用于治疗疾病的同种异体自噬体富集组合物.pdf

本申请涉及一种组合物，其包括：衍生自非小细胞肺癌细胞系的自噬体的富集群，并且其中所述自噬体的富集群包括：一种或多种Toll样受体激动剂；一种或多种肿瘤抗原；和一种或多种损伤相关分子模式分子。如此，可对具有不同肿瘤类型的患者施用现成的疫苗以刺激目标免疫应答。

权利要求书
1.  一种组合物，其包括：
衍生自非小细胞肺癌细胞系的自噬体的富集群，并且其中所述自噬体的富集群包括：
一种或多种Toll样受体激动剂；
一种或多种肿瘤抗原；和
一种或多种损伤相关分子模式分子。

2.  如权利要求1所述的组合物，其中一种或多种Toll样受体激动剂包括用于Toll样受体2、Toll样受体3、Toll样受体4、Toll样受体7和/或Toll样受体9或其组合的激动剂。

3.  如权利要求2所述的组合物，其中一种或多种肿瘤抗原包括WT1、p53、生存素、EphA2、细胞周期蛋白B1和/或XAGE1或其组合。

4.  如权利要求3所述的组合物，其中一种或多种损伤相关分子模式分子包括钙网蛋白、HMGB1、HSP70、HSP90、和/或Grp94或其组合。

5.  如权利要求4所述的组合物，其中所述非小细胞肺癌细胞系为UbLT3细胞系。

6.  如权利要求4所述的组合物，其中所述非小细胞肺癌细胞系为UbLT6细胞系。

7.  如权利要求1所述的组合物，其进一步包括构造为提高对一种或多种肿瘤抗原的免疫应答的分子，包括自噬体的富集群。

8.  如权利要求7所述的组合物，其中所述分子为聚肌胞苷酸。

9.  如权利要求7所述的组合物，其进一步包括非特异性佐剂。

10.  如权利要求9所述的组合物，其中所述非特异性佐剂为IFN-γ。

11.  一种在哺乳动物中诱导特异性免疫应答的方法，其包括：
提供组合物，所述组合物包括：
衍生自细胞系的自噬体的富集群，所述自噬体的富集群包括：
一种或多种Toll样受体激动剂；
一种或多种肿瘤抗原；和
一种或多种损伤相关分子模式分子。

12.  如权利要求11所述的方法，其进一步包括：
从哺乳动物的外周血分离外周血单核细胞；
使分离的外周血单核细胞的亚群与所述自噬体的富集群接触；和
将接触后的分离的外周血单核细胞的亚群注入回哺乳动物。

13.  如权利要求12所述的方法，其中所述分离的外周血单核细胞的亚群包括专职的抗原递呈细胞和非专职的抗原递呈细胞。

14.  如权利要求11所述的方法，其中在施用GM-CSF、Flt3L和/或CpG之后，从所述哺乳动物中分离所述外周血单核细胞。

15.  如权利要求11所述的方法，其中所述细胞系已被工程化以表达CD80。

16.  如权利要求11所述的方法，其中所述细胞系已被工程化以表达巨细胞病毒蛋白pp65。

17.  如权利要求11所述的方法，其进一步包括：
通过检测对一种或多种肿瘤抗原特异性的一种或多种细胞因子的分泌来筛选对包括在所述自噬体的富集群中的一种或多种肿瘤抗原的特异性免疫应答的诱导。

18.  一种筛选能产生同种异体自噬体富集组合物的细胞的方法，所述组合物能在外周血单核细胞亚群上诱导选择性标记的表达，所述方法包括：
使细胞与蛋白酶体抑制剂接触；
使细胞与溶酶体抑制剂接触；
收获所得自噬体；
确定收获的自噬体的分子特征物；和
选择将一种或多种Toll样受体激动剂和/或一种或多种分子伴侣转移到收获的自噬体的细胞。

19.  如权利要求18所述的方法，其中所述选择性标记为BDCA3，并且所述外周血单核细胞的亚群包括树突细胞。

20.  如权利要求18所述的方法，其中所述选择性标记为CD80，并且所述外周血单核细胞的亚群包括单核细胞。

说明书用于治疗疾病的同种异体自噬体富集组合物
相关申请交叉引用
本申请要求2012年10月23日提交的名为“用于治疗疾病的自噬体富集组合物(AUTOPHAGOSOME-ENRICHED COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF DISEASE)”的美国临时专利申请第61/717,585号的优先权，在此通过引用将所述申请的全部内容并入本文用于所有目的。
技术领域
本申请涉及自噬体富集组合物以及通过施用自噬体富集产物本身或与互补治疗联合来刺激、增强或促进免疫应答的方法。
背景技术
宿主专职抗原递呈细胞(APC)对外源性抗原的交叉递呈在针对肿瘤相关抗原(包括由肿瘤细胞衍生的自体抗原或突变的自体抗原，以及由感染因子衍生的外来抗原)的T细胞免疫应答的发生和发展中起到关键作用。已经在开发的有前景的癌症疫苗试图利用外源性抗原的交叉递呈来引发(illicit)针对肿瘤的特异性免疫应答。
然而，使用癌症疫苗的特异性主动免疫在动物模型或临床试验中并不非常有效(Rosenberg等人,Nat.Med.10:909-15,2004)。癌症免疫疗法成功的主要障碍是疫苗不能诱导大的初始膨胀以及随后的肿瘤-反应性CTL的持续(Rosenberg等人,Nat.Med.10:909-15,2004)。癌症免疫疗法现有方法的另一个障碍是，除了黑色素瘤以外，对于大多数癌症而言，潜在的肿瘤排斥抗原是未知的，而且主要的肿瘤排斥抗原很可能是肿瘤或患者特异性的。
以前，发明人已确定用蛋白酶体抑制剂降低或抑制细胞蛋白降解可以导致缺陷型核糖体产物(DRiPs)和短寿蛋白(SLiPs)(及其免疫原性片段)的细胞积累并分泌到“小泡(blebs)”中。这里表明，在蛋白酶体抑制剂诱导的自噬之后，从细胞(例如肿瘤或病原体感染的细胞)释放或被包含在所述细胞中的DRibbles可以将DRiPs和SLiPs(及其片段)积累在自噬体中，并通过交叉激活而诱导强免疫性(例如抗肿瘤或抗病原体)。例如，肿瘤衍生的Dribbles以及负载有肿瘤衍生的Dribbles的抗原递呈细胞(APCs)(例如树突细胞)，与用活的或死的肿瘤细胞温育的APCs相比，在体外或体内都可以更有效地激活肿瘤反应性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)和辅助性T-淋巴细胞(HTL)。在具体的实施例中，对受试者施用Dribbles(例如分离的Dribble群，如产生Dribbles的细胞群，或如负载有Dribble的树突细胞)增加CD4和CD8细胞的生成并促进炎性细胞因子或趋化因子例如IL-6、IL-12和TNF-α中的一种或多种的产生。
发明人之前公开了用于产生和分离Dribbles的方法(US2009/0220530)。该方法包括使靶细胞与足量的蛋白酶体抑制剂在足以产生Dribbles的条件例如基本上抑制细胞内蛋白降解的条件下接触。在某些实施例中，该方法进一步包括使靶细胞在与蛋白酶体抑制剂接触之前、之中或之后，与足量的自噬诱导剂接触。该细胞也可以与一种或多种减少蛋白糖基化的试剂接触。在一个实施例中，该细胞与足量的蛋白酶体抑制剂(如20nM万珂(Velcade))、自噬诱导剂(如雷帕霉素或HBSS)和NH4Cl在足以刺激细胞产生Dribbles的条件下接触。在一个实施例中，通过从细胞中分离所述Dribbles来收获在所述条件下生成的Dribbles。在一个示例性方法中，细胞可与足量的可包括蛋白酶体抑制剂的组合物在足以基本上抑制细胞内蛋白质降解的条件下接触，例如温育6～24小时。随后可以将所述细胞在足以在细胞中诱导自噬的条件下温育，例如用自噬诱导剂温育6～24小时。随后，所得细胞和Dribbles可在使细胞成团、同时Dribbles保留在溶液中的条件下离心。随后可以将包含Dribbles的上清液移除，然后可以在足以使Dribbles 成团的条件下离心。
然而，发明人在此已经认识到现有技术中公开的用于产生和分离Dribbles的方法不足以产生和分离出自噬体的富集群及其被进一步用作有效疫苗的组分物质。本公开描述了用于筛选可以产生有效疫苗的细胞系(包括癌细胞系和非癌细胞系两者)的新方法。该细胞系的特征在于在用蛋白酶体抑制剂和NH4Cl处理时产生自噬体，所述自噬体除了包含DRiPs、SLiPs和其他肿瘤抗原之外，还可以含有Toll样受体(TLR)配体、损伤相关分子模式(DAMPs)和分子伴侣。另外，在被递呈到APCs的普通群体时，Dribbles所含的肿瘤抗原的交叉递呈可能不足以产生对抗肿瘤的有效的免疫应答。本公开描述了用于包含在富集的自噬体中的抗原的有效交叉递呈的方法，其通过将富集的自噬体组合物递呈到表达CLEC9A的树突细胞(DCs)的特定亚组以产生有效免疫应答来实现。
发明人在此已经认识到上述问题，并开发了至少部分解决这些问题的组合物和方法。在一个实施例中，组合物包括由非小细胞肺癌细胞系衍生的自噬体富集群，并且其中所述自噬体富集群包括：一种或多种Toll样受体激动剂；一种或多种肿瘤抗原；和一种或多种损伤相关分子模式分子。如此，可对具有不同肿瘤类型的患者施用现成的疫苗以刺激目标免疫应答。
在另一个实施例中，在哺乳动物中诱导特异性免疫应答的方法，其包括：提供组合物，所述组合物包括由细胞系衍生的自噬体富集群，所述自噬体富集群包括：一种或多种Toll样受体激动剂；一种或多种肿瘤抗原；和一种或多种损伤相关分子模式分子。如此，可对具有不同肿瘤类型的患者施用现成的疫苗，同时用衍生自患者自身血细胞的炎症诱导佐剂来补充。
在又一个实施例中，用于筛选能产生同种异体自噬体富集组合物的细胞的方法，所述组合物能诱导选择性标记在外周血单核细胞亚群上的表达，所述方法包括：使细胞与蛋白酶体抑制剂接触；使细胞与溶酶体抑制剂接触；收集所得自噬体；确定所得自噬体的分子特征物(signature)；和选择将一种或多种Toll样受体激动剂和/或一种或多种分子伴侣转移到自噬体的细胞。 如此，Toll样受体激动剂、肿瘤抗原和损伤相关分子模式分子可被包裹在能引发针对众多癌症类型的特异性免疫应答的同种异体自噬体富集组合物中。进而，当用外周血单核细胞(PBMCs)、单核细胞、或树突细胞培养时，所得同种异体自噬体富集组合物可诱导或上调BDCA3和/或CD80的表达，且进一步诱导PBMC分泌IL-8或其他细胞因子。
附图说明
图1为表示患有各种类型的癌症的患者的百分比的图，所述癌症具有在UbLT3和UbLT6 NSCLC细胞系中上调最多的500个基因的上调。
图2A是示出了SDS-page凝胶的数字图像，指明NH4Cl的存在保护蛋白GAPDH和EEF1A1以免降解。
图2B是示出了SDS-page凝胶的数字图像，指明万珂处理增加了泛素化蛋白和短寿抗原在从处理的细胞中产生的AAECs中的比率。
图3A为以表格形式列出AAECs中存在NCI优先癌抗原的图。
图3B是示出了SDS-PAGE凝胶的数字图像，指明AAECs中存在NCI优先癌抗原。
图3C为以表格形式列出AAECs中存在NCI优先癌抗原的另一图。
图3D示出其他抗原和多个批次随时间变化的检测一致性。
图3E为被包含在AAECs中的潜在非突变抗原的汇总表。
图4A为以表格形式列出AAECs中存在DAMPs的图。
图4B是示出了SDS-page凝胶的数字图像，指明在由两种不同的细胞系衍生的AAECs中存在各种DAMPS。
图5A为显示数据的图，指明AAECs含有高水平的TLR配体。
图5B为显示数据的数字图像，指明AAECs含有DAMPs。
图6为指明AAECs中存在TLR配体的图。
图7A为显示数据的图，指明在用AAECs处理后BDCA3+细胞的百分比呈剂量依赖性增加。
图7B为显示数据的图，指明CD14+细胞和BDCA3+细胞的诱导是相关的。
图7C为显示数据的图，指明在用AAECs处理后IL-8的浓度呈剂量依赖性增加。
图8A为显示数据的流式细胞术图，指明在用AAEC衍生的UbLT3处理后人CD14+细胞中BDCA3+细胞的百分比呈剂量依赖性增加。
图8B为显示数据的图，指明与介质或TLR4激动剂MPL相比，AAECs是BDCA3+细胞更好的诱导剂。
图9A为显示数据的流式细胞术图，指明AAEC诱导的BDCA3+细胞上调被TLR拮抗剂抑制。
图9B为显示来自两个供体的数据的图，指明在TLR9拮抗剂和对照ODN滴定之后BDCA3+CD14+细胞的百分比。
图9C为显示数据的图，指明多次处理后供体PBMC中IL-8的浓度。
图9D为显示数据的图，指明各种共培养处理的AAEC摄取效率。
图9E为显示数据的图，指明上调CD80在单核细胞上的表达的AAECs至少部分通过TLR9通路来实现。
图10为指明对不同处理方法作出响应的BDCA3+细胞诱导百分比的图。
图11A为指明来自对不同处理方法作出响应的两个供体患者的细胞中IL-8的浓度的图。
图11B为指明在AAEC接触的CD14+细胞存在的情况下CD4+细胞的增殖的图。
图11C为指明作为CD4+细胞增殖的函数的TNF-α分泌的图。
图12A为示出AAECs用于检测治疗后某些患者的抗癌免疫应答的免疫监测用途的图。
图12B为示出AAECs用于检测治疗后某些患者的抗癌免疫应答的免疫监测用途的直方图。
图12C为直方图，显示免疫应答的特异性。
图12D为直方图，显示针对pp65的免疫应答的特异性。
图13为描述对AAEC处理作出响应而在来自患有各种癌症的患者的细胞中诱导IFN-γ的图。
图14A-图14I为流式细胞术图，表示来自用MDA-CD80 AAECs的各种组合温育的供体细胞的CD80表达的LSR分析。红圈强调AAECs在膜转移方面更有效。
图15A-图15E为流式细胞术图，表示来自用有或没有外来体的MDA-CD80 AAECs的各种片段温育的供体细胞的CD80表达的LSR分析。红圈强调外来体似乎没有参与CD80的膜转移。
图16A-图16I表示AAEC的aria分析，表明CD80在自噬体上表达。
图17A表示条形图，表明CD80从AAEC转移到各种细胞类型。
图17B示出了流式细胞术图，表明来自被基因工程化以表达CD80或CD40L的HEK-293细胞的AAECs也能参与膜蛋白转移。
具体实施方式
本公开描述了由用于I期/II期临床试验的两个非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤细胞系衍生的同种异体自噬体富集组合物(AAECs)。这些细胞系在本文中称为UbLT3(非特异性组织病理学)和UbLT6(腺癌样)。下文提供这些组合物的实施例，其用于处理鼠乳腺肿瘤，并在来自患有黑色素瘤、前列腺癌和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的患者的外周血单核细胞(PBMC)中刺激免疫应答。另外，基因分析表明且蛋白质分析证实NSCLC衍生的AAECs包含有许多其他的癌症中发现的抗原。例如，这些癌症可包括肺癌、卵巢癌、肉瘤、结肠癌和直肠腺癌等。细胞系衍生的AAECs的单个变体的这种广泛应用的一种益处在于，它们可以被更廉价地生产并可容易地用于治疗各种癌症，提高它们在患者背景中的易用性。虽然本示例性实施方式描述了AAECs在癌症疫苗中的效用，但AAECs也可以用于治疗其他不相关的疾病状态， 诱导炎症反应，或如下面所述，将供体膜蛋白从自噬体以靶向方式转移到受体细胞。
之前将Dribble疫苗描述为潜在的癌症治疗剂，其可由用蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理的肿瘤细胞衍生。本公开利用新的方法选择可从中衍生同种异体自噬体富集组合物的细胞系，并拓宽了治疗的潜在应用，同时简化组合物的衍生。下文提供的实施例包括由NSCLC细胞系衍生的自噬体富集组合物。发明人已证明，在NSCLC衍生的自噬体富集组合物中存在出现于广泛的多种癌症类型中的大量抗原。除了癌抗原，自噬体富集组合物可包含DAMPs、分子伴侣蛋白、各种细胞因子和TLR激动剂。这些附加的组分可存在于自噬体富集组合物中，起到保护抗原的作用，以致它们可以被有效地交叉递呈并能增强抗原递呈细胞的功能活性且刺激患者的免疫应答。免疫应答的有效刺激可有助于启动对癌细胞或病原体感染的细胞的有效攻击。而且，自噬体富集组合物组分的详细表征可进一步细化和锁定用于治疗目的的组合物。
先前的Dribble疫苗实施方式设想由患者衍生的肿瘤细胞或相同类型的可用的癌细胞系产生疫苗。这些疫苗在衍生该疫苗的癌症中产生有前途的结果。然而，一些癌细胞类型不容易在体外利用这种现有方法进行培养，获得用于这些癌症类型的疫苗可证明是困难的。本公开描述了这样的方法，其用于选择已知体外培养的细胞或组织类型，并产生可从这些细胞或组织类型衍生的组合物或产物，从而允许产生稳定的组合物而不需要培养从患者活检组织衍生的细胞。在一些实施方案中，组合物可以衍生自已被遗传改造以表达其它抗原和/或其它附加的免疫反应分子的细胞。发明人已经认识到，这种组合物可以作为现成的疫苗、产品或免疫刺激剂实现，其可以应用于广泛的癌症或感染性疾病。虽然描述的是疫苗，但应当理解，本公开包括方法、组合物和其它组合物在治疗人类疾病中的应用。
除了作为潜在癌症治疗剂用于多种癌症类型和组织学的作用以外，本文公开了AAECs和其他自噬体富集组合物的促炎性质。发明人已证实 AAECs可包括TLR-配体、DAMPs和各种细胞因子。可被包含在AAECs中的这些和其他分子可以不直接作为抗原，但当被合适的APCs摄取时，可通过诱导细胞因子的产生和其它刺激免疫应答的细胞信号而用作促炎目的，并导致有效治疗所选择的自噬体富集组合物可以靶向的疾病。
自噬体富集组合物及其相关的生产和表征方法与现有的用于癌症和感染性疾病的疫苗有所不同。例如，该自噬体富集组合物可以包含SLiPs和DRiPs两者，SLiPs和DRiPs两者在没有自噬体的情况下交叉递呈时，交叉递呈的效率通常较低。在正常的细胞条件下，这些分子的交叉递呈可能是低效的，因为它们被蛋白酶体或溶酶体严重降解。将这些蛋白产物包含在自噬体中产生了使其有效地交叉递呈的环境，并且自噬体富集组合物中存在的其它分子伴侣蛋白可以起到保护这些抗原的作用，促进了交叉递呈的效率。
另外，自噬体富集疫苗可能是靶向免疫应答的有效刺激剂，因为它们递呈多种肿瘤相关抗原。这些抗原也可被唯一地保留在组合物中，因为自噬体还含有蛋白质分子伴侣分子如HSP-90、HSP-70和钙网蛋白(calreticulin)，它们可起到保护抗原的完整性的作用。此外，该自噬体含有损伤相关分子模式(DAMPs)。这些DAMPs存在于坏死细胞和其他地方，并可作为包含在疫苗中的天然佐剂。AAECs中存在的DAMPs可以包括HMGB1、S100蛋白质、DNA和RNA。自噬体富集组合物可含有Toll样受体(TLR)激动剂。这些TLR激动剂刺激先天免疫应答，这对具有降低的免疫功能的患者来说是有利的，所述降低的免疫功能继发于年龄、癌症治疗，或进行性肿瘤生长的效果。
此外，AAECs和自噬体富集组合物通常是与充当佐剂或其他组分的分子共同施用的适当候选物。在一个实施例中，将所述疫苗与IFN-γ和TLR激动剂(已知的用于诱导免疫应答的分子)联合施用于DCs。这种组合显示出诱导针对3LL肺癌和B16F10黑色素瘤的强抗肿瘤反应。非特异性佐剂(如明矾，CpG，GM-CSF，Flt3L或其组合)可以与自噬体富集组合物联合施用。靶向特定的细胞或组织类型的特异性佐剂或治疗剂可以与自噬体富集疫苗联 合施用，以将免疫应答定位于所述细胞或组织群体内。
除了与佐剂或相关化合物共同施用以外，该疫苗可与另外的化合物配制在一起，所述化合物包括具有独立的治疗效用或能够保护AAECs中的化学组分的那些化合物。
治疗过程可包括多轮疫苗接种。每轮疫苗接种可使用各种佐剂或佐剂的组合。这种处理过程可在初始疫苗接种之前确定，或根据患者对疫苗以及伴随的佐剂的反应(如通过分子、细胞或全身测试，成像方法或其他监测患者反应的测试所评估的)而知晓。在一个下述的实施例中，AAECs可用于刺激BDCA3+(血液树突细胞(DC)抗原-3+)单核细胞的产生，其刺激炎症应答。这些单核细胞可被分离，并作为佐剂与随后几轮疫苗接种联合施用。
为了将DRiPs和SLiPs积累到AAECs中，先前已使用万珂或类似的蛋白酶体抑制剂，从而防止DRiPs和SLiPs被蛋白酶体降解。蛋白酶体抑制还增加自噬，但是，本发明人已经确定，这不可能是增加自噬的最有效方式。
本公开的自噬体富集组合物包括多种TLR激动剂和多种肿瘤抗原。蛋白酶体抑制可能在刺激针对感染性疾病的应答所必需的抗原方面限制组合物，并可能在刺激膜蛋白转移所必需的蛋白方面限制该组合物。因此，自噬体富集组合物可以通过与现有技术中已知的富集自噬体而无蛋白酶体抑制的试剂例如NH4CL、氯喹、雷帕霉素或其他自噬刺激剂接触来产生。也可以通过饥饿手段在细胞或组织中诱导自噬。
专职的抗原递呈细胞(pAPC)的抗原交叉递呈是发生针对不是通过pAPC合成的抗原例如肿瘤相关抗原或病毒抗原的适应性免疫应答的第一步，其中pAPC的直接递呈被病毒逃逸机制破坏。在这些实施例中，可用于交叉递呈的抗原来源于死亡或正在死亡的细胞。本发明人在此已经确定了这些抗原的新的自噬辅助抗原交叉递呈途径(AAAXP)。该途径可通过经由在交叉递呈死细胞相关抗原方面高效的树突细胞亚组上的CLEC9A受体特异性识别自噬体来调节抗原交叉提呈的效率。本发明人已经认识到，用肿瘤衍生的自噬体进行疫苗接种，在已建立的鼠肿瘤的多个模型中提供了针对肿瘤挑 战的异源保护和高治疗功效。
AAECs可以仅仅通过小鼠CLEC9A+PDCA-1dim树突细胞(在此称为xDC)交叉递呈，而不是CLEC9A-CD8α+cDC或CLEC9A-PDCA-1hi pDC。基因阵列分析表明，与CD8α-cDC相比，xDC与pDC更紧密相关。另外，在pDC耗尽后或用Batf3缺陷型BM重建后，在嵌合体小鼠的骨髓(BM)中能找到功能性xDC。然而，在用IRF8缺陷型BM重建的嵌合体小鼠中，xDC是缺失的。此外，CLEC9A+CD11c-xDC前体细胞(pre-xDC)可在小鼠的BM和脾中找到，并在吞噬AAECs后，可分化成功能性交叉递呈树突细胞(xDC)。此外，由CLEC9A和BDCA的表达所表征的小鼠xDC和pre-xDC的人类等效物可存在于人PBMC和G-CSF动员的血液中。
实施例1：同种异体自噬体富集组合物和用于产生该组合物的方法
图1描绘了患有各种形式的某些基因上调的癌症的患者的百分比，所述基因是在UbLT3或UbLT6细胞系中上调最多的500个基因中的基因。该数据是来自下面的癌症类型，括号中为患者数：卵巢癌(232名患者)，前列腺癌(85名患者)。乳腺癌(451名患者)，肉瘤(149名患者)。肺鳞癌(178名患者)，结肠癌(193名患者)，胶质母细胞瘤(122名患者)，腺癌(112名患者)，肾乳头癌(75名患者)，子宫癌(232名患者)，神经胶质瘤(144名患者)，肾RCC(389名患者)。如图1所示，万珂&NH4Cl处理后的NSCLC细胞系UbLT3&UbLT6的微阵列分析(各自与正常肺RNA相比)表明，在这些细胞系中上调的许多基因也在癌症基因组图谱(TCGA)数据集中的其它癌症中上调。将上调最显著的前500个基因(SAM Excel)与TCGA中的微阵列数据进行比较(z评分>3)。数据显示，UbLT3和UbLT6处理的肿瘤细胞与具有不同病因学的许多患者的肿瘤共享至少一个共同的基因。值得注意的是，许多患者的癌症与所检查的5万个基因(500 hundred genes)的UbLT3和UbLT6有数百个共同的上调基因，包括患有卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肉瘤、肺鳞状细胞肉瘤和结肠&直肠腺癌的患者。虽然HNSCC的微阵列数据是不可用的，但291名HNSCC患者的RNASeq数据集 表明，在300个所分析的基因中，与UbLT3相比，每个样平均品表达25个共同基因，对于UbLT6来说为29个(数据未示出)。
先前，发明人在文中公开了用于产生和分离AAECs变体(称为DRibbles)的方法(US 2009/0220530)。出于本公开的目的，术语“同种异体自噬体富集组合物”或“AAECs”和“DRibbles”可互换地使用，但应该理解的是AAECs是指Dribbles的特定亚组)。该方法包括使靶细胞与足量的蛋白酶体抑制剂在足以产生AAECs的条件例如基本上抑制细胞内蛋白降解的条件下接触。在某些实施例中，该方法进一步包括使靶细胞在与蛋白酶体抑制剂接触之前、之中或之后，与足量的自噬诱导剂接触。该细胞也可以与一种或多种减少蛋白糖基化的试剂接触。在一个实施例中，该细胞与足量的蛋白酶体抑制剂(如20nM万珂)、自噬诱导剂(如雷帕霉素或HBSS)和NH4Cl在足以刺激细胞产生AAECs的条件下接触。在一个实施例中，通过从细胞中分离所述AAECs来收获在所述条件下生成的AAECs。在一个示例性方法中，细胞可与足量的可包括蛋白酶体抑制剂的组合物在足以基本上抑制细胞内蛋白质降解的条件下接触，例如温育6～24小时。随后可以将所述细胞在足以在细胞中诱导自噬的条件下温育，例如用自噬诱导剂温育6～24小时。在一些实施方式中，可以将具有高基础自噬率的细胞系在足以改变细胞持续的自噬的条件下温育。随后，所得细胞和AAECs可在使细胞成团、同时AAECs保留在溶液中的条件下离心。随后可以将包含AAECs的上清液移除，然后可以在足以使AAECs成团的条件下离心。在其他的实施方式中，所述细胞可被超声处理以刺激自噬体释放。随后将所得环境离心以移除细胞和高密度细胞碎片，因此澄清的上清液将AAECs保留在溶液中。随后可在使AAECs成团的条件下将含AAEC的溶液离心。随后可以洗涤成团的AAECs并将其悬浮在合适的缓冲液中以备后续使用。
图2A是示出了SDS-page凝胶的数字图像，指明NH4Cl的存在保护蛋白GAPDH和EEF1A1以免降解。以这种方式，肽抗原可被保护免于降解并包裹在AAEC中。如图2B所示，与未经处理产生的AAECs相比，用万珂和 NH4Cl处理细胞改变了所得AAECs的蛋白质组成。用万珂和NH4Cl处理增加了泛素化蛋白和短寿抗原的相对含量。例如，通过处理后的细胞产生的AAECs中泛素蛋白对β-肌动蛋白的比率增加。与由未处理细胞产生的AAECs相比，NPM1、p62、p53和生存素都存在更高的对β-肌动蛋白的比率
所述AAECs代表一个有前途的癌症治疗剂，因为它们可含有至少6个国家癌症研究所(NCI)的优先癌抗原。图3A显示了在Affymetrix Human Gene 1.0 ST阵列上完成的用万珂和NH4Cl以及正常肺RNA处理的UbLT3&UbLT6细胞的基因分析。将表达与NCI的顶端癌抗原优先列表进行比较。对每种条件来说，在3个独立的RNA样本上进行基因分析。所有示出的基因的表达的标准差小于5％。图3B表示在Dribbles中通过免疫印迹证实了具有在UbLT3或UbLT6细胞中的基因表达的6种抗原(WT1，p53，生存素(Survivin)，EphA2，细胞周期蛋白B1，和XAGE1)的蛋白表达。图3C示出额外证实了在UbLT3和UbLT6衍生的AAECs中存在NCI优先抗原。抗原包括WT1，EGFRvIII，HER-2/neu，p53，生存素，EphA2，细胞周期蛋白B1，XAGE 1，和PDGFR-β。图3D显示如免疫印迹所证明的，在UbLT3和UbLT6衍生的AAECs中存在四个NSCLC靶。靶蛋白包括PKM2，LDHB，EIF4A1和ENO1。图3E中示于了表明抗原包括在所述UbLT3和UbLT6 AAECs中的汇总表。
此外，DAMPs可以在处理的UbLT3和UbLT6细胞(如通过微阵列数据指明的那样)和AAECs(如通过SDS-PAGE凝胶电泳显示的)中高度表达。DAMPs能够通过非感染性炎症反应来引发并延续免疫反应，本质上向免疫系统发送“危险”信号。图4A-图4B显示了这一数据。图4A显示了在Affymetrix Human Gene 1.0 ST阵列上完成的用万珂和NH4Cl以及正常肺RNA处理的UbLT3&UbLT6细胞的基因分析。将表达与NCI的顶端癌抗原优先列表(Cheever,等人Clin Cancer Res.2009:5323-5337)进行比较。对每种条件来说，在3个独立的RNA样本上进行基因分析。所有示出的基因的 表达的标准差小于5％。图10B表示在AAECs中通过免疫印迹证实的具有在UbLT3或UbLT6细胞中的基因表达的6种抗原(WT1，p53，生存素，EphA2，细胞周期蛋白BL，和XAGE1)的蛋白表达。了6抗原蛋白的表达(WT1，P53，生存素，EphA2的，细胞周期蛋白B1，与XAGE1)，在UbLT3与UbLT6细胞AAECs通过免疫印迹确认基因表达。
使用本文描述的方法处理(例如用蛋白酶体抑制剂和NH4Cl处理)时，UbLT3 AAECs表达高水平的TLR配体和DAMPs。Toll样受体包括一类在细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)表面表达的蛋白质，并且能够识别和结合与细胞应激和/或病原体相关的分子。在结合到TLR激动剂时，所述TLR被激活并引发导致产生炎性细胞因子和/或1型干扰素的信号级联。图5A和图5B示出关于TLR配体在AAECs中表达的数据。在图5A中，使用被转导成表达单个人类TLR的HEK-293细胞(Invitrogen)对UbLT3 AAEC中的TLR-2，TLR-4或TLR-9激动剂的存在和效力进行评估。将效力与阳性和阴性(无配体)对照组进行比较。图5B显示了免疫印迹，其表明DAMPs在3个不同批次的UbLT3 AAEC中的蛋白表达。
此外，AAECs可以包含多个TLR配体。这些TLR配体模拟微生物抗原并刺激先天免疫应答，这在对患者施用AAEC时是有利的。图6表示通过可见光光谱术根据各种TLR配体在HEK-Blue细胞中的活性证实了所述配体的存在。单个人TLR转染的HEK-Blue细胞被用于测定在AAECs(Invitrogen)中的TLR激动剂。UbLT3和UbLT6 AAECs包含用于TLR 2、3、4、7和9的激动剂。加入50ug/ml的AAECs。以105/ml加入全细胞照射的肿瘤。阳性对照是：TLR2(LTA)500ng/ml、TLR3(poly(I:C)、LMW)10μg/ml、TLR4(LPS)500pg/ml、TLR7(CL097)50μg/ml、TLR9(ODN 2006)10μg/ml、NULL1(TNFα1000ng/ml)。.
本文中参考图1-图6描述的数据使下述成为可能：一种或多种组合物和一种或多种用于筛选产生这些组合物的细胞的方法。组合物包括由非小细胞肺癌细胞系衍生的自噬体的富集群，并且其中所述自噬体的富集群包括： 一种或多种Toll样受体激动剂；一种或多种肿瘤抗原；和一种或多种损伤相关分子模式分子。一种或多种Toll样受体激动剂可包括用于Toll样受体2、Toll样受体3、Toll样受体4、Toll样受体7和/或Toll样受体9或其组合的激动剂。一种或多种肿瘤抗原可包括WT1、p53、生存素、EphA2、细胞周期蛋白B1和/或XAGE1或其组合。一种或多种损伤相关分子模式分子可包括钙网蛋白、HMGB1、HSP70、HSP90和/或Grp94或其组合。在一些实施例中，自噬体的富集群可衍生自UbLT3细胞系。在一些实施例中，自噬体的富集群可衍生自UbLT6细胞系。该组合物可进一步包含构造为提高对抗原的免疫应答的分子，包括自噬体的富集群。所述分子可以是聚肌胞苷酸。该组合物可进一步包括非特异性佐剂。
在另一个实施例中，用于筛选能产生同种异体自噬体富集组合物的细胞的方法，所述组合物能在外周血单核细胞亚群上诱导选择性标记的表达，所述方法包括：使细胞与蛋白酶体抑制剂接触；使细胞与溶酶体抑制剂接触；收集所得自噬体；确定所得自噬体的分子特征物；和选择将一种或多种Toll样受体激动剂和/或一种或多种分子伴侣转移到自噬体的细胞。所述选择性标记可以是BDCA3，且所述外周血单核细胞的亚群可包括树突细胞。所述选择性标记可以是CD80，并且所述外周血单核细胞的亚群可包括单核细胞。
实施例2:在人PBMC中诱导表达促炎性BDCA3的单核细胞。
第二个实施例描述了一种方法，所述方法可以利用AAECs在人PBMC和来自淋巴结(LN)的单细胞悬液中诱导表达BDCA3的单核细胞的增加。
表达BDCA3的树突细胞(DCs)在被Toll样受体3(TLR3)刺激时产白生细胞介素-12(IL-12)和干扰素β、它们是已知能增强1型T辅助细胞(TH1)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应的细胞因子。BDCA3+DC对向CD8+细胞交叉递呈也很重要。因为这些活性，BDCA3+DCs对于刺激抗肿瘤免疫应答可能是重要的。
如上所述，所述AAECs可由肿瘤细胞在组合抑制蛋白酶体降解和溶酶体-介导的蛋白水解后产生，并且可以包含多种肿瘤抗原以及DAMPs和TLR 配体。AAECs被鼠CLEC9A+交叉递呈树突细胞有效摄取，并能够引发对既定鼠肿瘤的治疗性免疫。此处，本发明人利用PBMC和来自淋巴结的单细胞悬液描述了AAECs可能具有的对人类骨髓细胞的相互作用和效果。
图7表示AAECs被血液CD14+BDCA3-单核细胞有效摄取的实施例。与AAECs相互作用导致在单核细胞上剂量依赖性诱导血液DC标记物BDCA3。可以通过使用阻断性寡脱氧核苷酸(ODN)进行TLR9阻断来部分地阻断单核细胞上BDCA3的上调。
在临床样品中，接种了GM-CSF和CpG的组合的黑色素瘤患者表现出在他们的肿瘤引流LN中CD14+BDCA3+细胞水平增加。类似于AAECs，用GM-CSF和CpG或单独使用CpG进行体外刺激导致在单核细胞和CD11c+CD14-DC两者上诱导BDCA3。除了血液单核细胞，AAECs还可提高BDCA3在黑色素瘤患者LN单细胞悬液中存在的CD14+CD11c+细胞上的表达。在这些样品中，BDCA3诱导与分泌的IL-8在上清液中的水平增加相关(r＝0.76，P<0.01)。的确，与来自相同培养物的CD14+BDCA3-细胞或分选的介质处理的BDCA3-单核细胞相比，来自PBMC的分选的AAEC诱导的CD14+BDCA3+细胞产生更高水平的IL-8。虽然IL10诱导的CD14+BDCA3+组织DC已被描述为致耐受性的并抑制T细胞响应，本发明人发现AAEC诱导的CD14+BDCA3+单核细胞可以在次优剂量的抗CD3抗体存在下以浓度依赖性方式刺激CD4和CD8 T细胞增殖。CD4和CD8 T细胞在这些共培养物中可产生高水平的Th1细胞因子、IFNγ和TNFα，后者与增殖相关(r＝0.97，P<0.001)，暗示了AAEC-激活的单核细胞可能具有促炎作用。
在存在于LNs中的HLA-DR+CD11c+细胞上BDCA3表达的诱导和增加的IL-8分泌，与培养物中存在的CD14+细胞的频率相关。CD14+细胞是单核细胞，能够分化成多种不同细胞类型。其与诱导BDCA3表达相关的增加的频率暗示了BDCA3表达的促炎反应。图7A～图7C描绘的数据表示对AAEC有特异性的BDCA3的剂量依赖性诱导，且这种诱导与增加CD14+细 胞相关(R2＝0.99，P<0.001)。该相关性表明AAEC可能参与CD14+细胞的上调，这可能有利于诱导免疫应答。将冻存的黑色素瘤LN单细胞悬液解冻，并在x-vivo 15培养基中与未添加(无Ag)，羟乙基淀粉(介质)，6μg或12μg UbLT3 AAEC(DRB)共培养20小时(1百万个细胞/ml，在48孔板中)。图7A和图7B示出用12色流式细胞仪表征的收获的细胞，参见CD11c、CD14、CD1a、HLA-DR、CD11b、CD80、CD86、CD103、BDCA3/CD141和CD83。通过活/死细胞染色排除死细胞，并基于荧光扣除(Fluorescence Minus One)(FMO)对照设定门。图7B显示了CD11b+DR+细胞上的AAEC诱导的BDCA3表达与CD14+细胞的频率之间的Pearson相关性。图7C示出了在相同的实验测定上清液(在收获前除去的)中IL-8的表达。分泌的细胞因子通过细胞因子微球阵列进行评估。
AAECs可诱导BDCA3在CD14+人单核细胞上表达。图8A-图8B描述的实验数据表明BDCA3的表达在CD14+人单核细胞上是增加的。对于该实验，将健康供体的PBMC(100万/ml)与羟乙基淀粉(介质)共培养，并用浓度增加的UbLT3 AAEC或TLR4激动剂MPL(500ng/ml)处理。然后在20小时后将细胞通过流式细胞术进行表型分析。图8A显示来自代表性的供体的直方图。阴影图表示样本-特异性荧光扣除(FMO)对照。开放式图形显示在HLA-DR+CD11c+CD14+单核细胞上的BDCA3-FITC的表达。图8B描绘了代表2个健康供体的3个独立的实验并使用75μgAAEC(DRb)的图。***P<0.0001单向Anova，使用Tukey多重比较检验(Prism)。
TLR-9抑制降低AAEC介导的BDCA3在CD14+单核细胞上的表达，且减少在AAEC接触的PBMC培养物中IL-8的分泌。TLR-9可被特异性ODNs阻断，该受体的阻断抑制TLR-9表达细胞中总的来说导致免疫应答活化的胞内通路的活化。图9A～图9D中显示的实验在人PBMC中进行(2×105个，200μl，在96孔板在)，所述人PBMC在37℃温育20分钟(用或不用TRL2、TRL4或TRL9拮抗剂或对照)后用介质、UbLT3 DRibbles(75μg/ml)进行培养。图9A显示的直方图表明BDCA3表达(开放)和FMO对照(阴影)， 使用了抗TLR抗体的最高浓度(对于T LR2/4来说为7.5μg/ml，对于TLR9来说为13.8μM)。图9B显示两个供体的在抗TLR9抗体和对照ODN滴定后的BDCA3+CD14+细胞％。图9C示出了由CBA测定到的在PBMC AAEC接触培养物+/-TLR拮抗剂中的IL-8的分泌。图9D显示了在各种TLR拮抗剂中温育的PBMC对AAEC的摄取。将UbLT3 AAECs用0.5μΜ远红外脂质染料装载(3分钟RT)后，然后洗涤并与用TLR拮抗剂预温育的2×105个PBMC共培养2小时。在4℃下用UbLT3 AAEC培养的PBMC作为主动摄取的对照(N＝1，一式两份)。
图9E表明UbLT3衍生的AAECs添加到来自3个供体的PBMC增加能表达CD80(与这些抗原递呈细胞的成熟有关的共刺激分子)的单核细胞的百分比。这种效果可以通过阻断经由TLR9的信号转导来抑制，但不是通过添加TLR9的模拟抑制剂来抑制。
图10示出了响应于对来自四个健康供体的PBMC的CD14+单核细胞的各种处理而发生的BDCA3+细胞的诱导。实验在PBMC(500万/ml，48-孔板，IMDM+10％FBS)中进行，所述PBMC在无刺激(无stim)、5μg/ml CpG-A(ODN-2216)、5μg/ml CpG-B(ODN-7909)或CpG-+1000IU/ml GM-CSF(CpG+GM)的条件下培养48小时。CD14+单核细胞上的BDCA3+表达由四色流式细胞仪(VUmc)评估。
AAEC接触的单核细胞，BDCA3-和BDCA3+两者，产生高水平的IL-8，并与次优抗CD3抗体刺激组合而刺激T细胞增殖。T细胞增殖的刺激被用作免疫应答诱导的指示。CD4在AAEC存在下的增殖增加是有益的，因为该组合物可以施用于患者以刺激对靶向癌抗原、感染或其他疾病(其中靶向免疫应答是有益的)的免疫应答。图11A-图11B示出的数据指示IL-8上调和T细胞增殖。对于这些实验来说，将两个健康供体的PBMC与介质或75μg/ml UbLT3 AAEC共培养20小时。CD4+CD25-和CD8+T细胞和CD14+(BDCA3-)单核细胞从介质处理的样本中分选。CD14+BDCA3-和CD14+BDCA3+细胞从AAEC-处理的样本中分选。将从供体1分选的CD14+细胞与从供体2 分选的T细胞共培养，反之亦然。图11A示出了来自在RPMI+10％FBS中培养过夜的5000个分选的CD14+细胞的IL-8的浓度。在20小时(每个样品一式三份)后收集上清液(2个实验得到相似的结果)。图11B显示了在分选的介质或AAEC-处理的CD14+的存在下用2μg板结合的OKT3(抗CD3抗体)刺激的CD4T细胞的增殖。在图11C中，第3天和第5天时TNF-α的浓度与CD4的增殖相关。
据发现，UbLT3 AAECs可以诱导在人黑色素瘤LN样本中的CD11c+HLA-DR+细胞上表达BDCA3。诱导的水平与这些样本中CD14+细胞的存在相关。与LN样本类似，AAECs诱导在健康供者的单核细胞上表达BDCA3。TLR4激动剂MPL不诱导在人单核细胞上表达BDCA3，这暗示了TRL4非依赖性机制。据发现，UbiLT3 AAECs可以高水平地表达配体，刺激各种TLRs。TLR2、TLR4或TLR9活化的抑制表明TLR9在AAEC诱导的BDCA3诱导中的贡献(在2个供体中观察到的)。有趣的是，用CpG或CpG+GM-CSF皮内注射治疗的黑色素瘤患者在其前哨(sentinel)LNs中表现出BDCA3+DC亚组的频率增加(Sluijter等人，论文准备中)。用CpG或CpG+GM-CSF体外刺激PBMC诱导CD14+单核细胞上的BDCA3表达，证实了TLR9刺激与单核细胞上BDCA3表达之间的联系。除了BDCA3诱导，AAECs可诱导在黑色素瘤LN与健康供体的PBMC培养物中产生IL-8。在2/2PBMC供体中，TLR9的抑制减少IL-8的产生，而在1/2供体(1个实验)中TLR4抑制降低IL-8水平。分选的AAEC诱导的BDCA3+细胞产生比对照单核细胞显著更高水平的IL-8(2个实验，各两个供体)。与未处理的单核细胞相比，从AAEC-处理的PBMC中分选出的BDCA3+和BDCA3-单核细胞可刺激CD4+T细胞增殖(+OKT3)和IFN-γ的产生(未示出)。另外，AAEC诱导的BDCA3+单核细胞刺激CD8 T细胞增殖(未示出)和TNF-α产生。这些数据表明，AAECs可诱导人单核细胞中的促炎性变化。
图12A示出的图证实AAECs用于检测治疗后某些患者的抗癌免疫应答的治疗性免疫监测用途，并记录肿瘤引流淋巴结包含由癌症引发的并且可 以使用AAECs检测到的细胞。从癌症患者中分离的PBMC被分离并用在实验中测定响应于AAECs治疗而产生的IFN-γ。IFN-γ的产生增加可有利于用癌症疫苗治疗，因为IFN-γ是重要的免疫功能增强剂。IFN-γ刺激自然杀伤(NK)细胞的活性，增加了抗原递呈，并导致对激活免疫应答而言非常重要的大量转录改变。患有HNSCC、黑色素瘤和前列腺癌的患者在用由NSCLC细胞衍生的AAECs刺激时产生IFN-γ。图12A示出了从来自患有HNSCC(n＝4)、黑色素瘤(n＝4)或前列腺癌(n＝4)的患者的PBMC或(淋巴结)LNs直接离体产生的IFN-γ。以5xl06/ml将细胞重新悬浮于含有5％人白蛋白的完全培养基，并暴露于UbLT3或UbLT6 AAECs 36-40小时。上清液通过细胞因子珠阵列(BD Bioscience公司)进行分析。基于基因阵列的数据，来自肾细胞癌患者的AAECs被用作阴性对照。对来自2个健康供体的PBMC进行了测试，两者对于IFN-γ的产生来说都为阴性。免疫印迹检测出AAECs不包括MHC I类分子。这些结果表明，AAECs可用于鉴定抗癌免疫应答的发生，并可以用作抗癌免疫的生物标记。
在一些实施方式中，AAEC可衍生自NSCLC。然而，AAEC可以衍生自任何数量或种类的癌细胞或非癌细胞。这可包括来自于以下的细胞系：乳腺癌如BRCA-152，MDA-MB-231，MDA-MB-361，或MDA-MB-468；结肠癌，如HCT 116或T84；淋巴瘤，如EL4；黑色素瘤，如MEL-30，MEL-68，和/或MEL-40，等等。此外，AAECs可以衍生自同基因组织，包括通过本文描述的方法衍生自患者的肿瘤。如上所述，衍生和施用AAECs的方法不一定仅适用于癌症疫苗，并且可适用于可发包含细菌、真菌、病毒或原生动物的抗原的自噬体富集的组合物。
图12B显示的测定证明了在接种后发展出免疫应答的患者可用AAECs进行检测。这种测定描述了用于评估针对广泛未知的由许多癌症共享的癌抗原的免疫应答的方法。在一些实施例中，该测定可用于对血液中的抗癌免疫应答进行评估或评分。
图12C还示出了在接种疫苗的患者中的免疫应答可以用AAECs来检 测。来自正常肾的AAECs是非刺激性的。
图12D是一个直方图，展示针对pp65的免疫应答的特异性并且在具有针对CMV的免疫的患者中不与不含pp65构建体的UbLT3 AAECs交叉反应。AAECs被用来检测在接种后发展出免疫应答的患者中的免疫应答。来自正常肾的AAECs是非刺激性的。检测到针对UbiLT3(LT3.pp65DRb)Dribbles(AAECs)中的pp65但不针对UbLT3 AAECs(LT3DRb)或正常肾AAECs(NK DRB)的免疫应答。
来自上述实验的数据表明，BDCA3表达单核细胞可在患者分离的PBMC以及LNs中被诱导。如上所述，这些细胞可具有促炎性应答，这有利于在临床环境下施用同种异体自噬体富集组合物。对这些细胞和细胞因子的存在的促炎性应答可有助于恢复患者的免疫系统，所述患者具有因年龄或之前的抗癌治疗而降低的免疫功能。此外，此促炎性应答暗示了能够靶向特定癌症或感染因子的先天免疫应答的快速扩张。该应答可在AAECs体内施用(经皮内，皮下，静脉内，或鼻腔内途径)之后发生。此外，因为其可能的促炎活性，BDCA3+DCs可以从患者衍生的PBMC分离并用作疫苗接种的佐剂。
本文中参考图7～图12描述的数据使下述成为可能：一种或多种用于诱导免疫应答的方法。在一个实施例中，在哺乳动物中诱导特异性免疫应答的方法，包括：提供组合物，所述组合物包括：从细胞系衍生的自噬体的富集群，所述自噬体的富集群包含：一种或多种Toll样受体激动剂；一种或多种肿瘤抗原；和一种或多种损伤相关分子模式分子。
该方法可以进一步包括：从所述哺乳动物的外周血中分离外周血单核细胞；使外周血单核细胞的亚群与自噬体的富集群接触；和将接触的外周血单核细胞注入回哺乳动物。外周血单核细胞的亚群可包括专职的抗原递呈细胞和非专职的抗原递呈细胞。所述外周血单核细胞可以在施用GM-CSF、FLT3L和/或CpG后从哺乳动物分离。该细胞系已被工程化以表达CD80。该细胞系可能已经被工程化以表达巨细胞病毒蛋白pp65。该方法还可以包括通 过检测对一种或多种肿瘤抗原特异性的一种或多种细胞因子的分泌来筛选对包括在所述自噬体的富集群中的一种或多种肿瘤抗原的特异性免疫应答的诱导。特异性免疫应答的诱导的筛选可包括ELISA、ELISPOT和/或细胞内染色测定。
实施例3：用非小细胞肺癌细胞系衍生的AAEC治疗其他癌症。
在另一实施例中，类似于上面在实施例1中描述的方法利用细胞系衍生的同种异体自噬体富集组合物作为其他癌症的可能的治疗，因为疫苗可以包含许多已知的癌抗原以及免疫刺激因子。
如本文所述，肿瘤衍生的AAECs可螯合蛋白质的复杂混合物，包括相关的癌抗原和DAMPs。在临床前研究中，使用良好定义的MCA肉瘤模型(其中独有的主要肿瘤抗原的特异性仅针对同源肿瘤挑战提供保护)表明，AAECs可提供对同基因肿瘤的交叉保护，而完整的肿瘤细胞疫苗不能(Twitty等人，Clin Cancer Res.2011:6467-6481)。此外，不同于AAECs可从中衍生的完整肿瘤，AAECs即使是从同种异体肿瘤细胞衍生时，也可提供对既定鼠乳腺肿瘤的治疗免疫。这就提出了单一NSCLC肿瘤细胞系可用作用于各类NSCLC组织学和其他可能的癌症类型的疫苗的可能性。本发明人已从两个NSCLC肿瘤细胞系UbLT3和UbLT6中制造出用于I期和II期临床试验的AAECs。尽管它们的基因表达图谱不同(19935个基因中有8213个基因在这两种细胞系之间差异表达)，本发明人描述了UbLT3和UbLT6具有在其他类型的癌症中发现的共有的上调基因。
将用硼替佐米和NH4Cl(对Dribble疫苗的产生很重要的两种蛋白降解抑制剂)处理之前和之后的UbLT3和UbLT6肿瘤细胞的微阵列分析与正常肺组织比较。与癌症基因组图谱(TCGA)的数据集的比较显示，许多在疫苗细胞系中上调的基因在其他癌症中也上调(图8)。此外，免疫印迹分析表明，在国家癌症研究所(NCI)的优先癌抗原列表(Cheever等人Clin Cancer Res.2009:5323-5337)上的至少六种癌抗原可被包含在AAECs中(图3A～图3E)。虽然几种癌症的TCGA数据显示UbLT3和UbLT6(HNSCC)具有相 似的上调基因谱，其他在基因表达上很少有共同的变化。因此，NSCLC衍生的AAECs可作为患有其他癌症的患者的很好的疫苗。除了表达相关癌抗原以外，微阵列数据表明几个DAMPS被上调(图4A)。免疫印迹表明，包括钙网蛋白、HMGB1、HSP70、HSP90和GRP94的DAMPs都存在于UbLT3和UbLT6 DRibble疫苗中(图4B)。
在小鼠中已经表明，AAECs可提供对同基因MCA肉瘤组的交叉保护作用，而辐照的完整细胞疫苗是无效的，这打破了50年的范例。此外，当与完整细胞疫苗相比时，AAEC也可以在同种异体乳腺肿瘤模型中提供保护。有证据支持使用AAECs来治疗多种癌症在临床结果方面以及减轻许多目前可用的癌症治疗剂的一些副作用方面是有益的。为了支持这样的目标，已经利用人细胞系进行了实验。NSCLC肿瘤细胞系UbLT3和UbLT6，与许多其他癌症类型具有共同的过表达的基因。这些细胞系UbLT3和UbLT6过表达NCI顶端癌抗原表上列出的基因和编码许多DAMPs的基因。利用本文所公开的这些细胞系和方法，可创造出自噬体富集的疫苗。从UbLT3和UbLT6衍生的AAECs可表达NCI顶端癌抗原表上列出的至少6种肿瘤抗原和至少5种DAMPs，并刺激5种TLR受体。所得AAECs可刺激从来自患有头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、黑色素瘤和前列腺癌的患者的淋巴结(LN)的单细胞悬液或PBMC细胞产生IFN-γ，这表明NSCLC AAECs可在多种癌症中刺激IFN-γ应答，并代表对患有这些和其他类型癌症的患者的有前途的治疗剂。
为了测试AAEC在5-9种建立的肿瘤模型中的治疗潜力，在3种不同的H2背景(H2B、H2D和H2Q)中以十字交叉实验设计使用3个乳腺肿瘤细胞系来测试AAEC的治疗潜力。辐照的“同种异体”或“同基因”肿瘤的全细胞疫苗接种不能在BALB/c、FVB/n或C57BL/6小鼠中提供分别针对5、9或7天建立的4T1、FAT或C57MG肿瘤的显著治疗功效(来自9个独立实验的数据)。与此相反，用同基因自噬体富集的组合物或两种同种异体自噬体富集的组合物之一进行免疫治疗可在研究的所有组合中提供治疗效果(P <0.05，n＝15-65/组)。图13表示来自这项研究的数据，其中的白框＝无保护，“X”未完成，阴影框＝显著保护。这些数据强烈支持以下设想：包括同种异体自噬体富集组合物的免疫治疗可提供针对不同癌症组的治疗影响。具体而言，它支持使用这种策略来对抗人类癌症，其中有强有力的证据表明抗癌免疫应答的缺失与不良结果有关(Friedman等人,Nature Reviews Cancer 2012)。
实施例4：自噬体富集组合物在膜蛋白转移方面是有效的。
在另一实施例中，本发明人已经表明自噬体富集组合物在膜蛋白转移(类似于被称为“胞啃(trogocytosis)”的细胞现象)方面可能是有效的。胞啃是其中受体细胞从供体细胞获得表面分子和质膜的片段的过程。本发明人还发现，由UbLT3和UbLT6细胞系表达的跨膜蛋白可以以利用衍生自这些细胞系的AAECs的胞啃样过程而被有效地转移到淋巴细胞和单核细胞中。例如，AAECs可以从MDA-CD80、UbLT3-CD80和/或HEK293细胞通过上述方法制备得到。当这些MDA-CD80、UbLT3-CD80或HEK293衍生的AAECs(可表达CD80或其他表面标记)与肿瘤细胞或PBMC混合时，可发生膜蛋白转移。图14A-图14I表明膜蛋白(在该情形中为CD-80)的转移。另外，图14A、图14D和图14H表明与不含有AAECs的治疗相比，AAECs可更容易地诱导CD-80的转移。通过流式细胞术检测到CD80转移到CD80阴性白细胞的质膜。图15A-图15E表明了这种转移可能对AAECs是特异性的，并且在仅存在外来体的条件下效率较低。此外，图16A-图16I显示，在MDA-CD80 AAEC中表达的大多数CD80对应自噬体特异性标记物LC3的表达。
图17A概述了一些结果，显示出CD-80可从AAECs转移到PBMCS。尽管转移到CD4+细胞和单核细胞是最有效的，但CD80也可以比对照实验显著更有效地转移到CD8+细胞和B细胞。此外，图17B表明通过AAECs进行的分子转移不是MDA-CD80肿瘤细胞系独有的，也不是对CD80表达特异性的分子转移。将HEK-293细胞瞬时转染以表达CD80或CD40L。然后用 得到的基因工程化的细胞如本文所述地产生AAECs。如图17所示，HEK-293-CD80 AAECs和HEK-293-CD40L AAECs都能够将表达的分子有效地转移到相关的PBMCs。
该数据表明，AAECs在膜蛋白转移方面是有效的。这可代表AAECs可用于使免疫调节分子在受体细胞上表达的现象，允许在组合物接受者中诱导膜蛋白表达，而不需要基因治疗或完整细胞疗法。此外，数据表明，该胞啃样现象涉及来自自噬体富集组合物中包含的自噬体的蛋白质，且可能暗示自噬体富集组合物除了在释放细胞因子、抗原或DAMPs方面的作用外，还可能在刺激免疫应答中发挥作用。此外，该数据表明，细胞可以被遗传工程化以使得能够生产有效的AAEC。这继而可以使靶向特定癌症或感染性疾病的潜在AAECs有更广泛的基础。如本文实施例中所示，包括CD80的AAECs可将CD80转移到专职和非专职APC两者，这进一步提高其引发并提高抗癌免疫性的能力。除了CD80以外，其他分子如CD86、CD40、CD40L和其他适当的分子也可以被工程化到AAECs中，用于转移到抗原递呈细胞。
自噬体富集的组合物通过多元性可诱导针对目标疾病的免疫应答，这种多元性使得这些组合物适合于治疗比癌症更广泛的疾病。自噬体富集的组合物可用于治疗病毒、原生动物或细菌感染，例如猪生殖呼吸合胞病毒(PRRSV)和疟疾。此外，这些自噬体富集的组合物除了疫苗接种之外还可具有其他效用。发明人描述的数据表明自噬体富集组合物能够将被包含在自噬体中的膜蛋白胞啃到其他细胞上。可以利用此性质将膜蛋白例如特异性细胞标记插入到肿瘤细胞或其它细胞上，以进一步靶向特定的细胞。
由于其他细胞系可用于生产AAECs，可对衍生的疫苗进行如以上所述类似的基因和蛋白质组分析。所述分析可确定每个疫苗批的概况，并且所述概况可以与已知的肿瘤细胞系的概况(例如，如图7中所示的UbLT3和UbLT6)进行比较，以确定每个疫苗批可对应哪些类型的肿瘤。这些不同的疫苗批可以由癌细胞系衍生，并响应于原生动物、病毒或细菌感染。
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