稳定的乳液技术领域
本发明涉及使用小的两亲分子诸如肽形成乳液，所述肽自组装以形成至少两种基
本上不混溶的液体之间的界面。所述乳液可以应用于多个技术领域，诸如食品、化妆品、生
活方式产品、涂层、催化作用、包封、药物递送和/或细胞测定。还提供了制备这种乳液的方
法，以及定制用于特定应用的乳液的稳定性的方法。还提供了用于鉴定期望能够自组装并
且可以用于乳液形成的肽的筛选方法。
发明背景
用于包封和相分离的基于表面活性剂的乳液已经广泛用于食品、化妆品、涂层、催
化作用、包封、药物递送和细胞测定中。开发新的界面稳定策略是新一代乳化技术进展的关
键。传统的表面活性剂的缺点包括毒性，对温度、pH和盐的有限的稳定性。已经开发了许多
方式来补充传统的乳液体系：使用生物相容性共聚物、脂质和多肽作为新式表面活性剂；形
成网络化膜的生物大分子和蛋白质；或基于固体粒子和聚合物囊泡的Pickering乳液。尽管
如此，需要更多的乳液体系。
发明概述
本发明基于使用小的两亲分子，诸如芳族基团取代的氨基酸和肽来产生界面网络
以稳定乳液。本发明还基于计算筛选方法，该方法允许鉴定期望能够自组装并且因此可以
用于开发乳液的肽。因此，作为通过吸收表面活性剂稳定乳液的替代方案，本发明提供了在
界面处的纳米结构化网络作为多用途乳液稳定体系。该方式通过利用分子间芳族π-堆积和
氢键相互作用之间的平衡通过分子设计组合了可调的特性，与传统的表面活性剂十二烷基
硫酸钠(SDS)相比，具有在升高的温度下和在盐的存在下的长期高稳定性。还有可能通过酶
法水解和其他催化方式例如去除一个或多个基团并且使乳液稳定或不稳定，和/或施加化
学/物理修饰，诸如改变pH和/或温度以使乳液稳定或不稳定来使乳液聚集或解聚。
自组装小分子作为用作结构材料的聚合物和具有诸如刺激响应性生物相容性等
的优点的凝胶的替代物而被越来越多地研究。在一个实施方案中，本发明涉及芳族基团取
代的氨基酸和肽两亲分子的自组装，所述两亲分子含有N-末端被疏水的合成芳族结构部分
封端的亲水短(例如，二-或三-)肽序列。在另一个实施方案中，所述肽可以简单地包含天然
存在于氨基酸上的为特定肽的一部分的芳族基团。本发明人证明了这些分子是经由分子自
组装产生具有多种形态学和特性的纳米结构的多用途构件，包括微滴中的局部组装件。
根据第一个方面，本发明提供了包含两亲氨基酸或肽在至少两种基本上不混溶的
液体之间的界面处形成的自组装网络的乳液。
当用于本文中时，术语“乳液”是指在第二液体中悬浮或分散的第一液体的悬浮液
或分散液，其中所述第一液体是难溶的或不混溶的，即与第二液体基本上或完全不混溶。对
于“基本上”，含义是至少90％、95％或98％的所述两种液体是不混溶的，第一液体被称作分
散相，第二液体被称作连续相。分散相可以形成液滴，所述液滴以异相(heterogeneous)或
均相的方式分散遍布连续相。乳液的说明性实例包括水/水溶液包油乳液(其中油形成分散
相，水/水溶液形成连续相)，和油包水乳液(其中水形成分散相，油形成连续相)。另外，可以
形成“多重乳液”，其中第一不连续相的液滴含有第二不连续相的较小液滴，在组成上其可
以与含有第一不连续相的连续相相似或不相似。多重乳液的说明性实例包括水包油包水
(water-in-oil-in-water)乳液(其中油形成第一不连续相，水形成第二不连续相)，和油包
水包油(oil-in-water-in-oil)乳液(其中水形成第一不连续相，油形成第二不连续相)。合
乎需要的是可以将其他试剂，诸如药物、染料、香味增强剂、杀虫剂等收集在液滴中并因此
能够乳化。
本发明可以特别地应用于使用乳液来达到极好效果的食品工业。这样的乳液可以
包括食用油或脂肪，特别是植物油或脂肪。可以特别地用于基于食品的应用的油包括椰子
油、棕榈油、棕榈仁油、橄榄油、大豆油、芥花油(菜籽油)、南瓜子油、玉米油、向日葵油、红花
油、花生油、葡萄籽油、芝麻油、摩洛哥坚果油(argan oil)、米糠油和其他植物油，以及基于
动物的油，如黄油和猪油。
本发明的氨基酸和肽是两亲的且具有低的分子质量，含有少量的氨基酸。肽典型
地包含2-5个氨基酸。所述肽可以更优选地为2-4个氨基酸长。在一个实施方案中，肽是二肽
或三肽。术语“两亲的”是指具有亲水区域和疏水区域两者的肽或分子。“两亲的
(Amphipathic)”和“两性分子的(amphiphilic)”是同义词并且在本文中可互换使用。术语
“亲水的”是指被吸引到水和其他极性溶剂的分子或分子部分。亲水分子或分子的一部分是
极性的和/或带电荷的，或具有与水或极性溶剂形成相互作用诸如氢键的能力。术语“疏水
的”是指排斥水和其他极性溶剂或被水和其他极性溶剂排斥的分子或分子的一部分。疏水
分子或分子的一部分是非极性的，不带电荷并且被吸引至非极性溶剂。
本发明的肽可以通过本领域中已知的方法制备，诸如使用Fmoc或Boc保护的氨基
酸残基的固相合成或液相合成，如果适宜所述Fmoc或Boc可以后续被移除。备选地，所述肽
可以通过如本领域中知晓的重组技术使用，例如，标准微生物培养技术、基因改造的微生物
和重组DNA技术(Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克
隆：实验室指南)(第3版)，2001，CSHL Press)来制备。所述肽还可以通过酶消化天然蛋白质
或重组表达的蛋白质或较大的肽序列来获得。此外，他们可以通过酶法肽合成来制备。所述
肽可以在上述的合成或重组合成后被进一步修饰。
当用于本文中时，术语“氨基酸”是指[α]-氨基酸或[β]-氨基酸，并且可以是L-或
D-异构体。氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸。所述氨基酸还可以在[α]-位
置或[β]-位置中进一步用基团取代，所述基团可以是(杂)-芳族、脂族基团，可以含有氢键
供体或接受体。这些可以是荧光的、(半-)半导体的或生物活性的基团，诸如糖类、核苷酸
等。
合适的[β]-氨基酸包括构象约束的[β]-氨基酸。环状[β]-氨基酸是构象约束的并
且通常不易受酶促降解影响。合适的环状[β]-氨基酸包括，但不限于，顺式～和反式-2-氨
基环丙基羧酸、2-氨基环丁基和环丁烯基羧酸、2-氨基环戊基和环戊烯基羧酸、2-氨基环己
基和环己烯基羧酸以及2-氨基-降莰烷羧酸和它们的衍生物。
术语“非天然存在的氨基酸”当用于本文中时，是指具有在天然存在的(基因编码
的)L-[α]-氨基酸中不存在的侧链的氨基酸。非天然氨基酸和衍生物的实例包括，但不限
于，使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、
正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨
酸和/或氨基酸的D-异构体。
在一个实施方案中，氨基酸被修饰或肽可以包含修饰的N-末端。即，N-末端氨基酸
可以包含典型地借助酰胺键或其他合适的键结合至N-末端氨基酸的修饰基团。类似地，在
单一氨基酸的情况下，氨基酸可以借助于酰胺键或其他合适的键进行修饰。优选地，被修饰
的基团具有总体疏水的性质。对此，要理解所述基团可以具有疏水和亲水特性，但总体上，
该基团被理解为在性质上是疏水的。疏水基团的实例包括-CH2-链和烃环结构。
更优选地，修饰基团可以包括一个或多个芳族基团。所述芳族基团可以包含单一
的或多个环结构(例如多环芳烃)并且可以包含杂环和/或同素环结构。典型地，所述芳族基
团可以包含一个、两个、三个、四个或更多个稠环结构，其中每个环可以是相同的或不同的。
代表性的基团包括蒽、苊、芴、非那烯(phenalene)、并四苯、芘、菲、萘和chysene、苯乙酰，以
及杂环结构，诸如嘌呤、嘧啶、喋啶、咯嗪、吩嗪和吩噻嗪。所述芳族基团可以通过存在于
一个或多个芳环上的取代基与所述氨基酸键合。这样的取代基可以包括反应性C1-C4烷基、
烷氧基、烷基氨基、磷酸酯、羧酸、氨基、醇、N-羟基琥珀酰亚胺、羟基苯并三唑、卤化物或1-
羟基-7-氮杂苯并三唑和本领域中已知的一个或多个类似基团。优选的芳族基团可以基于
含有furene、芘、嘌呤和嘧啶的结构，诸如芴基甲氧基羰基(FMOC)、9-芴基甲基琥珀酰亚胺
基碳酸酯(FMOC-)Su)、C1-C4烷基取代的芘以及本领域中已知的天然和合成的核苷酸。典型
地，任何一个或多个芳族基团的总分子量将小于500分子量，诸如小于400分子量，或高于
300分子量。
在一些实施方案中，除了上述以外，或作为替代方案，所述肽包含在N-末端处、在
C-末端处和/或在肽主链上的修饰。例如，肽的N-末端或C-末端可以被修饰，或肽主链内氨
基酸残基的侧链可以被修饰。合适的N-末端修饰的实例包括，但不限于，用含有直链或支链
烷基或芳基的羧酸酰化。合适的烷基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁
基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基。在肽的
N-末端处的游离氨基还可以通过添加本领域中已知的其他修饰基团来修饰，包括，但不限
于，甲酸基或苄氧羰基。通过用含有合适的疏水基团的羧酸酰化修饰N-末端可以允许增强
肽对流体界面的亲和性。肽的游离氨基还可以用另外的功能部分(诸如结合金属的种类、荧
光种类、导电种类、半导体种类或光谱活性或生物活性种类)通过使用分子的适当活化的衍
生物(诸如氨基香豆素、生物素、荧光素、二乙烯三胺五乙酸五酯、联肼尼克酰胺
(hydrazinonicotinamide)或4-甲基-香豆酰基-7-酰胺)修饰，由此为肽提供另外的官能
性。
合适的C-末端修饰的实例包括，但不限于，用氨或含直链或支链烷基或芳基的胺
酰胺化或用含有直链或支链烷基的醇或用苯酚或芳族醇酯化。合适的烷基包括，但不限于，
甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四
烷基、十六烷基和十八烷基。通过用含有合适的疏水基团的胺酰胺化修饰C-末端可以允许
增强肽对流体-流体界面的亲和性。在肽的C-末端处的游离羧酸基团还可以通过添加本领
域中已知的其他修饰基团来修饰，包括，但不限于，N-氧基琥珀酰亚胺(N-
oxysuccinimide)。
肽内氨基酸残基的侧链羧酸基团，例如，天冬氨酸或谷氨酸残基的侧链羧酸，也可
以通过用氨或含直链或支链烷基或芳基的胺酰胺化或用含有直链或支链烷基的醇、苯酚或
芳族醇酯化来修饰。合适的烷基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊
基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基。
肽内氨基酸残基的侧链醇或酚基，例如，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的侧链醇或
酚基，或赖氨酸残基的游离氨基；肽内氨基酸残基诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和精氨
酸的侧链游离氨基；或肽内氨基酸残基的侧链游离硫醇基，包括但不限于半胱氨酸残基的
侧链硫醇基，也可以通过用含有直链或支链烷基或芳基的羧酸酯化来修饰。合适的烷基包
括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、
十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基。通过用含有合适的疏水基团的羧酸酯化修饰肽
内氨基酸残基的侧链醇或酚基可以允许增强肽对流体界面的亲和性。肽内氨基酸残基的侧
链醇或酚基也可以通过酶促或化学磷酸化来可逆地修饰，由此改变肽上的电荷，以及肽结
合某些金属离子的能力。
根据本发明使用的示例肽包括肽YL、YA、YS、FF、FFF和YL(使用常用的单字母代码
来识别所述氨基酸)，它们在N-末端氨基酸(即，例如，在YL的情况下为Y)处已经被修饰以包
含FMOC或芘基团。进一步的详情参见方案1c。
通过计算筛选，本发明人已经鉴定了未修饰的肽，诸如三肽，其预期和后来经验性
地确认能自聚集，并且因此能够形成乳液。因此，在进一步的实施方案中，提供了包含未修
饰的肽诸如三肽的乳液，其中所述肽在至少两种基本上不混溶的液体之间的界面处形成自
组装网络。
术语未修饰要理解为指由天然或非天然氨基酸形成的肽，其不包含对形成所述肽
的氨基酸的化学结构的任何附加修饰，无论在肽的N或C末端，或沿肽本身的主链。用于形成
根据本发明的乳液的示例性的未修饰肽包括三肽KYW、KFF、KYF、FFD和DFF(使用常用的单字
母代码来识别所述氨基酸)。
本发明人使用以前描述的计算技术并且将所述技术改动以适应于与形成乳液相
关的用途。以前描述的技术记述于Frederix等人，2011和2015，专业技术读者要注意这些，
并且这些的全部内容合并于本文中。
总之，以前在Frederix等人，2011和2015中报告的计算筛选规程可以应用来鉴定
期望在水中自组装的肽。从初始的筛选中，可以鉴定出肽的亚组，所述亚组的肽表现出形成
纤维和双层结构的潜力，其可以被认为是充当乳化剂的化合物的先决条件。此初始筛选允
许选择肽，所述肽使用MARTINI粗粒力场，Marrink等人2007模拟，在水和不混溶的水/溶剂
溶液两者中另外进行9.6μs，以便鉴定出可以期望在至少两种基本上不混溶的液体之间形
成乳液的肽。
因此，在进一步的方面，本发明提供了一种虚拟筛选方法，其允许以虚拟的方式研
究所有8000种三肽序列，以及估计它们形成乳液的倾向，使得可以鉴定具有使自己最可能
形成乳液的某些特性的肽类型，诸如三肽。
本发明的此方面基于开发一种虚拟筛选肽在有机溶液/水溶液界面处形成聚集物
的倾向的方法。
可以选择从上面的虚拟筛选被鉴定为潜在地能够在有机溶液/水溶液界面处形成
聚集物的肽用于任选的后续试验验证，所述后续试验验证这样的肽能够形成有机/水混合
物的乳液。
因此在进一步的方面，提供了一种虚拟地鉴定能够形成乳液的肽的方法，所述方
法包括选择在有机溶液/水溶液界面处的聚集倾向(AP*)。所述方法可以包括初始地选择显
示出在水溶液中的聚集倾向(AP)的肽，之后针对其在有机溶液/水溶液界面处的聚集倾向
(AP*)选择肽。
所述方法可以以两个阶段执行，使得可以首先测定AP，以及仅选择在水溶液中显
示合适的AP的肽用于测定在有机溶液/水溶液界面处的AP*。
除了AP测定以外，或作为AP测定的替代方案，可以测定所述肽的聚集倾向(APH)的
经亲水性调整的测量量度，所述APH通过依据所述肽的亲水性测量量度调整所述肽的聚集
倾向(AP)测量量度来测定。
通过依据亲水性的测量量度调整AP，可以获得经改良的聚集倾向的测量量度。APH
可以用来提供虚拟筛选肽在溶液中形成聚集物的倾向的方法。
亲水性的测量量度可以包括肽中氨基酸的Wimley-White全残基疏水性的总和或
任何类似的疏水性标度(诸如Kyte和DooLittle标度[Kyte J，Doolittle RF.J Mol
Biol.1982 May 5；157(1)：105-32.]，或Hessa和Heijne标度[Hessa T，Kim H，Bihlmaier
K，Lundin C，Boekel J，Andersson H，Nilsson I，White SH，von Heijne G.Nature.2005
Jan 27；433(7024)：377-81])，这些标度将氨基酸的疏水性关联从而对肽的相对疏水性/亲
水性进行排名。
依据所述肽的亲水性的测量量度调整肽的AP可以包括将AP自乘并乘以亲水性的
测量量度。
AP和亲水性(hydrophicility)测量量度中的至少一个可以在依据亲水性测量量
度调整AP之前被标准化。
测定肽的APH可以包括使用下列等式：APH＝(AP′)α(logP)′，其中α是数值常数，log
P是所述肽的亲水性测量量度，且单引号表示标准化。α可以具有0.5-5的值，任选地1-4的
值，进一步任选地1-3的值。
改变上面等式中α的值可以改变AP和亲水性测量量度之间的相对权重。在测定APH
的值，例如APH的阈值的情况下，APH的值可以取决于α的值。
所述肽可以包括三肽、四肽、五肽或甚至更大的肽。优选地，所述肽是三肽。
鉴定肽的AP*、AP和/或APH可以包括确定所述肽的经测定的AP*、AP和/或APH是否满
足或超过AP*、AP和/或APH的阈值。
可以确定AP*/AP/APH的阈值，具有满足或超过阈值的AP*/AP/APH值的肽被认为具
有高聚集倾向。具有高AP/APH值的肽可以被选择用于确定AP*。具有高AP*的肽可以被选择
进行合成。因此，所述方法可以进一步包括合成表现出在有机溶液/水溶液界面处的AP*的
肽，且任选地测试这种合成的肽在有机溶液/水溶液界面处聚集的能力，或在有机溶液和水
溶液之间形成乳液的性能。
所述肽是多种肽中的一种，并且所述肽的鉴定包括确定所述多种肽中的每一种的
AP*/AP/APH，并且依照所确定的所述多种肽的AP*/AP/APH来鉴定所述多种肽中的至少一种。
所述多种肽可以包括，例如，多种三肽。所述多种肽包括由天然存在的氨基酸编码
的肽的基本上所有可能组合。例如，对于三肽，有8,000种肽(203，其中20是天然存在的氨基
酸的数目)。所述方式可以在概念上进行扩展以包括非天然氨基酸，诸如瓜氨酸、正缬氨酸
等，以及N-和C-末端保护的氨基酸。
虚拟筛选肽(例如，三肽)的方法可以包括通过计算每种肽的AP/APH，以及基于所
计算的AP/APH鉴定多个肽来筛选大量的肽。在一些情况下，通过APH鉴定肽可以比通过单独
的AP鉴定提供更有希望的用于聚集的候选物。
依据多种肽的经确定的AP/APH鉴定多种肽中的至少一种可以包括鉴定多种肽的
亚组，所述亚组包括具有最高AP/APH的肽。
所述多种肽的亚组可以包括一部分，诸如100种具有最高AP/APH的肽，任选地200
种具有最高AP/APH的肽，进一步任选地400种具有最高AP/APH的肽。
所述多种肽的亚组可以包括10％的具有最高AP/APH的所述多种肽，任选地5％的
具有最高AP/APH的所述多种肽，进一步任选地2％的具有最高AP/APH的所述多种肽。
从所述多种肽中通过AP/APH鉴定的肽的数目可以取决于所述多种肽中肽的数目。
例如，从8,000种可能的三肽中，可以选择400种肽(所有肽的5％)的亚组。
鉴定所述多种肽的亚组可以包括鉴定所述多种肽中具有大于AP/APH阈值、或大于
或等于AP/APH阈值的AP/APH的所有肽。
所述阈值可以通过计算所述多种肽中每一种肽的AP/APH，并为发送所需大小的亚
组设定所述阈值而确定。所述阈值可以基于关于已经成功聚集的肽的AP/APH的知识来确
定。
被鉴定为具有高AP/APH值和/或高于AP/APH阈值的肽的亚组可以被选择用于AP*测
定。
所述方法可以进一步包括通过模拟显示所述肽的AP*。通过模拟显示所述肽的AP*
可以包括对处于有机/水溶液混合物中的肽进行分子动力学模拟，并显示结果。研究者可以
借助于显示在显示器(monitor)(诸如，计算机显示器等)上的对聚集形成的虚拟表示来观
察所显示的结果。备选地，聚集形成可以借助于图像处理分析软件来确定，所述图像处理分
析软件被设计成鉴定在有机溶液/水溶液界面处形成的模拟的聚集物。
在存在多种肽的情况下，所述方法可以包括分别从每个模拟中获得所述多种肽中
的每种肽的AP*，所述模拟可以包括分子动力学模拟。
用于指定肽的AP/APH/AP*可以包括在分子动力学模拟开始时的溶剂可及表面积
与分子动力学模拟结束时的溶剂可及表面积之间的比率。
上述方法可以进一步被修改以考虑每种氨基酸各自的质子化量度和/或当特定肽
序列的一部分(诸如三肽)时的质子化量度。肽的氨基和羧基末端以及某些暴露的氨基酸侧
链能够在质子化和去质子化形式之间切换，这取决于周围环境的pH以及聚集状态，并且发
明人已经观察到肽聚集或凝胶化可以受pH变化影响。因此，筛选三肽在不同pH环境内聚集
的能力可以通过改变标准粗粒珠来实现，所述标准粗粒珠对中性pH进行参数化以表示处于
备选的质子化状态的侧链。例如，中性N-末端珠(NH2)的珠子可以被用来检测在pH 10之上
移动的效应，由此N-末端可以被去质子化，而不是利用质子化N-末端珠(NH3+)。
在进一步的方面，提供了一种制备肽聚集物的方法，所述肽聚集物包含能够在有
机溶液/水溶液界面处自聚集的肽，所述方法包括通过测定肽在水溶液中的聚集倾向(AP)
测量量度，任选地依据肽的亲水性(APH)测量量度来鉴定所述肽，通过模拟鉴定所述肽是否
能够在有机溶液/水溶液界面处自聚集，以及任选地合成所述肽。
所述肽可以是多种肽中的一种，并且所述肽的鉴定可以包括确定所述多种肽中的
每一种的AP/APH，并且鉴定所述多种肽中的至少一种用于AP*测定和选择能够在有机溶液/
水溶液界面处形成自聚集物的肽。
通过观察由此鉴定的肽的序列，可以鉴定具有某种自组装行为的肽类型，例如，在
某些位置中含有例如，芳族、阴离子、阳离子、H-键连接的残基。
在进一步的方面，提供了可通过上述任一种方法获得的肽或纳米结构。
典型地，本发明的肽可以在有机溶液/水溶液界面处以1-500mM，诸如10-200mM、
15-100mM或20-60mM的浓度聚集。
本发明人已经观察到本发明的肽的氨基酸组成和/或可以对氨基酸/肽进行的修
饰作用，可以对乳液形成和/或乳液的稳定特性有影响。因此，通过改变氨基酸/肽的氨基酸
组成和/或修饰基团，有可能改变肽的自组装特性，并且因此改变所得乳液的特性。这可以
对例如，乳液的稳定性(针对温度变化，离子强度，某些小分子的存在，溶剂的存在，暴露于
压力、剪切力、超声波或可听见的声音)，与某些不混溶的液体形成乳液的能力，液体形成分
散体或连续相的能力，液滴尺寸和/或临界乳液浓度，聚合溶液的序列选择性稳定，含有生
物大分子(诸如DNA、蛋白质)的溶液的稳定化，乳液在生物流体、细胞内、在组织中的稳定
化，对光、压力、生物分子的存在、离子强度、酶、超声波、磁场、电场、或其组合的反应性产生
作用。因此，通过改变氨基酸、氨基酸序列和/或修饰基团，有可能影响乳液特性。这可以容
易地由专业技术人员通过如本文以及“Microemulsions：Properties and Applications
(微乳液：特性和应用)(2008)CRC press和“Emulsions and emulsion stability：
Surfactant(乳液和乳液稳定性：表面活性剂)Science Series/61”(2005)CRC press中所
教导的适宜的手段和试验来测试。
本发明的氨基酸/肽要理解为以充足的浓度提供，使得在液体-液体界面处它们能
够以足够的强度彼此相互作用来形成自组装纤维或结构，所述自组装纤维或结构能够形成
包含许多这样的纤维、球状聚集物、带条、2D片层或其他纳米结构的网络或薄膜。典型地，氨
基酸/肽以1-50mM，诸如5-25mM、7.5-15mM，特别是10mM的浓度提供。然而，也有可能简单地
通过测试不同浓度的肽与所选择的不混溶的液体，并且观察在哪个浓度下可以形成乳液来
确定用于乳液形成的合适浓度。因此，根据所使用的肽和液体，用于形成乳液的肽的浓度可
以在上述限定的范围之外。
第一液体与第二液体的体积比通常在1∶20-20∶1的范围内，更便利地为1∶10-10∶
1。
术语“自组装的”或“自组装体”要理解为意指所述氨基酸/肽能够经历自发的(或
被施加的刺激触发，诸如pH变化、离子强度、溶剂极性、光、声音、酶促作用、催化作用)组装
成为有序的纤维、带条、球体、片层或相关结构，典型地具有纳米尺寸。
方便地，本发明的乳液可以在不用强力震荡或混合的条件下形成。例如，本发明人
已经简单地通过用手震荡制备了根据本发明所述的乳液。
肽纤维或纳米结构可以由具有相同氨基酸序列的氨基酸/肽或具有超过一种不同
的氨基酸序列的肽的混合物形成。所述氨基酸/肽还可以与其他大分子(诸如较大的肽或蛋
白质)组合形成纤维或其他纳米结构。在一些实施方案中，形成纤维或结构的氨基酸/肽具
有相同的氨基酸序列，并且因此形成‘同质氨基酸/肽组装体’。在其他实施方案中，两种或
多种不同的氨基酸/肽形成‘异质氨基酸和/或肽组装体’。
当用于本文中时，术语“界面”是指形成在两种邻接的不混溶的液体之间的公共边
界的表面。液体-液体界面是形成两种不混溶的液体(诸如油和水)之间的公共边界的表面。
有利地，本发明的乳液可以在长时间时期内是稳定的，这与利用其它表面活性剂
(诸如SDS)形成的乳液是可区分的。在优选的实施方案中，当不存在盐时，本发明的乳液在
至少1周、2周、4周、2个月、6个月、12个月或更长的时期内保持稳定，在100mM盐(诸如磷酸
盐、氯化物或硫氰酸盐)的存在下保持稳定持续至少12小时、24小时、2天或更长，和/或对暴
露于热，诸如50-70C稳定持续2-4小时，对暴露于诸如60C稳定持续3小时。备选地，本发明的
乳液可以在第一温度下是稳定的，但可以在第二温度下反乳化(demulsify)。例如，某些肽
可以能够在室温下形成乳液，但在升高的温度诸如40C、50C、60C或更高的温度下反乳化。
有利地，如果需要，可以通过添加一种或多种蛋白酶实现反乳化(即，乳液的破
乳)。例如，本发明的乳液可以通过添加蛋白酶嗜热菌蛋白酶进行反乳化。可以想到的备选
酶类型包括酯酶和磷酸酶以改变肽分子的两亲性平衡。还可以想到其他变换方式，涉及引
入例如光可变换单元，所述光可变换单元在暴露于特定波长后经历构象改变，诸如偶氮苯。
这可以在N末端掺入或作为氨基酸的侧链掺入。
在进一步的方面，提供了一种制备乳液的方法，所述方法包括在如上所述的氨基
酸/肽的存在下混合至少2种基本上不混溶的液体，以便形成乳液。可以提供所述至少两种
不混溶的液体，并向其添加氨基酸/肽，或可以将氨基酸/肽添加至所述不混溶的液体中的
一种或多种中，然后使另外一种或多种不混溶的液体与含有所述氨基酸/肽的一种或多种
不混溶的液体接触。
要理解所述氨基酸/肽必须以能够允许乳液形成的浓度提供。在本文中描述了合
适的浓度范围和/或如何确定所述浓度范围。
从上面与乳液组分相关的描述中将理解其他任选的方法步骤，并且为简便起见，
将不再重复这些任选的方法步骤，但专业技术读者要考虑到这些。
本发明可以用来提供包含试剂(诸如药剂或上文中鉴定的其他试剂)的乳液，所述
试剂仅在油或水性液体/水中是可溶的或适当地可分散在油或水性液体/水中。例如，如果
药剂或其他试剂要被掺入本发明的乳液中，则所述试剂可以在制备初始乳液之前初始地被
包含在油相或有机相中。在一些实施方案中，药剂或其他试剂在油相/有机相中是可溶的。
在其他实施方案中，药剂或其他试剂在油相/有机相中是不溶的。
对在缺少非药物溶剂的情况下容易制备的药物递送载体存在着需求，所述药物递
送载体可以携带多种多样的药物，具有适宜的药代动力学特性，包括在生物条件下的稳定
性，和/或向特定的组织或接受体递送药物。另外地，这些药物递送媒介物应当包封或遮蔽
药物并且将其以浓缩的方式递送至所需的作用部位，同时将其掩蔽以免于被免疫清除。对
用来以靶向方式将小量药物(例如抗原性蛋白)递送至特定细胞类型(例如树突状细胞)以
便诱发T细胞的亚免疫性激活的药物递送载体存在进一步的需求。备选地，药物(例如化疗
剂)的浓缩丸应当以靶向的方式再次递送至细胞，以便杀死靶细胞。本发明的乳液可以应用
于此方面。因此在进一步的实施方案中，本发明进一步提供了进一步包含药剂的乳液-这可
以包括小的药物分子，以及核酸，蛋白质，抗体和抗体片段等。
本发明的乳液还可以应用于农业、食品、化妆品和/或催化领域。例如，在农业产业
中，乳液用作用于杀昆虫剂、杀真菌剂和杀虫剂的递送媒介物。这些不溶于水的杀生物剂必
须以非常低的水平施用于作物，通常通过机械设备喷雾进行施用。在化妆品中，乳液是用于
许多毛发和皮肤调理剂的递送媒介物。
许多食品是乳液的形式。沙拉酱、肉汤和其他调味汁、打发的甜点配料(whipped
dessert toppings)、花生酱和冰淇淋也是各种食用脂肪和油的乳液的实例。除了影响食品
的物理形式以外，乳液影响味道，因为乳化的油包裹舌头，赋予产品以改变的“口感”。
就可以用在食品工业中的乳液而言，乳液以即用形式诸如例如UHT产品以及以预
混物或浓缩物形式诸如预混合粉或浓缩膏(当其被制成时其是有效的乳液)两者来提供。这
样的乳液可以通过多种材料诸如改性(和天然)淀粉、稳定剂、树胶和乳化剂(或其组合)来
稳定。
本发明的肽乳液制剂已经证明了凝胶化、乳化、稳定化和共组装特性，这些特性可
以允许替换和/或减少食品中采用的现有天然和非天然材料。另外，本发明的肽乳液制剂可
以提供独特的特性，所述特性可以赋予新的或独特的质地，所述质地可以在多种应用中利
用，诸如甜点、蛋浆或调味汁、乳制奶油替代品、酵素糊(Paste Ferments)和糖衣膏/填料或
蛋糕/装饰，它们可以应用于冷藏和冷冻产品，以及可以在(环境)室温下保持的产品。
要想到采用本发明的乳液适当配制的食品可以显示出下列重要的技术/功能方面
中的一个或多个：
粘度
产品要求取决于应用的恰当粘度：涂层、紧贴、口感、质地、操纵、应用、加工。
稳定性
产品稳定性在制造/使用中的多个阶段是至关重要的：
加工：在加工的所有阶段中确保均质产品的稳定性。不稳定的产品有乳液失效，物
料在工厂中堆积造成得到的产品燃烧/堵塞的风险。在加工中稳定的产品将实现下列：
包装：始终如一的产品进行包装(在不同的温度下用于不同的产品/过程：以确保
用于最终用途的正确产品属性)
用户使用：始终如一的产品和最终产品性能
保质期：用户对同质产品的期望：当分离可以是明显的，而对产品性能(无菌性、香
味、质地：感官剖析)没有负面影响时，外观可能影响使用者：在分离的情况下存在产品问
题。此时稳定性是至关重要的。
产品包装形式：在UHT中，例如，当产品形式增大时，对乳液的压力和所产生的力随
着分离更快速地变明显而变得越大。这影响了应用于该产品形式的保质期。0.5-1L产品典
型地具有12个月的保质期，10L&25L典型地具有9个月的保质期，1000L典型地具有6个月的
保质期。
热可逆性：产品粘度在不同的温度下改变。粘度控制是来自改性淀粉的一个方面：
使用肽制剂可以提供这种控制。开发的另一个领域是甜点，其中液体凝胶有可能经由UHT加
工并将凝胶冷却至其活化点以下来制备。在再加热过程中，此凝胶然后被再活化，当终端使
用者将其冷藏时其将凝固。以相似的方式胶凝化的肽制剂将提供相似的产品。
原料替代
改性(和天然)淀粉、稳定剂、树胶和乳化剂(或其组合)可以用本发明的肽乳液制
剂来替换。
对固相产品的乳化和控制(卵磷脂在巧克力/糊状产品基质中的作用)
就成本而言，卵磷脂在巧克力中是至关重要的，其中在卵磷脂的存在下可可脂的
量可以减小，并且仍然保留浸挂糖衣和模塑所要求的必要的流动性。肽制剂可以潜在地充
当具有表面活性剂特性的功能替代物。在糊状浓缩物基质中，功能性乳化特性可以允许获
得新的糊状形式质地，但在成品诸如发酵制品(即，面包和面包卷)中将更明显，其中乳化剂
使用范围来自用于气泡稳定性的膜形成，气泡形成的规则性，成品的质地，面团延伸性，面
团性能的调理，面团稳定性和保质期。
在食品和非食品中的充气、气泡形成或发泡(及其稳定性)
在乳制奶油替代品(Dairy Cream Alternatives，DCA)中经常需要多种材料来提
供高体积打发和稳定性性能。肽制剂可以实现气泡形成并因此发泡，它们可以用于DCA和其
他潜在行业中非食品泡沫两者中。由于可以被改进超过现有复合物的材料功能性，稳定性
性能预期是高的。
在热处理期间蛋白质的稳定化
肽与热敏材料诸如蛋的组合使用可以充当暴露于热量时蛋白质变性的抑制剂
(prohibitor)。在UHT制剂中蛋的使用，例如，可能由于变性以及因此造粘或在加工中积累
的颗粒物形成而是有问题的。
材料的功能特性的增强
肽的使用可以促进现有高成本、高度功能性的材料的使用减少，诸如通过缔合现
有材料和/或与现有材料组合起作用，例如蛋白缔合和性能‘提升’。这将不限于蛋白(例如，
其他材料诸如乳蛋白的潜在增强作用)并且可以在多种食物应用中应用。
热/工艺条件
在食品工业内，使用多种工艺条件(经常是其组合)，本发明将与这些条件是相容
的。这些包括UHT至巴氏灭菌工艺步骤以及极微加工从而在全部食品工业产品类别内提供
新鲜即食产品。
详细描述
现在将借助于实施例并参照附图进一步描述本发明，附图示出：
图1示出(a)芳族短肽两亲分子在油/水界面处的自组装和纤维网络形成的草图。
(b)通过肽纤维网络稳定化的水包油液滴的草图。(c)芳族肽衍生物(包括Fmoc-YL、Fmoc-
YA、Fmoc-YS、Fmoc-FF、Fmoc-FFF和芘-YL)的化学结构。
图2示出(a)玻璃瓶的光学照片，在玻璃瓶中通过向氯仿添加10mmol·L-1Fmoc-YL
磷酸盐缓冲溶液(pH 8)并人工搅拌制备水包氯仿乳液(白色泡沫层)。从左到右，缓冲容易
与氯仿的体积比从1∶9，3∶7，5∶5，7∶3改变至9∶1，并且样品命名为W1C9，W3C7，W5C5，W7C3和
W9C1。(b)被在水相中含有FITC的Fmoc-YL网络(样品W3C7)稳定的水包氯仿乳液液滴的荧光
显微图像。比例尺是50μm。(c)被ThT标记的Fmoc-YL网络(样品W3C7)稳定的水包氯仿乳液液
滴的荧光显微图像。比例尺是50μm。(d)Fmoc-YL在氯仿(黑色)、D2O磷酸盐缓冲溶液(pH 8)
(红色)和在稳定乳液的界面处(蓝色)的自组装的FTIR光谱。(e)Fmoc-YL网络在稳定水包氯
仿乳液的氯仿/水界面处的SEM显微照片。样品在冻干条件下制备。比例尺是50μm(左)和2μm
(右)。(f)Fmoc-YL微囊体在氯仿/水界面处的SEM显微照片。样品在风干条件下制备，比例尺
是2μm。
图3示出了(a)被在水相中含有FITC的Fmoc-YA(左)和Fmoc-YS(右)网络稳定的水
包氯仿乳液液滴的荧光显微图像。比例尺为50μm。(b)在D2O磷酸盐缓冲溶液(pH 8)中的
10mmol·L-1Fmoc-YL、Fmoc-YA和Fmoc-YS的FTIR光谱。(c)肽在水、氯仿和在界面处积累之间
的经计算的分配系数(cLogP)和测量的分配，Fmoc-YL、Fmoc-YA和Fmoc-YS的临界乳液浓度
和乳液液滴的平均直径的表格。(d)被在水相中含有FITC的Fmoc-FF稳定的水包氯仿乳液液
滴的荧光显微图像，(e)被在水相中含有FITC的Fmoc-FFF稳定的氯仿包水乳液液滴的荧光
显微图像，和(f)被芘-YL稳定的水包氯仿乳液液滴的荧光显微图像。比例尺为50μm。
图4示出了(a)玻璃瓶的光学照片，在玻璃瓶中用10mmol·L-1SDS溶液和Fmoc-YL磷
酸盐缓冲溶液通过人工搅拌制备水包氯仿乳液(白色泡沫层)。上部的图像显新鲜制备的乳
液，下部的图像显示孵育2周的乳液。(b)玻璃瓶的光学照片，在玻璃瓶中用10mmol·L-1SDS
溶液和Fmoc-YL磷酸盐缓冲溶液通过人工搅拌制备水包氯仿乳液(白色泡沫层)。上部的图
像显新鲜制备的乳液，下部的图像显示在60℃加热3小时的乳液。(c)玻璃瓶的光学照片，在
玻璃瓶中用在100mM磷酸盐、氯化物和硫氰酸盐缓冲溶液中的10mmol·L-1SDS和Fmoc-YL通
过人工搅拌制备水包氯仿乳液(白色泡沫层)。上部的图像显新鲜制备的乳液，下部的图像
显示孵育24小时的乳液。
图5示出(a)将1mg·mL-1嗜热菌蛋白酶缓冲溶液加入至用2mmol·L-1Fmoc-YL缓冲
溶液稳定的水包氯仿乳液液滴中0、20、40、60秒后的光学显微图像。比例尺为50μm。(b)将
1mg·mL-1嗜热菌蛋白酶磷酸盐缓冲溶液加入至用2mmol·L-1 Fmoc-YL缓冲溶液稳定的水
包氯仿乳液液滴中0、20、40、60秒后的大小分布的直方图。(c)小瓶的光学照片，在小瓶中乳
液形成(左)和在添加嗜热菌蛋白酶时乳液反乳化(右)。在缺少1mg·mL-1嗜热菌蛋白酶(左)
和存在1mg·mL-1嗜热菌蛋白酶10min后(右)的条件下，乳液用2mmol·L-1Fmoc-YL缓冲溶液
稳定。
图6：计算稳定的乳液的示意图：A)三肽KYF/KFF/KYW/DFF/FFD，B)水性MD模拟，显
示自组装的纳米结构，C)自组装的稳定的乳液液滴。模拟时间9.6μs。
图7：肽乳液的试验观察结果：A)由三肽中的每一种形成的乳液，B)用i)苏丹II、
ii)硫磺素T、iii)两者叠加标记的KYW的荧光显微照片，比例尺10μm，C)处于水性状态的样
品的FTIR，D)处于乳液状态的样品的FTIR，显示酰胺I区。
图8：温度对肽乳液的效应，A)在30℃，B)在60℃。
图9(a)在氯仿/水两相体系中，Fmoc-YpL在碱性磷酸酶去磷酸化之前和之后的行
为的示意性图示，显示了Fmoc-YL稳定乳液的能力，这与Fmoc-YpL相反，Fmoc-YpL遵循表面
活性剂类型的行为并且在1小时后松解返回至两相。青蓝表示水，黄色表示氯仿，绿色表示
碱性磷酸酶；(b)芳族肽两亲分子Fmoc-YpL和Fmoc-YL的化学结构；(c)碱性磷酸酶结构。
图10.Fmoc-YpL(a)的放大TEM图像(原始图像在来自ESI的图S1中)和宏观形貌，和
Fmoc-YL(b)的TEM图像，显示碱性磷酸酶启动自组装成纳米纤维网络和自支撑水凝胶(钼酸
铵2％染液)的重要性；(c)Fmoc-YpL(0小时)和在添加酶后24小时获得的Fmoc-YL的标准化
的荧光发射光谱(未标准化的数据包含在来自ESI的图S3中)(激发280nm)；(d)λ最大波长的
表示，在λ最大波长处，在添加酶之前和之后24小时观察到芴基峰，显示出红移(除了Fmoc-
YpL对照以外)；(e)Fmoc-YpL和Fmoc-YL的FTIR吸光度的酰胺区；(f)通过反相HPLC监测到的
从Fmoc-YpL至Fmoc-YL的去磷酸化。
图11a)玻璃瓶的光学照片，显示了除了在2周后完全反乳化的Fmoc-YpL在添加碱
性磷酸酶时形成乳液的能力以外，在用手震荡5秒后立即以及1小时/2周后，Fmoc-YpL和
Fmoc-YL在氯仿/水两相体系中的行为；(b)被在水相中含有FITC的Fmoc-YL的纳米纤维网络
稳定的水包氯仿乳液的荧光显微图像。比例尺为100μm；(c)水包氯仿乳液液滴的SEM图像。
比例尺为1μm。插图呈现了放大的水包氯仿液滴。比例尺为10μm；(d)在缓冲液中和在两相体
系中通过反相HPLC监测到的去磷酸化，显示在氯仿/水体系中碱性磷酸酶是有活性的；(e)
当在不同的时间向反乳化的Fmoc-YpL添加碱性磷酸酶时通过反相HPLC监测到的去磷酸化。
图12.(a)200ns后对Fmoc-YpL体系的快拍。Fmoc以蓝色表示，酪氨酸和亮氨酸以红
色表示，磷酸酯基团以黑色表示，离子以灰色表示，水以红色表示，辛醇以青色表示。插图呈
现了一个在2个分子之间的Tyr-Tyr H-键，以及通过元素着色的表面活性剂类型行为；(b)
200ns后Fmoc-YL体系的快拍。Fmoc以蓝色表示，酪氨酸和亮氨酸以红色表示，水以红色表
示，辛醇以青色表示。插图呈现了在2个分子之间的Fmoc-Leu和Fmoc-Tyr H-键；c)在两相体
系中在整个模拟中在Fmoc-YpL分子之间每个分子的氢键；(d)在整个模拟中在Fmoc-YL分子
之间每个分子的氢键。
在这个工作中，公开了一系列芳族短肽两亲分子，其通过将9-芴基甲氧基羰基
(Fmoc)或芘(Pyr)与具有不同的疏水性和官能团的二肽或三肽酪氨酸-亮氨酸(YL)、酪氨
酸-丙氨酸(YA)、酪氨酸-丝氨酸(YS)、二-苯丙氨酸(FF)和三-苯丙氨酸(FFF)组合作为例证
(图1)。这些肽两亲分子在有机/水界面处自组装，快速地形成高度稳定的微囊体纤维网络。
不像具有亲水头部和疏水尾部的传统表面活性剂在界面处的吸收，该纳米结构通过芳族π-
π堆积和肽序列的氢键键合自组装以稳定在水性(有机)介质中的有机(或水)液滴(图1b)。
研究在有机/水性界面处的芳族肽两亲分子的初步兴趣从下面的观察结果开始：
芳族肽Fmoc-YL在磷酸盐缓冲溶液(10mM)和氯仿(25mM)两者中均形成凝胶。在低浓度下，
Fmoc-YL(0.5mM)显示在水相和有机相之间转移以达到平衡分布。通过将不同体积的氯仿添
加至处于80℃的10mM Fmoc-YL缓冲溶液(缓冲溶液与氯仿的体积比从1∶9，3∶7，5∶5，7∶3变
化至9∶1)，在人工搅拌5秒后，在小瓶中形成乳液，如图2a所示。出乎意料地，这些乳液保持
稳定数月，表明所形成的肽层提供了防止凝聚的优异屏障。在所示的图像中，乳白色层是乳
液，上面和下面的透明层分别是水相和氯仿相。使用UV-Vis来测定保留在水相和转移到氯
仿中的Fmoc-YL的量。使用异硫氰酸荧光素(FITC)来标记乳液层中的水相，以用于通过荧光
显微镜成像。图2b指示在通过Fmoc-YL稳定的乳化作用后形成水包氯仿乳液。
Fmoc-YL在氯仿/水界面处的吸收可以通过测量在每个相中的浓度以及利用在界
面处吸收的剩余部分通过UV-Vis光谱量化。基于UV分析，在50∶50水/氯仿体系中，在氯仿/
水界面处吸收的Fmoc-YL的量可以被计算为1.9mmol·m-2。Fmoc-YL的密堆积单层的经计算
的最大吸收为3.4μmol·m-2，这指示在界面处吸收的Fmoc-YL由膜构成而不是由单层构成。
使用一些显微镜检查和光谱学技术研究在氯仿/水界面处此肽界面膜的结构。使
用硫磺素T(ThT)标记自组装的肽结构。在将Fmoc-YL与ThT溶解在两种溶剂中后，在水中存
在低发射，在氯仿中几乎观察不到发射，而在胶凝化(24小时)后，在水和氯仿两者中较强发
射的出现证明了形成了自组装β片层样纤维状结构。ThT随后用来标记界面膜。图2c示出了
Fmoc-YL壳稳定了有机液滴，这表明了肽β片层样结构在界面处的自组装。
然后使用红外光谱法来测定H-键相互作用，所述H-键相互作用加强了Fmoc-YL纤
维状结构在水、氯仿和界面处的自组装。图2d示出了处于非常有序的β片层样排列的肽在
D2O中典型的红外吸收光谱，酰胺和氨基甲酸酯结构部分的峰分别在1623和1684cm-1。在氯
仿中，在1632和1687cm-1处观察到这些峰，以及在1652cm-1处额外的吸收，表明存在低序的
H-键网络。另外，在水中在1588cm-1处发现归属于C-末端的羧酸基团的峰，而在氯仿中在
1708cm-1处观察到峰，表明在有机溶剂中C-末端的质子化。在界面处，Fmoc-YL采用类似于具
有两个峰的氯仿体系的确证(confirmation)，指示低序的β片层样环境(1623和1641cm-1)。C
末端保持(部分地)去质子化，如由在(1588cm-1)处的峰指示，这表明纳米结构网络主要位于
水相中。
扫描电子显微镜(SEM)用来显现界面Fmoc-YL膜。使用冻干来准备保留结构的样
品。图2e示出在界面处的纤维状网络。在风干条件下，图2f示出肽稳定的乳液液滴，在蒸发
溶剂和随后收缩后所述乳液液滴仍然为微囊体。
芳族肽两亲分子的特性，诸如疏水性和可能影响乳化的化学基团，可以通过改变
芳族基团或肽序列来改变。我们通过改变肽序列上的一个氨基酸准备了一系列肽两亲分
子，从酪氨酸-亮氨酸(YL)、酪氨酸-丙氨酸(YA)到酪氨酸-丝氨酸(YS)，疏水性减小。Fmoc-
YA可以在缓冲溶液和氯仿(30mM)两者中均形成凝胶，而在这些条件下，Fmoc-YS仅在水性介
质中形成凝胶。原子力显微镜(AFM)图像显示Fmoc-YL、Fmoc-YA和Fmoc-YS凝胶在缓冲溶液
中形成纤维状结构，从而证明它们单向组装的倾向。图3a示出Fmoc-YA和Fmoc-YS也可以稳
定水包氯仿乳液。红外光谱(图3b)确认Fmoc-YL和Fmoc-YA在水性介质中β片层样H-键的存
在，Fmoc-YS的贡献弱得多。图3c列举了肽在水、氯仿和在界面处积累之间的经计算的分配
系数(cLogP)和测量的分配。这些值与Fmoc-YL、Fmoc-YA和Fmoc-YS的临界乳液浓度(获自乳
化试验)以及乳液液滴的平均直径相关联。它证明肽两亲分子的疏水性越大且肽主链之间
的H-键合相互作用越强导致在氯仿/水界面处越强的吸收，导致乳液液滴尺寸的减小以及
较低的临界乳液浓度。
为了进一步增加疏水性，二-和三-苯丙氨酸作为肽序列(Fmoc-FF和Fmoc-FFF)进
行测试。Fmoc-FF以前被证明形成纳米纤维状结构(REF)。图3d示出用FITC标记的自组装纤
维在界面处稳定氯仿液滴。Fmoc-FFF两亲分子变得太疏水从而不能在水相中溶解，但它们
确实在氯仿中溶解。在准备10mM Fmoc-FFF氯仿溶液且加入到含有FITC的缓冲溶液中并乳
化后，乳液液滴的核心是发荧光的，这指示氯仿包水乳液的形成(图3e)。用芘替换Fmoc基
团，两亲分子和乳液体系固有地被赋予荧光性质。图3f示出被芘-YL的自组装稳定的具有蓝
光发射的水包氯仿乳液的形成。基于给出的结果清楚地预期应当能够改变肽序列和芳族结
构部分以进一步优化和官能化乳液体系。
使用芳族肽两亲分子的自组装屏障代替传统表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠
(SDS))以稳定乳液的吸引力，大幅度地增加了乳液的稳定性。图4a示出了在使它们在室温
下静置2周后，被SDS稳定的乳液被反乳化和相分离，而被Fmoc-YL稳定的乳液仍然是稳定
的。Fmoc-YL稳定的乳液是热稳定的，在暴露于60℃持续3小时后没有观察到可看到的改变，
这与SDS的性能是可比的(图4b)。在100mM磷酸盐、氯化物和硫氰酸盐溶液中，10mM SDS稳定
的乳液在24小时后相分离，如图4c所示，而Fmoc-YL网络不受盐效应影响。本发明人已经观
察到Fmoc-YL也可以代替氯仿，稳定水包十六烷和水包矿物油乳液两者，使得这种方式可普
遍地适用于多种有机介质。
使用肽自组装体稳定乳液体系的另一重要优势是使用合适的酶消化稳定的膜的
能力。蛋白酶，即裂解肽键的酶，导致两亲分子的分解。图5a和5b示出在将嗜热菌蛋白酶添
加至Fmoc-YL稳定的乳液后，乳液液滴被反乳化并在60秒内凝聚成较大的液滴。当在水性介
质中被嗜热菌蛋白酶催化的裂解反应的转变在10分钟后被高效液相(HPLC)检测达到50％
时，在图5c中观察到完全的反乳化和相分离。
应用以前报道的计算筛选规程1-2鉴定能够在水中自组装的三肽。从此对大约8000
种的初步筛选中，鉴定出三肽亚组，其显示出形成纤维和双层结构的潜力，这被认为是化合
物充当乳化剂的必要条件。此过程导致选择了5种三肽(图6A)，它们使用MARTINI粗粒力场3
模拟在水和水/辛烷溶液两者中持续另外9.6μs。
KYW、KFF和KYF以前已经被鉴定为能够形成水凝胶的三肽。这些肽在水中的模拟产
生了延伸的原纤维结构(图6B)，其是自组装纤维的指示。然而，鉴定出了两种另外的肽：FFD
和DFF，进一步在水中模拟后，它们显示自组装成双层样结构(图6B)。由于这种新结构显示
潜在的两亲性行为，因此这表明其可能是形成乳液的强候选者。
三肽在双相体系中的模拟通过使用辛烷/水溶剂箱来进行建模。然后使每种三肽
在双相体系中接受新的9.6μs模拟，从而确定它们是否能够稳定水溶液内的辛烷。模拟显示
有机溶剂作为液滴与在水/辛烷界面处组装的肽组装。如预期的那样，肽与暴露于液滴的有
机核心的疏水基团组装，由此减小了两相之间的界面张力。类似地，亲水基团充当水相的屏
障。肽在这种组装体中的排列指示肽充当稳定界面的两亲分子。三肽不能围绕界面形成纳
米纤维与模型的大小限制有关。模拟涉及300种三肽，当自组装成纤维时它们不能提供充分
的覆盖以包封辛烷液滴。尽管如此，三肽与有机相和水相两者相互作用的能力被认为是这
些分子充当乳化剂的积极指标，并且因此进行实验室试验来测试这种预测。
购买＞98％纯度的5种三肽。然后将每种三肽溶解在水中，pH改变为中性pH～7.5。
为了形成乳液，将100μL苏丹II标记的菜籽油加入到每种体系中。选择菜籽油用于与食物调
节油(food regulated oils)比较。之后对每个样品进行匀浆5秒；将样品保存24小时以确
保形成稳定的乳液。对所得乳液的目测揭示了这5种肽的多种稳定性。KYF、KFF和KYW与DFF
和FFD相比形成更稳定的乳液，这表明这些三肽形成纳米纤维的能力，如在水性状态中所观
察的，可以在乳液的稳定性中起至关重要的作用。样品的不透明度(图7A)在表面活性剂样
(FFD和DFF)和纤维状(KYF、KFF、KFW)乳化剂之间是不同的，不透明度越大的乳液指示由于
油在水相内完全分散而具有更大的稳定性。本发明人还观察到使用其他油(诸如植物油)与
所鉴定的肽组合可以形成乳液。
对每个样品进行荧光显微镜检查以鉴定液滴的大小和分布以及鉴定肽在界面处
如何相互作用。用苏丹II标记有机相揭示了含有稳定的有机液滴的混合物。标记肽区(β-片
层形成)的硫磺素T4的引入显示KYW定位于液滴的界面。这表明在KYW的情况下，三肽在界面
处自组装成原纤维以形成稳定液滴的网络，如本文中对许多Fmoc-二肽所观察到的。两种染
料的组合进一步强调了三肽定位于液滴的表面，远离界面区的灵敏度可忽略不计。
为了证实三肽形成自组装的纳米尺度的网络结构而不是在界面处以表面活性剂
样的方式聚集，进行FTIR光谱法，以鉴定指示肽的自组装的关键相互作用。为了表征所述结
构，初步地对水相中的三肽进行研究，其中KYF、KFF和KFW已知自组装，而FFD和DFF不能自组
装(图7C)。在肽聚集成纳米结构后在红外光谱法中观察到显著的变化。主要地，在1625cm-1
和1650cm-1附近的强IR峰显示了在肽链的酰胺基团之间的强氢键结合作用，其存在于形成
纤维的肽中。类似地，在1560cm-1附近的较大宽峰指示去质子化的羧酸基团，COO-。从溶液状
态到凝胶状态此峰的迁移和变宽指示引入了相应末端或侧基之间的盐桥。这提示了在具有
两个自组装结构之间的氢键结合的肽之间的头部与尾部的相互作用，得到了总体上延伸的
稳定结构。在其中形成乳液的两相体系中，形成纤维的样品(KYF、KFF、KYW)具有与在水相中
观察到的FTIR光谱相同的FTIR光谱。这指示正在形成类似的纤维状网络，并且因此，这些液
滴最有可能被纳米纤维网络稳定。相反，在水性体系和两相体系之间对FFD和DFF的FTIR光
谱的比较，揭示了在乳液状态下出现指示形成纳米结构的峰，所述纳米结构稳定液滴。这些
峰对应于肽主链的C＝O段。由于这没有在水性状态下观察到，这表明油的引入诱发了这些
肽的自组装过程。尽管如此，所述峰是相对弱的，单峰可以显示肽的平行排列，其以与传统
的表面活性剂模型相似的方式组装。
通过环境触发物触发乳液分离的能力在多种应用领域中是有用的特性5。特别地，
在各种温度下降解乳液的能力是对于乳液在食品工业中的应用感兴趣的关键特性6。因此，
对于5种三肽中的每一种研究乳液的热稳定性。将每个样品置于油浴中，并以10℃的间隔监
测乳液(图8)。
随着温度增加，乳液分离成两个不同的层。在60℃对所有样品均观察到此反乳化
作用，但KYF除外，其仍然处于乳化状态。这表明KYF与其他样品相比对热具有较高的耐受
性，并且存在着通过序列调整耐热性的机会。在温度的范围跨度，清楚的是DFF和FFD相对快
地反乳化，这与初步的观察结果有关联，即这些肽不仅作为强乳化剂，而且传统的表面活性
剂具有热稳定性问题。KFF在大约40℃开始破乳，KYW在50℃破乳，表明水凝胶的强度与乳液
的稳定性成正比。
可变换的或刺激物反应性表面活性剂能力对于在特定的工业过程阶段的乳液
(去)活化是有吸引力的。通过施加特定的触发物，能够实现对乳化能力的控制，这是在所需
的阶段形成乳液/破乳的快速有效方法。
我们研究了在水相中使用碱性磷酸酶将前体Fmoc-酪氨酸磷酸酯-亮氨酸(Fmoc-
YpL，图9b)酶促转变成Fmoc-酪氨酸-亮氨酸(Fmoc-YL，图1b)。已经确定了酶触发自组装过
程的能力后，试验的第二部分是要研究在氯仿/水界面处按需形成两亲的Fmoc-YL纤维，将
吸收表面活性剂的两相混合物转变成网络稳定的乳液(图9a)。
结果和讨论
将Fmoc-YpL酶促转变成Fmoc-YL。前体溶液，在0.6M磷酸钠缓冲液(pH 8)中的10mM
Fmoc-YpL不能形成凝胶，并且由于去质子化磷酸基团之间的静电排斥而不显示任何形成纤
维的证据(图10a)。在加入碱性磷酸酶后，前体Fmoc-YpL的清亮溶液转变成Fmoc-YL，产生纳
米纤维网络(图10b)，所述纳米纤维网络导致水凝胶形成。通过反相HPLC监测去磷酸化反应
(图10f)揭示了在2小时后大约90％的Fmoc-YpL被转变成Fmoc-YL，在24小时内实现向Fmoc-
YL的完全转变(图10f)。
酶促触发的乳液。当将氯仿以与5mM Fmoc-YpL缓冲溶液1∶1的体积比加入并用手
震荡5秒时，形成乳液。Fmoc-YpL遵循表面活性剂样行为，通过形成的泡沫可以看见，其中两
亲分子吸收到油/水界面。然而，Fmoc-YpL的结构提示不能有效地稳定界面，并且在1小时后
发生反乳化(图4a)。另一方面，当向含有Fmoc-YpL的两相体系中加入碱性磷酸酶并用手震
荡时，Fmoc-YL的纳米结构在水和氯仿之间的界面处自组装，形成稳定数月的乳液(图11a)，
如前面所证明的那样。酶触发的自组装允许通过向Fmoc-YpL两相体系添加碱性磷酸酶来实
现在乳化过程中的时序控制(图11a)。
表1.肽(Fmoc-YpL和Fmoc-YL)在水、氯仿和仍然在水/氯仿界面处的分配，以及通
过ChemDraw测定的每个的logP值
进行分子动力学(MD)模拟以研究Fmoc-YpL和Fmoc-YL在两相环境中形成有序结构
的能力。Fmoc-YpL或Fmoc-YL的60个分子随机分布在含有TIP3P水和辛醇的大箱的水相中。
在模拟中观察到Fmoc-YpL和Fmoc-YL两者朝向溶剂的界面聚集的倾向(参见图12a和12b中
200ns模拟的最后快拍图)。从所述体系的最后快拍图，清楚的是尽管两个体系都能够在溶
剂的界面处组装，但Fmoc-YpL沿箱的长度均匀地分布，最少地渗透至辛醇溶剂中，主要存在
Fmoc残基和Leu残基(图6a)。相反，Fmoc-YL能够形成更有序的聚集物，其允许将所得的纤维
样结构分配到辛醇相中(图12b)，这与来自分配试验的结果是一致的(表1)。
结论
总之，我们证明了使用短肽(其任选地含有芳族基团)在有机/水界面处自组装成
纳米纤维网络从而乳化并稳定多种水包油或油包水乳液。与传统的表面活性剂例如SDS相
比，在界面处形成肽微囊体提供了针对温度和改变的盐类的长期和更高的稳定性。在一些
实施方案中，肽两亲分子可以通过改变芳族结构部分和肽序列来设计，从而操纵乳液稳定
性、液滴大小和/或临界乳液浓度。某些肽微囊体可以在蛋白水解酶的存在下分解，使得能
够在生理条件下按需反乳化，或响应于升高的温度分解。预期通过适宜的分子设计来包括
完全生物相容的类似物，所述分子设计通过用生物相容性配体诸如核苷酸或其他合适的基
团替换芳族组分，或使用未修饰的自组装芳族肽，如所述的那样。在此呈现的界面网络有助
于包封和区室化，具有在例如药物递送和释放，以及食品工业中的潜在应用。
我们报告了能够在两相体系中自组装以稳定乳液的第一种未保护的三肽。这些乳
液已经显示了在环境温度和升高的温度两种情况下一定范围的稳定性，赋予了一定范围的
特性，所述特性是可调整的并且取决于序列。特别地，我们显示了与传统的表面活性剂模型
相比纤维状结构形成更稳定的乳液。
我们已经证明了使用芳族二肽两亲分子在有机/水界面处酶促自组装以稳定水包
氯仿乳液的可能性。我们已经证明Fmoc-YL在其从未组装前体Fmoc-YpL酶促产生后能够在
水中自组装。自组装的Fmoc-YL显示通过非共价相互作用形成纳米纤维，包括π-堆积和H-键
合。当在两相体系中时，酶促触发的Fmoc-YL在氯仿/水界面处自组装成纳米纤维网络，稳定
水包氯仿液滴并产生乳液，所述乳液稳定数月。乳液的稳定性和通过在不同的时机添加酶
来启动乳化剂能力的可能性为需要乳液形成的化学和其他工艺中的几种应用提供了非常
有前途的工具。
材料和方法
材料。Fmoc-Tyr(97％)，H-Leu-OtBu·HCl(≥98.0％)，Ala-OtBu·HCl(≥
98.0％)，O-叔丁基-L-Ser-叔丁基酯热酸盐(≥98.0％)，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(＞
99.5％)，三氟乙酸(99％)，氢氧化钠，1-芘乙酸，异硫氰酸荧光素异构体I(≥90％)，硫磺素
T，磷酸二氢钠一水合物(ACS试剂，98.0％-102.0％)，磷酸氢二钠七水合物(ACS试剂，
98.0％-102.0％)，十六烷(99％)和矿物油购自Sigma-Aldrich并按收到的原样使用。Fmoc-
Phe-Phe-Phe-OH购自BACHEM。2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
(HBTU)购自Novabiochem。磷酸盐缓冲溶液(pH 8)通过将94mg NaH2PO4·H2O和2.5g
Na2HPO4.7H2O溶解在100ml水中来制备。
Fmoc-Tyr(PO(NMe2)2-OH(537.55g.mol-1)购自Novabiochem。Fmoc-Tyr-OH
(403.43g.mol-1)、L-亮氨酸叔丁基盐酸盐(223.74g.mol-1)和在巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)中表达的牛碱性磷酸酶(5000U.mg-1蛋白，20mg蛋白.mL-1，0.049mL，表观摩尔质量
160kDa)由Sigma Aldrich供应。1个酶单位对应于碱性磷酸酶在pH 9.8和37℃每分钟水解1
μmol 4-硝基苯磷酸酯的量。
修饰的肽的合成
Fmoc-YL-OH的合成：将Fmoc-Tyr-OH(1g，2.48mmol)、H-Leu-OtBu·HCl(0.663g，
2.98mmol)和HBTU(0.941g，2.98mmol)溶解在无水二甲基甲酰胺(～15ml)中并添加DIPEA
(1.08mL，6.2mmol)。将混合物搅拌24小时。通过添加饱和碳酸氢钠溶液(～30mL)沉淀产物，
并将产物萃取至乙酸乙酯(～50mL)中。混合物用等体积的饱和盐水、1M盐酸和盐水洗涤。得
到的有机层通过无水硫酸镁干燥，并通过真空蒸发去除乙酸乙酯。然后得到的固体通过柱
层析法通过使用处于二氯甲烷中的2.5％甲醇作为洗脱剂来纯化。使用TLC在UV(254nm)光
下测试各级分，以显现样点。将含有化合物的级分合并，并在真空中去除溶剂。通过将样品
溶解在二氯甲烷中并添加10mL三氟乙酸来进行t-Bu的去除。将混合物搅拌24小时。通过真
空蒸发去除二氯甲烷，并用甲苯(～10mL)和THF(～2mL)去除TFA。通过真空蒸发去除溶剂
(一式三份地进行)。用冷二乙醚将得到的固体洗涤6次，并将产物真空干燥。
其他Fmoc-二肽(Fmoc-YA-OH和Fmoc-YS-OH)的合成遵循与Fmoc-YL相同的试验步
骤。
方案
Fmoc-YL-OH
通过HPLC纯化的纯度(214nm)＝97.00％。δH(DMSO，500MHz)：12.6(1H，s，OH)，9.2
(1H，s，Tyr OH)，8.34-8.32(1H，NH d，J＝8Hz)，7.89-7.87(2H，d，J＝7.5Hz，2芴基Ar-CH)，
7.66-7.62(2H，m，2芴基Ar-CH)，7.55-7.53(1H，d，J＝9Hz，NH)，7.43-7.39(2H，m，2芴基Ar-
CH)，7.34-7.27(2H，m，2芴基Ar-CH)，7.10-7.09(2H，d，j＝8.3Hz，2Tyr Ar-CH)，6.64-6.62
(2H，d，J＝8.35Hz，2Tyr Ar-CH)，4.25-4.10(5H，m，芴基CH，芴基CH2和CαH)，2.92-2.91(1H，
m，Tyr CH)，2.73-2.71(1H，m，Tyr CH)，1.68-1.62(1H，m，Leu CH)1.55-1.52(2H，m Leu
CH2)，0.9-0.83(6H，m Leu2CH3)MS(ES+)：m/z 517.2，[M+H]+。
Fmoc-YA-OH
通过HPLC纯化的纯度(214nm)＝99.00％。δH(DMSO，500MHz)：12.5(1H，s，OH)，9.1
(1H，s，Tyr OH)，8.28-8.26(1H，d，J＝8Hz，NH)，7.88-7.87(2H，d，J＝7.5Hz，2芴基Ar-CH)，
7.65-7.61(2H，m，2芴基Ar-CH)，7.53-7.51(1H，d，J＝9Hz，NH)，7.43-7.39(2H，m，2芴基Ar-
CH)，7.34-7.28(2H，m，2芴基Ar-CH)，7.10-7.09(2H，d，j＝8.3Hz，2Tyr Ar-CH)，6.64-6.62
(2H，d，J＝8.35Hz，2Tyr Ar-CH)，4.19-4.10(5H，m，芴基CH，芴基CH2和CαH)，2.92-2.91(1H，
m，Tyr CH)，2.73-2.71(1H，m，1Tyr CH)，1.33-1.29(3H，Ala CH3)MS(ES+)：m/z 475.07，[M+
H]+。
Fmoc-YS-OH
通过HPLC纯化的纯度(214nm)＝97.5.00％。δH(DMSO，500MHz)：12.5(1H，s，OH)，
9.1(1H，s，Tyr OH)，8.28-8.26(1H，d，J＝8Hz，NH)，7.88-7.87(2H，d，J＝7.5Hz，2芴基Ar-
CH)，7.65-7.61(2H，m，2芴基Ar-CH)，7.53-7.51(1H，d，J＝9Hz，NH)，7.43-7.39(2H，m，2芴基
Ar-CH)，7.34-7.28(2H，m，2芴基Ar-CH)，7.10-7.09(2H，d，j＝8.3Hz，2Tyr Ar-CH)，6.64-
6.62(2H，d，J＝8.35Hz，2Tyr Ar-CH)，4.7-4.6(1H，m CαH)4.19-4.10(4H，m，芴基CH，芴基CH2
和CαH)，2.92-2.91(3H，m，1Tyr CH，Ser CH2)，2.73-2.71(1H，m，Tyr CH).MS(ES+)：m/z
491.00[M+H]+。
Pyr-YL-OH的合成：将1-芘乙酸(0.50g，1.92mmol)、L-酪氨酸叔丁基酯(0.46g
1.93mmol)和HBTU(0.740，1.95mmol)在10mL无水DMF中混合。将0.89mL(4.8mmol)DIPEA加入
到此溶液中，并将混合物在氮气气氛中搅拌过夜。反应后，在用20mL 1N NaHCO3和20mL 1N
盐酸连续冲洗后，通过50mL乙酸乙酯萃取产物，然后经MgSO4干燥。在蒸发溶剂后，此化合物
通过柱层析法在硅胶上使用二氯甲烷/甲醇(95∶5)作为洗脱剂(0.7g，75％)进行纯化。然
后，所述化合物(0.6g，1.25mmol)的叔丁基基团通过与三氟乙酸(2mL)在无水二氯甲烷中反
应15小时被移除。溶剂和过量的三氟乙酸在真空下被去除，得到芘-Y酸(0.53g，1.25mmol)。
然后，通过利用芘-Y酸(0.52g，1.22mmol)、L-亮氨酸叔丁基酯盐酸盐(0.23g 1.25mmol)、
HBTU(0.47，1.25mmol)和0.58mL(3.1mmol)DIPEA在10mL无水DMF中的肽偶联反应获得芘-
YL-Otbu。通过柱层析法在硅胶上使用二氯甲烷/甲醇(95∶5)作为洗脱剂获得纯产物
(0.38g，52％)。最后，通过使用三氟乙酸去除芘-YL-Otbu(0.3g，0.506mmol)的叔丁基基团，
得到纯的芘-TL(0.27mg，0.5mmol)。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.79-0.83(m，6H，在亮氨酸结构部分中的CH3)，1.48-1.57
(m，3H，在亮氨酸结构部分中的CH和CH2)，2.7-2.95(m，2H，在酪氨酸结构部分中的CH2)，4.1
(s，2H，在芘肽接头处的CH2)，4.22-4.28(m，1H，在亮氨酸结构部分中的手性CH)，4.52-4.58
(m，1H，在酪氨酸结构部分中的手性CH)，6.63(d，2H，在OH基团的邻位处的CH 3J＝8.0Hz)，
7.0(d，2H，在OH基团的间位处的CH，3J＝8.0Hz)，7.86(d，1H，芘芳族CH3J＝8.0Hz)，8.07-8.1
(m，1H，芘芳族CH)，8.16-8.16(m，2H，芘芳族CH和酰胺NH)，8.18-8.27(m，4H，芘芳族CH和酰
胺NH)，8.41-8.43(m，3H，芘芳族CH)。ESI-MS：m/z：C33H32N2O5的计算值：536.23[M+]；实测值：
559.27[M++Na]。
Fmoc-FF和Fmoc-FFF分别购自BiogelX和BACHEM。
乳液的制备。通过将5.32mg Fmoc-YL溶解在1mL磷酸盐缓冲溶液中制备10mM
Fmoc-YL溶液。将不同体积的氯仿加入至处于80℃的Fmoc-YL缓冲溶液(缓冲溶液与氯仿的
体积比从1∶9，3∶7，5∶5，7∶3改变至9∶1，总体积一直为1mL)，在用手震荡5秒后，在小瓶中形
成乳液。对于SEM、IR、稳定性、平均粒度、临界乳液浓度和反乳化测量，缓冲溶液与氯仿的体
积比固定为7∶3。研究的所有芳族肽两亲分子(Fmoc-YA、Fmoc-YS、Pyr-YL、Fmoc-FF和Fmoc-
FFF)的浓度为10mM，例外的是，在临界乳液浓度的测定(0.1-10mM)和反乳化测量(2mM)中。
表征。Fmoc-YL微囊体的结构通过Hitachi S800场发射扫描电子显微镜(SEM)以
10keV的加速电压测定。Fmoc-YL、YA和YS的转移通过UV-Vis光谱法(JAS.C.O V-660分光光
度计)来分析。Fmoc-YL凝胶的形成和ThT的标记通过荧光光谱法(JAS.C.O FP-6500分光荧
光计)来进行。在Thermo Electron Exactive上记录高分辨率质谱(HRMS)。在Brucker
Avance400光谱仪上在室温下使用全氘化溶剂作为内部标准记录400.1(1H)NMR谱。
乳液液滴通过荧光显微镜表征。所述装置安装在倒置显微镜(AXIO Observer A1，
Zeiss)上，并使用EMCCD LucaR照相机(Andor Technologies)采集图像。使用Zeiss x20干
物镜和设定用于被成像的荧光团的适宜滤光片采集图像(使用亮视场和荧光显微镜)。使用
ImageJ分析图像。
通过原子力显微镜(AFM)确定Fmoc-YL、YA、YS的纤维结构。通过在环境条件下使用
以轻敲模式运行的Veeco diINNOVA扫描探针显微镜(VEECO/BRUKER，Santa Barbara，CA，
USA)扫描云母(mica)表面来获得图像。20μl溶液置于与AFM支撑托附接的经修剪的和刚切
割的云母片(G250-2云母片1″x1″x 0.006″；Agar Scientific Ltd，Essex，UK)上并在无尘
环境中风干过夜。以512x 512像素分辨率进行AFM扫描。典型的扫描参数如下：敲击频率
308kHz，整体增益和比例增益分别为0.3和0.5，设定点0.5-0.8V和扫描速度1.0Hz。
通过红外吸收光谱测定β片层样排列，红外吸收光谱在Bruker Vertex70光谱仪上
记录，每个样品以1cm-1的分辨率平均扫描25次。将样品夹在两个被50μm聚四氟乙烯(PTFE)
垫片隔开的2mm CaF2窗之间.
计算筛选：
经由VMD脚本工具获得肽结构并使用martinize.py脚本将其转换成MARTINI CG表
示法。CG肽的300个分子被随机插入到尺寸为12.5x12.5x12.5nm3的箱中，并用CG水溶剂化。
将300个离子(Cl-或Na+)添加到体系中以完全地中和电荷。对添加1000个辛烷分子的两相体
系执行相同的程序。将辛烷添加至水/肽混合物中以得到近似于水的实验密度(999kg m-3)
的密度。这通过将最小化的水/三肽箱与最小化的辛烷箱合并来实现。
最小化的箱被平衡用于具有25fs时间步长的500,000个步长(由于CG电位的软度，
通过对时间的缩放，12.5ns模拟时间～50ns实时)7。使用Berendsen算法来保持温度(300K)
和压力(1巴)恒定。周期性边界条件有效。
每个体系模拟9.6μs(模拟时间)，其中之后最后一帧用来鉴定完成的结构。
实验验证：
肽以＞98％的纯度购自Bachem。
肽的准备通过将肽溶解在水中并将pH改变至中性pH～7.5来执行。
向每个体系中加入100μL苏丹II标记的菜籽油。之后对每个样品进行匀浆5秒；将
样品保存24小时以确保形成稳定的乳液。
FTIR
将FTIR样品容纳在标准IR Harrink池内的两个2mm CaF2窗之间。将一个50um聚四
氟乙烯(PTFE)垫片置于垫片之间。在Bruker Vertex70光谱仪上通过以1cm-1的光谱分辨率
将25次扫描平均来记录光谱。
荧光显微镜
通过将样品放置在载玻片上，将盖玻片置于上方来准备荧光显微镜样品。将一滴
硅油置于样品上以允许获得润滑的表面。在Nikon Eclipse E600正置荧光显微镜上以
x1000放大倍数测量样品。
时间稳定性
这些初始的观察结果表明样品显示出胶凝行为，与形成其他结构的样品相比倾向
于形成更稳定的乳液。这表明原纤维的形成对肽在界面处自组装形成稳定乳液的能力具有
很大的重要性。原纤维围绕油滴，抑制液滴的凝聚。如观察到的那样，在168小时的过程中的
时间稳定性显示对于KYF、KFF和KYW很少或没有反乳化，而对于没有形成原纤维的DFF和FFD
肽观察到可见的反乳化。这个观察结果表明原纤维的形成是稳定乳液的主要驱动力。原纤
维形成的重要性已经显示对于乳液的稳定是至关重要的。对乳化之前和之后FTIR的比较显
示了有助于稳定液滴的关键相互作用。
温度研究显示了乳液开始破乳的范围。表明KYF在整个温度范围内是相对稳定的。
30-40℃之间的温度增加显示KFF破乳。KYW在大约40-50℃稍高的温度下破乳。我们观察到
DFF和FFD在较低的温度下相对地不稳定，并且温度增加导致最小的改变。
磷酸酶试验
凝胶准备。在950μL 0.6M磷酸钠缓冲液(pH 8)中准备10mM合成的Fmoc-YpL，并且
立即加入50μL碱性磷酸酶(0.0555U.μL-1，或55.53U.mL-1酶浓度)，涡旋并在室温下接受超
声波。除非另外说明，所有表征在24小时后完成。对于Fmoc-YpL前体，准备是相同的，不同之
处是不加入酶。
乳液制备。Fmoc-YpL以如前所述的相同方式准备，但以5mM浓度以避免水凝胶的形
成。从已经在缓冲液中准备Fmoc-YpL以及加入碱性磷酸酶(以确保完全去磷酸化)24小时
后，将500μL氯仿加入至500μL样品中并用手震荡5秒，以制备50∶50水包氯仿乳液。
按需活化试验。为了检查所述体系是否可以按需转换，除了立即向50∶50水包氯仿
Fmoc-YpL样品中加入碱性磷酸酶以外，在准备好后1周、2周和1个月，将酶加入至Fmoc-YpL
的反乳化两相体系中。拍摄照片并通过反相HPLC评估去磷酸化。
计算
在NAMD(NAnoscale Molecular Dynamics)程序中使用CHARMM力场进行分子动力
学(MD)模拟。每个体系在300K用陡降技术最小化，然后逐渐从0加热至300K持续55ps，然后
平衡445ps，以达到体系稳定。最后，所述体系在NPT系综(NPT ensemble)内以1atm和300K运
行200ns。与用于非键合相互作用的截止值一起，2.0fs时间步长用来积分牛顿运动方
程。已经使用了三维坐标中的周期性边界条件。
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