一种GO/nHA/胶原复合骨修复材料及其制备方法技术领域
本发明属于生物医学复合材料领域，具体涉及一种氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/
胶原复合骨修复材料及其制备方法。
背景技术
人体骨组织小面积缺损可以通过自我修复能力得到再生，但该自愈能力受到年
龄、疾病及其它因素限制，因此人工合成的骨修复、骨替代材料从上世纪60年代开始就成为
人们关注的焦点。目前，通过组织工程在体外构建骨修复材料填补到缺损部位来治疗骨组
织的缺损，正成为一种修复骨组织缺损的理想治疗方法。
胶原是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，是细胞外基质（ECM）的主要成分，是皮
肤、血管、骨骼、肌腱、牙齿和软骨的主要成分，属结构蛋白，具有维持皮肤和各组织器官的
形态结构的功能。胶原的三螺旋结构决定了其具有良好的生物特性，如低毒性、弱抗原性、
生物相容性、促进细胞生长、可降解吸收等，因而在人工骨修复材料中具有广阔的前景。
碳元素是构成整个自然界的基本元素之一，也是人们认识最早的一种元素，其独
特的物理化学性质和形态随着科技的不断进步和发展而逐渐被人们发现。氧化石墨烯（GO）
由石墨经氧化处理并超声剥离后得到，原始石墨是疏水的，经过氧化以后表面会形成大量
的含氧基团如羧基、羟基、羰基、环氧基等，从而使氧化石墨烯具有了良好的水溶性和生物
相容性。以氧化石墨烯为基础制备的复合材料其弹性模数、拉伸强度、热稳定性和电导率等
方面均具有良好的性能。但是，氧化石墨烯具有一定的生物毒性，与细胞作用会对细胞膜造
成损害。而胶原作为细胞外基质组份，能紧密吸附于氧化石墨烯表面。此外，氧化石墨烯表
面缺陷也能成为蛋白质的吸附点，且氧化石墨烯的生物毒性在吸附蛋白质之后大幅度降
低。
纳米羟基磷灰石（nHA）属于生物活性陶瓷，其组成中含有能够通过人体正常新陈
代谢途径进行置换的钙、磷等元素，还含有能与人体组织发生键合的羟基（-OH）基团。nHA具
有与骨相似的化学成分、晶体结构、摩擦系数、比重、导热系数及绝对强度。天然骨由低结晶
度的羟基磷灰石和胶原组成，因此，模仿天然骨的成分、结构和特性而制备的纳米羟基磷灰
石/胶原复合骨修复材料可以具有天然骨组织类似功能，从而应用于骨组织缺损修复。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合骨修复材料
及其制备方法，该复合材料将具有良好生物相容性和骨组织缺损修复性能，是一种可用于
骨组织缺损修复的新型医用材料。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种GO/nHA/胶原复合骨修复材料，其是由氧化石墨烯、纳米羟基磷灰石和胶原复合交
联而成；其中氧化石墨烯、纳米羟基磷灰石和胶原的质量比为2.5~5:20~25:100。
所述胶原来源于鱼皮、猪皮、牛皮或牛腱。
所述GO/nHA/胶原复合骨修复材料的制备方法包括以下步骤：
（1）将氧化石墨烯粉末加水后超声分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；
（2）将冻干的胶原溶于体积浓度为0.3%的丙二酸溶液中，得到质量浓度为0.4%的胶原
溶液；其中胶原与所用丙二酸的质量比为0.4:100；
（3）将所得氧化石墨烯分散液与胶原溶液混合搅拌4 h，得均匀的氧化石墨烯-胶原混
合液；
（4）将纳米羟基磷灰石粉末逐渐加入到所得氧化石墨烯-胶原混合液中，搅拌混匀，冻
干并交联；交联所用交联液是将30.026 g D-核糖、100 mL丙酮、20 mL氨水混合后，加纯水
定容至1000 mL。
（5）将交联后所得复合材料用去离子水反复冲洗，再次冷冻干燥后，得到氧化石墨
烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合膜。
其中，所述氧化石墨烯是采用改进的Hummers法制备而成，其具体操作如下：
1）将108 mL H2SO4、12 mL H3PO4冰浴搅拌混合10 min后，缓慢加入5 g石墨粉、2.5g
NaNO3；
2）称取15g KMnO4，在保证反应温度低于5℃的条件下，将其分3-5次逐渐加入步骤1）所
得溶液中，冰浴搅拌反应3 h，然后在40℃水浴条件下搅拌60 min；
3）将水浴升温至98℃持续搅拌60 min，期间缓慢持续加入去离子水至混合液体积为
400 mL，然后停止加热，待混合液温度降至室温，再加入15 mL H2O2；
4）反应结束后，将混合液离心取沉淀，并将沉淀用体积浓度5%盐酸和纯水反复清洗，至
洗液pH接近中性；
5）将洗涤后的沉淀冷冻干燥，得到氧化石墨烯粉末。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明采用了具有良好生物相容性的胶原、优异机械性能的氧化石墨烯以及与骨
具有相似结构成份的纳米羟基磷灰石为原料制备复合骨修复材料，使所得材料在保证良好
生物活性的同时兼顾了机械强度，且该方法原料易得，操作简单，便于规模化生产。
（2）D-核糖无细胞毒性，本发明中以D-核糖替代传统使用的甲醛为原料制备交联
剂，利用其可与胶原反生美拉德反应，使所形成的胶原纤维排列更加致密有序，从而获得优
异的交联效果。
附图说明
图1为氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合骨修复材料的扫描电镜图。
图2为成骨细胞在不同GO含量的氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合骨修复材
料上的MTT试验柱状统计图。
图3为不同GO含量的氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合骨修复材料的机械性
能检测图，其中（A）拉伸强度、（B）杨氏模量、（C）断裂伸长率。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的
技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
氧化石墨烯的合成：
1）将108 mL浓H2SO4和12 ml浓H3PO4于反应瓶中混合，冰浴搅拌十分钟后，缓慢加入5 g
石墨粉和2.5 g NaNO3；
2）称取15 g KMnO4，在保证反应温度低于5℃的情况下，将其分3-5次逐渐加入步骤1）
所得溶液中，冰浴搅拌反应3 h，然后移至40℃水浴条件下搅拌60 min；
3）将水浴升温至98℃持续搅拌60 min，期间缓慢持续加入去离子水至混合液体积为
400 mL，然后停止加热，待混合液温度降至室温，再加入15 mL H2O2；
4）反应结束后，将混合液离心取沉淀，并将沉淀用体积浓度5%盐酸和纯水反复清洗，至
洗液pH接近中性；
5）将洗涤后的沉淀冷冻干燥，得到氧化石墨烯粉末。
所用交联液的配方为：将30.026 g D-核糖、100 mL丙酮、20 mL氨水混合后，加纯
水定容至1000 mL。
实施例1
（1）称取冻干的牛腱胶原0.4 g，将其溶于99.6 mL体积浓度为0.3%的丙二酸中，得到质
量浓度为0.4%的胶原溶液，并继续搅拌4 h；
（2）将0.08 g纳米羟基磷灰石粉末逐渐加入到所得胶原溶液中，磁力搅拌8 h，冻干48
h后，在1000 mL交联液中交联；
（3）将交联后所得复合膜用去离子水反复冲洗，再次冷冻干燥后，得到GO含量为0wt%的
纳米羟基磷灰石/胶原复合膜。
实施例2
（1）将0.005 g氧化石墨烯粉末加水后超声分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；
（2）称取冻干的牛腱胶原0.4 g，将其溶于99.6 mL体积浓度为0.3%的丙二酸中，得到质
量浓度为0.4%的胶原溶液；
（3）将所得氧化石墨烯分散液与胶原溶液混合搅拌4 h，得均匀的氧化石墨烯-胶原混
合液；
（4）将0.095 g纳米羟基磷灰石粉末逐渐加入到所得氧化石墨烯-胶原混合液中，磁力
搅拌8 h，冻干48 h后，在1000 mL交联液中交联；
（5）将交联后所得复合膜用去离子水反复冲洗，再次冷冻干燥后，得到GO含量为1wt%的
氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合膜。
实施例3
（1）将0.01 g氧化石墨烯粉末加水后超声分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；
（2）称取冻干的牛腱胶原0.4 g，将其溶于99.6 mL体积浓度为0.3%的丙二酸中，得到质
量浓度为0.4%的胶原溶液；
（3）将所得氧化石墨烯分散液与胶原溶液混合搅拌4 h，得均匀的氧化石墨烯-胶原混
合液；
（4）将0.09 g纳米羟基磷灰石粉末逐渐加入到所得氧化石墨烯-胶原混合液中，磁力搅
拌8 h，冻干48 h后，在1000 mL交联液中交联；
（5）将交联后所得复合膜用去离子水反复冲洗，再次冷冻干燥后，得到GO含量为2wt%的
氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合膜。
实施例4
（1）将0.02 g氧化石墨烯粉末加水后超声分散2 h，得2 mg/mL的氧化石墨烯分散液；
（2）称取冻干的牛腱胶原0.4 g，将其溶于99.6 mL体积浓度为0.3%的丙二酸中，得到质
量浓度为0.4%的胶原溶液；
（3）将所得氧化石墨烯分散液与胶原溶液混合搅拌4 h，得均匀的氧化石墨烯-胶原混
合液；
（4）将0.08 g纳米羟基磷灰石粉末逐渐加入到所得氧化石墨烯-胶原混合液中，磁力搅
拌8 h，冻干48 h后，在1000 mL交联液中交联；
（5）将交联后所得复合膜用去离子水反复冲洗，再次冷冻干燥后，得到GO含量为4wt%的
氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石/胶原复合膜。
图1为实施例4所得复合材料的扫描电镜图。从图中可以看出，该复合材料呈疏松
多孔的三维结构，其孔隙率达90%以上，且孔隙内部相互贯通。
1. 将所制备的GO含量分别为0%、1%、2%和4%的复合材料按25 kGy的剂量进行钴60
辐照灭菌，然后分别浸入每孔含0.5 mL DMEM/F12培养基的孔板中；5 h后每片材料表面分
别接种1×104个第3代状态良好成骨细胞，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养5 h后，将
材料移至含新鲜培养基的孔板中继续培养，每隔2 d换液一次；分别于培养第1、4、7 d取出
材料，PBS清洗3次，进行常规MTT检测，用酶标仪检测490 nm处吸光度值。以时间为横坐标，
吸光度值（OD Value）为纵坐标绘制4种复合材料上的细胞增殖图，所得结果如图2所示。
从图2中可见，成骨细胞均表现出正常的增殖状态，且含有GO的复合材料上成骨细
胞活性在第7 d时较不含GO的复合材料高，表明该复合材料对成骨细胞无明显细胞毒性，具
有良好的生物相容性，其作用的发挥与GO的引入有关。
2. 将所制备的GO含量分别为0%、1%、2%和4%的复合材料按需求剪好，将两端夹持
在专用夹具上，对试样施加静态拉伸负荷，横梁速度为2 mm/min，测绘出样品在拉伸变形过
程中的拉伸应力～应变曲线，并计算各组材料弹性模量、杨氏系数大小，分析材料机械性
能，所得结果如图3所示，其中A为拉伸强度、B为杨氏模量、C为断裂伸长率。
从图3A中可见，GO含量为0%时的拉伸强度为0.9 MPa，而添加了GO的复合材料拉伸
强度得到提高，最大达到了1.28 MPa（4 wt% GO），提高率42.2%。从图3B中可见，杨氏模量随
GO含量的增加而增加。从图3C中可见，当GO含量小于1wt％，复合材料的断裂伸长率呈降低
趋势并在含量为1 wt％时达到最小值；当GO含量大于1wt％时，复合材料的断裂伸长率又呈
增长趋势。以上结果表明，GO的加入对复合骨修复材料的力学性能提高有一定的加强作用，
并在提高复合材料拉伸强度的同时也改善了材料的韧性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与
修饰，皆应属本发明的涵盖范围。