，缝合于肌肉组织中。可以长期，稳定，高效表达出具有生物活性的VEGF，它可以明显促进血管的新生和侧枝循环的适应。给血管闭塞性疾病的动物肌肉内注射和转移，可以十分有效的改善缺血症状，防治组织的坏疽，具有防治血管闭塞性疾病地明显效果。
VEGF基因药物与VEGF多肽类药物相比，具有以下优点：
(1)简便易行，一次应用可以长期表达，可以避免多肽药物分离纯化复杂，成本高，易降解，需多次长期，持续应用才能奏效的缺点。
(2)安全、特异、持续、稳定，一次注射其疗效至少可以持续一个月以上。
(3)闭塞性血管病进行VEGF基因的肌肉内转移，可以避免腺病毒载体全身应用所产生的付作用，可以避免腺病毒载体所引起的免疫反应，瞬时表达和需重复使用的缺点。
(4)VEGF基因肌肉内转移，可以排除血管内转移所引起的血行扩散，用量少，效率高，特异性强，付作用少，效果好。
(5)一但构建出VEGF真核表达载体和腺病毒载体，可以大量扩增生产。成本低，生产易，可以长期保存，亦无需特别分离纯化的设备。
(6)用途广泛。
本发明不仅可以应用于闭塞性血管病，缺血性心脏病和心肌梗塞的治疗，亦可应用于断肢再植，冠状动脉再狭窄的防治，创伤愈合，器官移植等多种疾病的治疗。