一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VSUT及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102851281 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851281 A *CN102851281A* (21)申请号 201210353691.4 (22)申请日 2012.09.20 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人江苏大学地址 212013 江苏省镇江市学府路 301 号 (72)发明人何华纲朱姗颖别同德霍金金李晶晶 (74)专利代理机构南京知识律师事务所 32207 代理人卢亚丽 (54) 发明名称一个簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT 及其用。

2、途 (57) 摘要本发明公开了一个特异追踪簇毛麦 6VS 染色体的分子标记 6VS-UT 及其用法，它涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域。本发明根据可电子定位于短柄草 3 号染色体短臂的小麦 EST 序列 BE445603 设计引物，从簇毛麦与普通小麦基因组中扩增并克隆对应的 DNA，在测序的基础上进一步设计特异性分子标记引物，具体序列为 SEQIDNO.5 和 SEQIDNO.6 所示，以标记引物进行 PCR 时能扩增出一条 301bp 的特异性 DNA 条带，能快速有效地追踪簇毛麦 6VS 染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，在小麦抗白粉病分子标记辅助选择育。

3、种中具有较强的实用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页序列表 4 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页序列表 4 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一个簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT，其特征在于：该分子标记引物的具体序列为： 6VS-UTF ： 5 -GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA-3 ， 6VS-UTR ： 5 -AGAACAGATACACCTCCACTGACCA-3 。 2. 权利要求 1 所述的簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标。

4、记 6VS-UT 在追踪小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位染色体中的用途。 3.一种用权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS-UT追踪小麦-簇毛麦T6AL.6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出301bp 条带的材料，为含有小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位染色体的材料。权利要求书 CN 102851281 A 2 1/4 页 3 一个簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT 及其用途技术领域 0001 本发明涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域，具体涉及一个特异追踪簇毛麦 6VS 染色体的分子标记及。

5、其用法。背景技术 0002 小麦是全球三大粮食作物之一，也是我国总产第一的粮食作物，是保障我国粮食安全的重要决定因素之一。小麦在其生育进程中常会受到生物或非生物胁迫的影响。小麦白粉病是一种世界性小麦病害，近年来随着我国农田水利设施改善和水肥条件提高，其危害逐年加重。通过远缘杂交和染色体工程技术手段育成的小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位系对目前已发现的白粉病生理小种均表现高抗或免疫，其抗白粉病基因 Pm21 位于簇毛麦 6V 染色体短臂上（6VS），是目前对小麦白粉病抗谱最广、抗性最强的基因（见参考文献： Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhan。

6、g SZ,Liu DJ.Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew.Theor Appl Genet,1995,91(6-7):1125-1128）。近年来 T6AL.6VS 易位系在小麦抗白粉病新品种选育中得到广泛利用，目前已育成 20 多个抗白粉病小麦新品种，推广面积超过 5000 万亩。 0003 T6AL.6VS 易位系是在普通小麦遗传背景。

7、中由簇毛麦 6V 染色体短臂（6VS）替换了普通小麦 6A 染色体的短臂（6AS），从而形成 T6AL.6VS 易位染色体。由于簇毛麦与普通小麦亲缘关系较远，导致二者不发生染色体重组， T6AL.6VS 易位染色体始终以易位的形式出现在后代中。目前，未发现利用 T6AL.6VS 易位系培育的新品种或新品系中出现染色体易位形式的改变。因此，簇毛麦 6VS 控制的性状及其载有的 DNA 序列均以协同传递的方式出现在后代中。 0004 目前，部分研究已公布了部分与 6VS 上抗白粉病基因 Pm21 连锁的相关分子标记 OPT171400、 OPT171900、 SCAR1。

8、400、 SCAR1265、 NAU/XiBao15902和 NAU/XiBao161586。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中都存在不稳定的缺点，一个原因是由标记类型决定的，如 RAPD 标记 OPT171400和 OPT171900；其次是由于标记序列过长（大多接近或超过 1000bp）、 PCR 反应体系和反应条件要求苛刻， PCR 结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在小麦育种实践中的应用。 0005 EST（expressed sequence tag, 表达序列标签）是指从植物不同组织来源的 cDNA 文库中随机挑选克隆，对其 5和。

9、3端进行测序获得的短 cDNA 序列。EST-STS （sequence-tagged site,STS）标记是直接依据已经定位于基因组物理图上的EST序列设计引物，对基因组或者 cDNA 进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的 EST 标记。由于 EST-STS 标记直接来源于表达基因序列，保守性较高，特别有利于界定物种之间的差异。因此，基于比较基因组学原理，利用与小麦亲缘关系较近的短柄草的基因组序列信息，可以开发普通小麦亲缘物种簇毛麦特定染色体的特异性 EST-STS 分子标记。 0006 本发明就是基于上述思想指导下，利用比较基因组学原理，根据可。

10、电子定位于短说明书 CN 102851281 A 3 2/4 页 4 柄草 3 号染色体短臂的小麦族作物 EST 序列设计以 PCR 技术为基础的 EST-STS 标记，筛选簇毛麦 6V 染色体短臂（6VS）特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中 T6AL.6VS 易位染色体及其控制的抗白粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。发明内容 0007 本发明的目的是提供一种特异追踪簇毛麦 6VS 染色体的分子标记及其用法，它利用比较基因组学原理，根据可电子定位于短柄草 3 号染色体短臂的小麦 EST 序列，设计以。

11、PCR技术为基础的EST-STS标记引物。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率有限，所用亲本材料的 PCR 扩增产物虽然实际长度不同，但在电泳过程中却显示出相似的迁移率。对此，本发明对PCR产物进行克隆和测序，进而重新设计特异性引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，为抗白粉病小麦-簇毛麦T6AL.6VS易位系在小麦抗白粉病新品种培育中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。 0008 为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：根据可电子定位于短柄草 3 号染色体短臂的小麦 EST 序列 BE445603 设计引物，从簇毛麦及普通小麦。

12、基因组中扩增对应的DNA片段，经克隆和测序后，针对DNA片段中长度差异较大的区域进一步设计标记引物，该标记引物扩增出的一段 301bp 的 DNA 条带位于簇毛麦 6VS 染色体，可以特异地追踪 6VS 染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记引物序列为： 0009 6VS-UTF ： 5 -GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA-3 （SEQ ID NO.5）， 0010 6VS-UTR ： 5 -AGAACAGATACACCTCCACTGACCA-3 （SEQ ID NO.6）。 0011 本发明还公开了所述的簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT 。

13、在追踪小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位染色体中的用途。 0012 用所述的簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT 追踪小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行 PCR 扩增，扩增出 301bp 条带的材料，为含有小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位染色体的材料。 0013 本发明所述分子标记的具体用法为： 0014 （1） PCR 反应体系： 10L 反应体系中含约 10 20ng 模板 DNA， 1PCRbuffer， 1.5mmol L-1MgCl2， 200mmol L-1dNTP，两条引物终浓度各为 0。

14、.2mol L-1， 0.5UTaq DNA 聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至 10L ； 0015 （2） PCR 反应程序： 94预变性 3 分钟； 94变性 20 秒， 60退火 30 秒， 72延伸 30 秒， 32 个循环； 72延伸 5 分钟； 4保存； 0016 （3） PCR 产物检测： PCR 扩增产物经 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。 0017 本发明在利用 T6AL.6VS 易位系为亲本进行抗白粉病性状的追踪时，凡是扩增出 301bp 条带的材料，都含有小麦 - 簇毛麦 T6AL.6VS 易位染色体，并对白粉病表现高抗；。

15、凡是不能扩增出 301bp 条带的材料，都不具有 T6AL.6VS 易位染色体，相应丢失由 6VS 染色体控制的白粉病抗性。 0018 本发明具有以下有益效果： 0019 1、本发明的分子标记6VS-UT在鉴定簇毛麦6VS染色体时特异性强：已开发的分子说明书 CN 102851281 A 4 3/4 页 5 标记 OPT171400和 OPT171900都非 6VS 特异性标记，只有在亲本间存在与 6VS 的多态性时，才可以利用，而使用 6VS-UT 时，无论涉及何种亲本，只要出现 301bp 条带，就可以确定材料中含有 6VS 染色体。 0020 2、。

16、本发明的 6VS 染色体特异性 EST-STS 标记相较 SCAR 标记更易于识别 PCR 扩增失败导致的 “假阴性” ：本发明的标记为共显性标记，在普通小麦遗传背景中，无论是否具有T6AL.6VS易位染色体，都可以扩增出两条背景条带，可用于判断PCR扩增是否成功，排除 “假阴性” 。 0021 3、本发明的分子标记稳定性好，容易为育种实践利用：本发明的标记由于目标条带较短，仅 301bp， PCR 扩增时对 DNA 模板质量的要求不高，在部分降解的 DNA 模板中仍能有效扩增出目标产物，且目标产物呈现为强带，易于判断，有利于提高标记辅助选择的效率。附。

17、图说明 0022 图1 ：序列比对结果。 UT-HV ：簇毛麦中的序列； UT-TA ：普通小麦中的序列。箭头所示为重新设计的引物位置。 0023 图 2 ： M ： DNA marker DL2000 ； 1 ：簇毛麦； 2 ：普通小麦； 3 ：小麦 - 簇毛麦易位系 T6AL.6VS ； R ：分离群体中的抗病材料； S ：分离群体中的感病材料。箭头所示为 301bp 的特异性条带。具体实施方式 0024 本发明具体实施方式采用以下技术方案：根据可电子定位于短柄草 3 号染色体短臂的小麦 EST 序列 BE445603 设计引物，从簇毛麦及普通小麦基。

18、因组中扩增对应的 DNA 片段，经克隆和测序后，针对 DNA 片段中长度差异较大的区域进一步设计标记引物，该标记引物扩增出的一段 301bp 的 DNA 条带，该条带位于簇毛麦 6VS 染色体，可以特异地追踪 6VS 染色体及其控制的抗小麦白粉病性状。 0025 实施例： 0026 1、引物的设计 0027 选择短柄草 3 号染色体短臂上的保守基因，在 NCBI 或 Graingenes 数据库中进行 BLAST 分析，检索到小麦 EST 序列 BE445603，用 Primer Premier 5.0 软件设计引物，引物序列为： 0028 UT-P1 ： 5 。

19、-CCAAATGAAGCGTATTGTGCTTG-3 （SEQ ID NO.1）， 0029 UT-P2 ： 5 -GTAGATGGTCTGATCAAATTCTTCTGGT-3 （SEQ ID NO.2）。 0030 2、簇毛麦 6VS 染色体特异性 EST-STS 标记的筛选 0031 （1） PCR 扩增：以簇毛麦、普通小麦、小麦 - 簇毛麦易位系 T6AL.6VS 为材料（均为公知公用种质材料，由南京农业大学细胞遗传研究所提供），提取基因组 DNA 后进行 PCR 扩增， 10L PCR反应体系中含约1020ng模板DNA， 1PCRbuffer， 1.5mmol。

20、 L-1MgCl2， 200mmol L-1dNTP，两条引物终浓度各为0.2molL-1， 0.5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至 10L ； PCR 反应程序为： 94预变性 3 分钟； 94变性 20 秒， 60退火 30 秒， 72 延伸 30 秒， 32 个循环； 72延伸 5 分钟； 4保存。 0032 （2） PCR 产物的检测： PCR 扩增产物在 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶（29:1）上进行电说明书 CN 102851281 A 5 4/4 页 6 泳分离，采用银染法染色。 0033 （3） PCR 产物的克隆与测序：由于簇。

21、毛麦、普通小麦的 PCR 产物具有相似的迁移率，所以回收各自的 PCR 产物后，分别与 pMD18-T（TAKARA 公司）连接，经转化大肠杆菌感受态细胞后，筛选出阳性克隆进行测序。簇毛麦的 PCR 产物为 917bp（SEQ ID NO.3），普通小麦的 PCR 产物为 901bp（SEQ ID NO.4）。对两条序列进行比对分析，进而重新设计一对引物（见图 1）： 0034 6VS-UTF ： 5 -CCAGGAGGGCCTCCAGGA-3 （SEQ ID NO.5）， 0035 6VS-UTR ： 5 -CTGGGAGCTCCTGCTGCGT-3 （SEQ 。

22、ID NO.6）。 0036 （4）多态性标记的确定：以重新设计的引物，按上述方法进行 PCR 及电泳检测，筛选到一个簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT，以该标记引物进行 PCR 扩增，能在普通小麦中扩增到两个背景条带，在簇毛麦中扩增到一条 301bp 的 DNA 条带，而在小麦 - 簇毛麦易位系 T6AL.6VS 中，既能扩增到两个背景条带，也能扩增到一条 301bp 条带（见图 2 中 13），表明 301bp 条带可定位于簇毛麦 6VS 染色体，因此，分子标记 6VS-UT 能在小麦背景中特异性追踪簇毛麦 6VS 染色体。 003。

23、7 3、簇毛麦 6VS 染色体特异性标记 6VS-UT 在分子标记辅助选择育种中的应用 0038 利用筛选到的簇毛麦 6VS 染色体特异性标记引物 6VS-UT，对宁麦 9 号（公知公用，由江苏省农业科学院培育）与抗白粉病 T6AL.6VS 易位系（公知公用，由南京农业大学细胞遗传研究所创制并提供）杂交组合的分离群体进行鉴定，结合白粉病抗性鉴定，结果显示在所有供试材料中，凡具有 301bp 条带的材料，都表现高抗白粉病；凡缺失 301bp 条带的材料都表现高感白粉病（见图 2 中 R 或 S）。该结果表明，本发明开发的 EST-STS 标记 6VS-UT。

24、能有效追踪小麦背景中的簇毛麦 6VS 染色体，在分子标记辅助选择育种中具有潜在的应用价值。说明书 CN 102851281 A 6 1/4 页 7 SEQUENCE LISTING 江苏大学一个簇毛麦 6VS 染色体特异的分子标记 6VS-UT 及其用途 6 PatentIn version 3.3 1 23 DNA 人工序列 1 ccaaatgaag cgtattgtgc ttg 23 2 28 DNA 人工序列 2 gtagatggtc tgatcaaatt cttctggt 28 3 917 DNA 簇毛麦（Haynaldia villosa） 3 ccaaatgaag。

25、 cgtattgtgc ttggattttg gaccctgaga agtggggagg tgagtttcag 60 序列表 CN 102851281 A 7 2/4 页 8 cgctatgatt catgtgcagc aataccgatg ccgaaactac ttagtttgaa gtgttcctgt 120 acaattttgt ttgaagactg gtagcgatgc agtcatatca tgtctcagaa tttgcattag 180 acatgctctt tgccccaaga gaaaaacatt aaatcgggac cttatcctaa gagaattgcc 240 。

26、aggactcaag aacttggtat tcctcgttaa gcatctctac cataaaacta taagcgaact 300 gcaaaaacat cttatattta tttacggagg tagtagtaat tatttcatat gttctgttat 360 tcttgtggtg caaagcaacc acttgcaaca tgacattagc actccaattg gtcagtggag 420 gtgtatctgt tctacatctg ttacaggcat aaacattaat tttcatataa gtttttcttt 480 gatggcagtt ttcatcata。

27、t gtcagtgtgt gctgctgctt agttcattaa ttcacttttt 540 tcgttgtaaa ggtgccatag aactttcaat tctgtcagaa tattatgggc gtgaaattgc 600 tgcatatgac atccagacaa cacgatgtga tctgtatggt caggtcggta cctctatatg 660 tttacttctg tttgttcaga atcttttgcc agttcttagc tttacatcca ctgatacagg 720 ggaagaacta caacgagagg gcaatgctca tttatga。

28、tgg gttgcattac gatgctttag 780 cagtaagttt ttgtgatagt aacccactat tgaaaacgat acaatgcggc attaactaat 840 tttatctgtt tttatcaaca aaaattcaga tgtctccagc tgaaggggca ccagaagaat 900 ttgatcagac catctac 917 4 901 DNA 普通小麦（Triticum aestivum） 4 ccaaatgaag cgtattgtgc ttggattatg gaccctgaga agtggggagg tgagtttcag 60 序。

29、列表 CN 102851281 A 8 3/4 页 9 tgctatgatt catgtgcagc aatatcgatg ctgaaactac ttagtttgaa atgctcctgt 120 acaattttgt ttgaagactg gtagcgatgc agtcatatca tgtcccagaa tttgcattag 180 acatcctcct tgccccaaga gaaaaacata atatcgggat cttatcctaa gaaaattgcc 240 atgacacaag aactcagtat tcctcgttag gcatctctac cataaaacta taagc。

30、ctcca 300 ttagtaatat actactacct ctgtaattag ttcatgtgtt ctgttgttct tgtggtgcaa 360 agcaaccact tgtaacatga cgcactccag ttggtcagtg gaggtgtatc tgttctacat 420 ctgttacagg cataaacact aattttcata taagtttttg tttgatggcg gttttcatca 480 tatgtcagtg tgtgctgctg cttagttcac taattcactt cttttcattg taaaggtgcc 540 atagaacttt。

31、 caattctgtc agaatattat gggcgtgaaa ttgctgcata tgacatccag 600 acaacacgat gtgatctgta tggtcaggtc ggtggctcta tatgtttact tctgtttgtt 660 cagaatcttt tgctagttct tacctttaca tccactgata caggggaaga actacaatga 720 gagggcaatg ctcatttatg atgggttgca ttacgatgct ttagcagtaa gtttttgtga 780 tagcaaccca ctattgaaaa cgacacaa。

32、tg cggtattaac taattttatc tgtttttatc 840 aacaaaaatt cagatgtctc cagctgaagg ggcaccagaa gaatttgatc agaccatcta 900 c 901 5 23 DNA 人工序列 5 gaagactggt agcgatgcag tca 23 序列表 CN 102851281 A 9 4/4 页 10 6 25 DNA 人工序列 6 agaacagata cacctccact gacca 25 序列表 CN 102851281 A 10 1/2 页 11 图 1 说明书附图 CN 102851281 A 11 2/2 页 12 图 2 说明书附图 CN 102851281 A 12 。

摘要
申请专利号：	CN201210353691.4	申请日：	2012.09.20
公开号：	CN102851281A	公开日：	2013.01.02
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/11申请公布日:20130102\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/11申请日:20120920\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/11; C12Q1/68	主分类号：	C12N15/11
申请人：	江苏大学
发明人：	何华纲; 朱姗颖; 别同德; 霍金金; 李晶晶
地址：	212013 江苏省镇江市学府路301号
优先权：
专利代理机构：	南京知识律师事务所 32207	代理人：	卢亚丽
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内容摘要

本发明公开了一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记6VS-UT及其用法，它涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域。本发明根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列BE445603设计引物，从簇毛麦与普通小麦基因组中扩增并克隆对应的DNA，在测序的基础上进一步设计特异性分子标记引物，具体序列为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，以标记引物进行PCR时能扩增出一条301bp的特异性DNA条带，能快速有效地追踪簇毛麦6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，在小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种中具有较强的实用价值。

权利要求书

权利要求书一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT，其特征在于：该分子标记引物的具体序列为：
6VS‑UTF：5’‑GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA‑3’，
6VS‑UTR：5’‑AGAACAGATACACCTCCACTGACCA‑3’。
权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT在追踪小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色体中的用途。
一种用权利要求1所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT追踪小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出301bp条带的材料，为含有小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色体的材料。

说明书

说明书一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域，具体涉及一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法。
背景技术
小麦是全球三大粮食作物之一，也是我国总产第一的粮食作物，是保障我国粮食安全的重要决定因素之一。小麦在其生育进程中常会受到生物或非生物胁迫的影响。小麦白粉病是一种世界性小麦病害，近年来随着我国农田水利设施改善和水肥条件提高，其危害逐年加重。通过远缘杂交和染色体工程技术手段育成的小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位系对目前已发现的白粉病生理小种均表现高抗或免疫，其抗白粉病基因Pm21位于簇毛麦6V染色体短臂上（6VS），是目前对小麦白粉病抗谱最广、抗性最强的基因（见参考文献：Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhang SZ,Liu DJ.Development and molecular cytogenetic analysis of wheat‑Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew.Theor Appl Genet,1995,91(6‑7):1125‑1128）。近年来T6AL.6VS易位系在小麦抗白粉病新品种选育中得到广泛利用，目前已育成20多个抗白粉病小麦新品种，推广面积超过5000万亩。
T6AL.6VS易位系是在普通小麦遗传背景中由簇毛麦6V染色体短臂（6VS）替换了普通小麦6A染色体的短臂（6AS），从而形成T6AL.6VS易位染色体。由于簇毛麦与普通小麦亲缘关系较远，导致二者不发生染色体重组，T6AL.6VS易位染色体始终以易位的形式出现在后代中。目前，未发现利用T6AL.6VS易位系培育的新品种或新品系中出现染色体易位形式的改变。因此，簇毛麦6VS控制的性状及其载有的DNA序列均以协同传递的方式出现在后代中。
目前，部分研究已公布了部分与6VS上抗白粉病基因Pm21连锁的相关分子标记OPT171400、OPT171900、SCAR1400、SCAR1265、NAU/XiBao15902和NAU/XiBao161586。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中都存在不稳定的缺点，一个原因是由标记类型决定的，如RAPD标记OPT171400和OPT171900；其次是由于标记序列过长（大多接近或超过1000bp）、PCR反应体系和反应条件要求苛刻，PCR结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在小麦育种实践中的应用。
EST（expressed sequence tag,表达序列标签）是指从植物不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆，对其5’和3’端进行测序获得的短cDNA序列。EST‑STS（sequence‑tagged site,STS）标记是直接依据已经定位于基因组物理图上的EST序列设计引物，对基因组或者cDNA进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的EST标记。由于EST‑STS标记直接来源于表达基因序列，保守性较高，特别有利于界定物种之间的差异。因此，基于比较基因组学原理，利用与小麦亲缘关系较近的短柄草的基因组序列信息，可以开发普通小麦亲缘物种簇毛麦特定染色体的特异性EST‑STS分子标记。
本发明就是基于上述思想指导下，利用比较基因组学原理，根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦族作物EST序列设计以PCR技术为基础的EST‑STS标记，筛选簇毛麦6V染色体短臂（6VS）特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中T6AL.6VS易位染色体及其控制的抗白粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，它利用比较基因组学原理，根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列，设计以PCR技术为基础的EST‑STS标记引物。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率有限，所用亲本材料的PCR扩增产物虽然实际长度不同，但在电泳过程中却显示出相似的迁移率。对此，本发明对PCR产物进行克隆和测序，进而重新设计特异性引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，为抗白粉病小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位系在小麦抗白粉病新品种培育中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列BE445603设计引物，从簇毛麦及普通小麦基因组中扩增对应的DNA片段，经克隆和测序后，针对DNA片段中长度差异较大的区域进一步设计标记引物，该标记引物扩增出的一段301bp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记引物序列为：
6VS‑UTF：5’‑GAAGACTGGTAGCGATGCAGTCA‑3’（SEQ ID NO.5），
6VS‑UTR：5’‑AGAACAGATACACCTCCACTGACCA‑3’（SEQ ID NO.6）。
本发明还公开了所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT在追踪小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色体中的用途。
用所述的簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT追踪小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色的方法，是用该分子标记引物对待测材料进行PCR扩增，扩增出301bp条带的材料，为含有小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色体的材料。
本发明所述分子标记的具体用法为：
（1）PCR反应体系：10μL反应体系中含约10～20ng模板DNA，1×PCRbuffer，1.5mmol L‑1MgCl2，200mmol L‑1dNTP，两条引物终浓度各为0.2μmol L‑1，0.5UTaq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL；
（2）PCR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存；
（3）PCR产物检测：PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。
本发明在利用T6AL.6VS易位系为亲本进行抗白粉病性状的追踪时，凡是扩增出301bp条带的材料，都含有小麦‑簇毛麦T6AL.6VS易位染色体，并对白粉病表现高抗；凡是不能扩增出301bp条带的材料，都不具有T6AL.6VS易位染色体，相应丢失由6VS染色体控制的白粉病抗性。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的分子标记6VS‑UT在鉴定簇毛麦6VS染色体时特异性强：已开发的分子标记OPT171400和OPT171900都非6VS特异性标记，只有在亲本间存在与6VS的多态性时，才可以利用，而使用6VS‑UT时，无论涉及何种亲本，只要出现301bp条带，就可以确定材料中含有6VS染色体。
2、本发明的6VS染色体特异性EST‑STS标记相较SCAR标记更易于识别PCR扩增失败导致的“假阴性”：本发明的标记为共显性标记，在普通小麦遗传背景中，无论是否具有T6AL.6VS易位染色体，都可以扩增出两条背景条带，可用于判断PCR扩增是否成功，排除“假阴性”。
3、本发明的分子标记稳定性好，容易为育种实践利用：本发明的标记由于目标条带较短，仅301bp，PCR扩增时对DNA模板质量的要求不高，在部分降解的DNA模板中仍能有效扩增出目标产物，且目标产物呈现为强带，易于判断，有利于提高标记辅助选择的效率。
附图说明
图1：序列比对结果。UT‑HV：簇毛麦中的序列；UT‑TA：普通小麦中的序列。箭头所示为重新设计的引物位置。
图2：M：DNA marker DL2000；1：簇毛麦；2：普通小麦；3：小麦‑簇毛麦易位系T6AL.6VS；R：分离群体中的抗病材料；S：分离群体中的感病材料。箭头所示为301bp的特异性条带。
具体实施方式
本发明具体实施方式采用以下技术方案：根据可电子定位于短柄草3号染色体短臂的小麦EST序列BE445603设计引物，从簇毛麦及普通小麦基因组中扩增对应的DNA片段，经克隆和测序后，针对DNA片段中长度差异较大的区域进一步设计标记引物，该标记引物扩增出的一段301bp的DNA条带，该条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状。
实施例：
1、引物的设计
选择短柄草3号染色体短臂上的保守基因，在NCBI或Graingenes数据库中进行BLAST分析，检索到小麦EST序列BE445603，用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列为：
UT‑P1：5’‑CCAAATGAAGCGTATTGTGCTTG‑3’（SEQ ID NO.1），
UT‑P2：5’‑GTAGATGGTCTGATCAAATTCTTCTGGT‑3’（SEQ ID NO.2）。
2、簇毛麦6VS染色体特异性EST‑STS标记的筛选
（1）PCR扩增：以簇毛麦、普通小麦、小麦‑簇毛麦易位系T6AL.6VS为材料（均为公知公用种质材料，由南京农业大学细胞遗传研究所提供），提取基因组DNA后进行PCR扩增，10μL PCR反应体系中含约10～20ng模板DNA，1×PCRbuffer，1.5mmol L‑1MgCl2，200mmol L‑1dNTP，两条引物终浓度各为0.2μmolL‑1，0.5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10μL；PCR反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸5分钟；4℃保存。
（2）PCR产物的检测：PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29:1）上进行电泳分离，采用银染法染色。
（3）PCR产物的克隆与测序：由于簇毛麦、普通小麦的PCR产物具有相似的迁移率，所以回收各自的PCR产物后，分别与pMD18‑T（TAKARA公司）连接，经转化大肠杆菌感受态细胞后，筛选出阳性克隆进行测序。簇毛麦的PCR产物为917bp（SEQ ID NO.3），普通小麦的PCR产物为901bp（SEQ ID NO.4）。对两条序列进行比对分析，进而重新设计一对引物（见图1）：
6VS‑UTF：5’‑CCAGGAGGGCCTCCAGGA‑3’（SEQ ID NO.5），
6VS‑UTR：5’‑CTGGGAGCTCCTGCTGCGT‑3’（SEQ ID NO.6）。
（4）多态性标记的确定：以重新设计的引物，按上述方法进行PCR及电泳检测，筛选到一个簇毛麦6VS染色体特异的分子标记6VS‑UT，以该标记引物进行PCR扩增，能在普通小麦中扩增到两个背景条带，在簇毛麦中扩增到一条301bp的DNA条带，而在小麦‑簇毛麦易位系T6AL.6VS中，既能扩增到两个背景条带，也能扩增到一条301bp条带（见图2中1~3），表明301bp条带可定位于簇毛麦6VS染色体，因此，分子标记6VS‑UT能在小麦背景中特异性追踪簇毛麦6VS染色体。
3、簇毛麦6VS染色体特异性标记6VS‑UT在分子标记辅助选择育种中的应用
利用筛选到的簇毛麦6VS染色体特异性标记引物6VS‑UT，对宁麦9号（公知公用，由江苏省农业科学院培育）与抗白粉病T6AL.6VS易位系（公知公用，由南京农业大学细胞遗传研究所创制并提供）杂交组合的分离群体进行鉴定，结合白粉病抗性鉴定，结果显示在所有供试材料中，凡具有301bp条带的材料，都表现高抗白粉病；凡缺失301bp条带的材料都表现高感白粉病（见图2中R或S）。该结果表明，本发明开发的EST‑STS标记6VS‑UT能有效追踪小麦背景中的簇毛麦6VS染色体，在分子标记辅助选择育种中具有潜在的应用价值。