含有用锌及选择性的赖氨酸或者钙离子 预处理过的生长激素的稳定药物组合物 本发明涉及含有生长激素的稳定药物组合物，制备该组合物的方法，使用锌稳定生长激素的组合物，以及治疗因生长激素异常所致疾病的方法。
人及普通家禽的生长激素为约含191个氨基酸的蛋白质，其在垂体前叶合成并分泌。人类生长激素由191个氨基酸组成。
生长激素为一种重要的激素，不仅参与躯体生长的调节，而且还参与蛋白质，碳水化合物及脂肪代谢的调节。生长激素的主要作用是促进生长。
受生长激素影响的器官包括骨骼，结缔组织，肌肉，以及内脏如肝脏，肠及肾脏。
由于重组技术的发展及生长激素基因的成功克隆，现已对如人类生长激素及Met-hGH进行工业化生产提到日程上来，但在此之前只能从人尸体的垂体中提取得到人类生长激素。虽然人们建议使用生长激素治疗身材矮小(因生长激素缺乏而致，正常身材矮小及Turner综合症)，成人生长激素缺乏，不孕症，烧伤，伤口愈合，营养不良，骨折愈合，骨质疏松，弥漫性胃出血以及假关节，但由于生长激素非常有限地供应限制了其在矮小患者的儿童和青春期纵向生长促进的应用。
此外，还有人建议使用生长激素增加家禽的生长速度或者减少动物脂肪的比例以供人类进行消耗。
生长激素的药用组合物不很稳定。尤其是生长激素的溶液剂型，可产生降解产物如去酰胺化或者硫氧化产物及二聚体或者多聚体形式。
hGH的主要降解反应有1)通过直接水解进行脱酰胺化或者通过形成环琥珀酰亚胺中介物而最后形成不同量的L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH，D-asp-hGH，以及D-iso-asp-hGH(ref 1-3)，和2)14及125位点上的蛋氨酸氧化(ref 4-9)。溶液甚至冻干状态下的hGH的主要降解产物为脱酰胺的hGH。
脱酰胺化主要发生在149位点上的Asn，另外152位点上的Asn也发生少量的脱酰胺反应。
hGH在其14和125位点上也很容易发生氧化反应。
溶液中的hGH发生氧化形成亚砜是由于溶解在剂型中的氧所致。氧在蒸馏水中的溶解度约为200uM(9)。当含有4IU/ml剂型的hGH浓度为1.3mg/ml时则相当于60nM的hGH，在正常的储存条件下，经化学计量计算，氧的含量已超过氧化hGH所需量的3000倍。但要想在剂型封装前将缓冲液中的气体排出并不是一件容易的事情。
虽然目前认为hGH的脱酰胺及氧化形式没有毒性，生物活性的改变或者受体结合特性的改变，但是较天然的hGH比较其亚砜物的构形稳定性降低了。
开发含hGH的稳定旦可溶的剂型，对于了解脱酰胺反应及亚砜化物形成的速率以及寻找控制反应的方法是很重要的。
降解的动力学取决于温度，pH以及hGH剂型中各种添加剂或者佐剂。
由于不稳定性，生长激素目前是以冻干的形式储存在4℃的条件下，直到使用前才进行配制，这样可使降解减至最小。
含有hGH的冻干药用剂型目前在使用期间由病人配制成溶液形式，在这种状态下4℃可储存14天，但即使是这样仍然会有一些降解反应发生。
另外，对病人来讲将冻干的生长激素进行配制也常常是有困难的。
因此，目前主张使用生长激素前尽可能晚地进行配制，并将剂型是在冻干的形式下储存及运输。在生产者到药房这一转运链中尽可能使剂型在控制的低温条件下如4℃进行，这样可将其在药架上的有效期延长至2年。
可是，随着自我给药的存放系统的广泛应用以及使用范围的扩大，最后的使用者在足够冷却的条件下得到足够长时间稳定的制剂不总是可能的。
优选最后的使用者所用的剂型在冻干状态下能够保持稳定一个月，并且在存放装置中重新配制的情况下另外保持稳定一个月从而延长制剂的使用时间。
因此，需要一种更稳定的生长激素剂型，该剂型的冻干状态可在相对较高的温度下保持较长时间的稳定，另外使用期间的溶液状态也可在相对较高的温度下保持较长时间的稳定性。当生长激素的给药由临床转为在家给药时而又没有上述合适的储存条件时，这种稳定性对这种情况是非常重要的。
另外，为了方便病人使用，使生长激素的给药方式适于存放方式使用，这就需要含有生长激素的稳定可溶解的剂型。可制备稳定的含有生长激素的溶解剂型，以适于患者不必重组制剂而以存放装置的药筒形式使用，因而不需冻干剂型、重组所需的适宜装置及为灭菌重组制剂所需的技术及无菌器皿。
为了安全的原因，避免恰在使用制剂前重组冻干制剂也是需要的。
另外，在制备生长激素时避免冻干步骤也是很有益的。冻干处理过程耗时且费用昂贵，并且由于冻干器容量的限制也常常是生产过程中的瓶颈步骤。
因此，有必要降低降解的速度以使溶解的hGH剂型在药架和使用期间保持稳定一个月。
以往对于稳定hGH的尝试都不是很成功，主要的原因是不能有效的防止二聚体的形成。有关二聚体形成的问题可参见Becker，G.W.报道的文献，生物技术和生化应用9,478(1987)。
国际专利公开号WO 89/09614及澳大利亚专利申请号30771/89披露了一种稳定的含有生长激素，甘氨酸以及甘露醇的药物制剂。该制剂在重新配制后使用期间及在加工过程及冻干状态储存期间都显示出改善的稳定性。
欧洲专利申请公开号3003746披露了可使用各种稳定剂来稳定动物的生长激素，从而减少不溶性物质并保持液态下药物的活性，这类稳定剂包括一些多元醇，氨基酸，在生理条件pH条件下侧链带有电荷的氨基酸聚合物，以及胆碱盐。多元醇包括未还原的糖类，糖醇，糖酸，季戊四醇，乳糖，水溶性右旋糖苷和菲克；氨基酸包括甘氨酸，肌氨酸，赖氨酸或者其盐，丝氨酸，精氨酸或者其盐，甜菜碱，N，N，-二甲基-甘氨酸，天门冬氨酸或者其盐，谷氨酸或者其盐；在生理pH条件下侧链带有电荷的氨基酸聚合物可包括多聚赖氨酸，多聚天门冬氨酸，多聚谷氨酸，多聚精氨酸，多聚组氨酸，多聚鸟氨酸或者其盐；胆碱衍生物包括氯化胆碱，枸橼酸二氢胆碱，二酒石酸胆碱，碳酸氢胆碱，枸橼酸三胆碱，抗坏血酸胆碱，硼酸胆碱，葡萄糖酸胆碱，磷酸胆碱，硫酸二胆碱及粘多糖酸二胆碱。
美国专利说明书书号为4,917,685披露了一种埋置式的给药装置其包括，以EP303746中所述的稳定剂稳定的生长激素。
已公开的欧洲专利申请号为374,120公开了含有hGH和具有三个羟基的多元醇的稳定制剂。其中提到了甘油和三(羟甲基)氨基甲烷。另外还公开了多元醇与作为缓冲液的盐酸组氨酸在一起。
国际专利公开号为WO 92/00998公开了用锌形成的生长激素结晶。
国际专利公开号为WO 93/12811公开了含有天冬酰胺的稳定的生长激素制剂，该制剂为冻干粉末形式或者水溶液形式。
国际专利公开号为WO 93/12812公开了含有组氨的稳定的生长激素制剂，该制剂为冻干粉末形式或者水溶液形式。该制剂与含有磷酸缓冲液生长激素制剂比较脱酰胺反应降低了25-30％。另外还公开了在组氨酸存在的条件下用锌的生长激素可以形成结晶。
国际专利公开号为WO 93/19776公开了一种以枸橼酸盐作为缓冲物质的生长激素蛋白制剂，该制剂较以磷酸盐作为缓冲液的制剂更为稳定。该制剂也可含有氨基酸如甘氨酸及丙氨酸和/或甘露醇或其它糖醇和/或甘油和/或其它碳水化合物，及选择性的防腐剂如苄醇。
国际专利公开号为WO 94/03198公开了一种稳定的水溶液制型，该制剂含有生长激素，缓冲液，非离子表面活性剂，选择性的中性盐，甘露醇或者防腐剂。
已公开的欧洲专利申请号为177,478公开了一种缓释组合物，该组合物包括在生物相容油连续相中的锌及生长激素。
已公开的欧洲专利申请号为216,485公开了一种可持续释放组合物，该组合物包括于载体中的锌及生长激素，该载体含有植物油和佐剂，佐剂为蜂蜡，单硬脂酸铝，巴西棕榈蜡或者液体石蜡。
已公开的欧洲专利申请号数为277,043披露了一种方法，该方法通过加入一种过渡金属盐并沉淀不容性的复合物来回收溶液中的生长激素。
国际专利公开号为WO 93/13792公开了一种可埋藏式的缓释给药装置，该装置装有生长激素，锌，一种选择的含有溶解锌-生长激素氨基酸的碱性侧链集团，以及上述实例中所述的氨基酸-精氨酸，丙氨酸，组氨酸及谷氨酸。
国际专利公开号数为WO 92/17200公开了二聚体形式的稳定不易变性的生长激素金属离子制剂。该制剂包括甘氨酸，可选择加入的丙氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，精氨酸或者赖氨酸，当冻干剂型以产生足够的量来形成稳定的干燥条块制剂时，这些氨基酸是很有益处的。
现已令人惊异地发现在最终的制剂制备前，用锌及选择性的赖氨酸或者钙离子处理生长激素可使其在水溶液中对脱酰胺反应具有很高的稳定性，并且在冻干情况下很容易在含水溶剂中溶解。产品的这种稳定性使其可以以冻干的状态或者溶解或再溶解的制剂形式进行储存及运输。
本发明的药物制剂可以任何适宜方式配制给药，如非肠道或口服给药或粘膜给药如通过鼻粘膜给药。本药物制剂可做成一定剂量的各种形式，如将其装入小瓶或者药筒或者其它容器内如预先填充的注射器或者笔式装置。
所以本发明的制剂可以制成冻干的粉末状，以后可用常规的载体如蒸馏水或者注射用水进行重组，也可制成含有生长激素的溶液形式。载体包括常规的稳定剂如苯酚，m-甲苯酚及苄醇。
本发明生长激素制剂的优选实施例是将人生长激素预先用锌及选择性的赖氨酸或者钙离子处理，其还包括生长激素的缓冲水溶液形式的载体。这种制剂是一种备用形式，并且可以以水溶液的形式储存及运输而没有明显的降解。
作为预处理生长激素溶液的缓冲液可以是如组氨酸，枸橼酸盐，酒石酸盐或者是磷酸盐缓冲液。但以组氨酸缓冲液为较好。
预先处理溶液的pH值应在约2到9之间，但以6到8为较好，7-7.3为最好。
为了使制剂稳定，预处理过的生长激素最后制剂的pH值应约在2到9之间，但以6-8为较好，6.0到6.8为最好。
为了得到稳定的效果，锌及选择性的赖氨酸或者钙离子锌的量优选加至2mM，但以每摩尔生长激素1到4摩尔锌为较好，以每摩尔生长激素1到2摩尔锌更好，最好是每摩尔生长激素1摩尔锌。
加入的锌以生理相容的可溶性盐的形式如氯化锌为较好。
如果使用钙以加入生理相容的可溶性盐的形式如氯化钙为较好。
本发明的药物制剂还可包括为了调节强度的盐或者糖醇，以及为了便于加工如冻干以及在使用前快速并完全溶解冻干的制剂的选择性赋形剂。
赋形剂可有以选自：二糖如乳糖，海藻糖和蔗糖，糖醇如山梨醇或者甘露醇，多糖如已经商品化的葡聚糖(Dextran)多聚物如Dextran40，Dextran70，或者Dextran75，菲克(Ficoll)，多元醇如聚乙二醇或者聚乙烯醇，或者上述两种或者多种的混合物。
本发明另一方面涉及制备药物制剂的方法，该制剂包括用锌和选择性的赖氨酸或者钙离子进行预处理的生长激素，其中生长激素溶于含锌和选择性的赖氨酸或钙离子的溶液，具体的步骤是先将氯化锌溶于含有选择性赖氨酸或者钙离子的去离子水中，将该溶液静置片刻，然后加入生长激素并调节pH至2到9。
通过加入对生长激素无副作用的酸来调节pH值，优选生理可接受的酸如矿物酸如盐酸，硫酸或者硝酸或者有机酸如乙酸。
在本发明方法的一个实施例中，选择性地加入盐及一种赋形剂，然后将溶液装入容器内并进行冻干。
本发明还涉及使用锌和选择性的赖氨酸或者钙离子来预处理生长激素，从而得到稳定的生长激素制剂。
本发明还涉及治疗因生长激素异常而引发的疾病的方法，该方法包括给予一种预先经锌和选择性赖氨酸或者钙离子处理过的生长激素的制剂。
本文中所述的“生长激素”可来源于下面的动物器官如鸟，牛，马，人，绵羊，猪，大马哈鱼，鳟鱼或者金枪鱼，但以人，牛或者猪的生长激素为较好，以人的生长激素为最好。本发明中所使用的生长激素可以是从天然物提取的天然生长激素，如使用常规的方法从垂体腺提取，或者是用重组技术制备的生长激素，如E.B.Jensen和S.Carlsen在生物技术和生物工程.36，1-11(1990)杂志中所报道的。“生长激素”可以是已经切掉了一个或者多个氨基酸的生长激素；可以是天然生长激素中一个或者多个氨基酸已经被其它氨基酸替换的类似物，其中氨基酸以天然氨基酸为较好，但上述的替换不应引起不良的影响如增加了抗原性或者减少了药物活性；也可以是带有N-或者C-末端的其衍生物，如Met-hGH。以hGH这种生长激素为较好。
生长激素“剂量”这一词是指在给药的方案中可以起到治疗效果的量。所制备的制剂含有hGH的量至少为0.1mg/ml，以达到10mg/ml为较好，一般为1mg/ml到40mg/ml，以1mg/ml到25mg/ml为较好，如1mg/ml到5mg/ml，剂量是按照备用制剂来计算的。如给患垂体功能低下的侏儒症病人服用该组合物，该制剂应含有hGH 0.1mg/ml到10mg/ml，这与所要治疗疾病的剂量方案相对应。本发明的浓度范围倒不是很重要，可根据执行治疗的医生来变化。
本发明所使用的赖氨酸以天然的α氨基酸为较好。赖氨酸可以是1或者d赖氨酸或者是两者的混合物。
如制剂较常规含有磷酸盐缓冲液的剂型更稳定且优选与相应的含组氨酸作稳定剂的制剂一样稳定，则得到了本发明中所述的“高稳定性”剂型，其中与WO 93/12812中用磷酸盐缓冲液的制剂比较，用组氨酸作为稳定剂的相应制剂其hGH的脱酰胺反应减少了20％。
本发明方法中所用的溶剂可为水，醇类如乙醇，n-丙醇或者异丙醇，丁醇或者是它们的混合物。溶剂中可含有稳定剂如苯酚，m-甲苯酚或者苄醇。
本文中与生长激素制剂相关的“预处理”一词是指在为制备生长激素制剂加入其它成分之前，使用锌和选择性的赖氨酸或者钙离子来处理生长激素。
本发明将通过下述实施例更详细地阐述本发明。但这些实施例并不是用来限制附加的权利要求所限定的本发明的范围。
实验部分
实施例
减少脱酰胺反应
对于含有4mg/ml hGH，0.18mM ZnCl2，3mM组氨酸，1.5％苄醇，pH6.8的hGH制剂在于37℃经过不同的预处理后测定脱酰胺的速度，并比较pH为6.8时组氨酸和磷酸盐缓冲液的制剂在脱酰胺速度上的差异。
hGH制剂是通过将24mg hGH溶解于2.5ml下面的溶液来制备的
a)2mM CaCl2+0.36mM ZnCl2，pH7-7.3
b)2mM赖氨酸+0.36mM ZnCl2，pH7-7.3
c)0.36mM ZnCl2，pH7-7.3。
在4℃下静置1h后(使锌与hGH复合)，使用PD10去盐柱子(Pharmacia)重配制剂a)-c)，使其成为3ml 6mM组氨酸，0.36mM ZnCl2，8mg/mlhGH的制剂。然后加入3ml 3％的苄醇使最后的制剂含有4mg/ml hGH，3mM组氨酸，0.18 ZnCl2 mM，1.5％苄醇，(通过加入HCl/NaOH将pH调节至6.8)。
所用的对照制剂为a)4mg/ml hGH，3mM组氨酸，0.18mM ZnCl2，1.5％苄醇，pH6.8；b)4mg/ml hGH，3mM组氨酸，1.5％苄醇，pH6.8；和c)4mg/ml hGH，3mM组氨酸，3mM Na2HPO4，1.5％苄醇，pH6.8。对照剂型预先不经Zn++处理。
在下面表中所述的hGH制剂于37℃的条件下储存7天，然后用IE-HPLC分析脱酰胺的hGH的含量。结果见下面的表。 制剂 pH开始/pH最后脱酰胺hGH的含量(％)#与用组氨酸的比较脱酰胺含量 (％)3mM组氨酸，0.18mM ZnCl2，1.5％苄醇， pH6.8。 按步骤a)预处理 6.78/6.84 10.0 84 3mM组氨酸，0.18mM ZnCl2，1.5％苄醇， pH6.8。 按步骤b)预处理 6.75/6.83 11.3 88 3mM组氨酸，0.18mM ZnCl2，1.5％苄醇， pH6.8。 按步骤c)预处理 6.79/6.87 11.5 89 3mM组氨酸，0.18mM ZnCl2，1.5％苄醇， pH6.8。 未预处理 6.84/6.92 12.8 99 3mM组氨酸，1.5％苄 醇，pH6.8。 6.84/6.92 12.9 100 3mM Na2HPO4，1.5 ％苄醇，pH6.8 6.83/6.86 15.9 123
#脱酰胺的量是通过pH值6.8的每0.1pH单位偏差的1％校正的。
上面的表显示在再用盐处理最终的组氨酸制剂之前，在钙离子或者赖氨酸存在的条件下，经锌离子处理hGH溶液后，对于组氨酸，hGH脱酰胺速率减少到84％(磷酸盐制剂为68％)。
参考文献
1)Y.-C.J.Wang and M.A.Hanson.蛋白和多肽类的非肠道制剂：稳定性和稳定剂。非肠道科学和技术杂志42(Suppl.)(1988)53-525.
2)M.C.Manning，K.Patel，R.T.Borchardt.蛋白药物的稳定性。药物研究6(11)(1989)903-918.
3).B.A.Johnson，J.M.Shirokawa，W.S.Hancock，M.W.Spellman，L.J.Basa and D.W.Asward.生物化学杂志264，1462-71(1989).
4)L.C.Teh et al.，生物化学杂志，262，785-794(1987).
5)G.W.Becker et al.，生物技术、生物化学应用，10，326-337(1988).
6)R.A.Houghten et al.，生物化学、生物物理，178，350-355(1977)
7)R.M.Riggin et al.，生物分析，167，199-209(1987).
8)P.Gellerfors et al.，Acta Paediatr.Scand(suppl)，370，93-100(1990).
9)M.J.Kaufman，药物研究，7(3)289-292(1990).