一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102851239 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851239 A *CN102851239A* (21)申请号 201210300863.1 (22)申请日 2012.08.22 CGMCC No.6129 2012.05.22 C12N 1/20(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (71)申请人 黄河三角洲京博化工研究院有限公 司 地址 256500 山东省滨州市博兴县经济开发 区 申请人 山东京博控股股份有限公司 (72)发明人 徐泽平 马韵升 史庆苓 杨传伦 张心青 王。

2、秀芝 虞凤慧 高洪奎 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 苗峻 (54) 发明名称 一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳 寡糖的方法 (57) 摘要 本发明属于生物工程技术领域， 提供了一 株壳聚糖酶高产菌株及利用该菌株进行液固 发酵制备高活性壳聚糖酶和利用该酶生产壳 寡糖的方法。本发明所涉及的壳聚糖酶生产 菌 株， 经 16SrDNA 鉴 定 为 一 株 蜡 状 芽 孢 杆 菌 （Bacilluscereus） ， 菌 株 代 码 为 JBSH-003，中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 的保藏号为 CGMCCNo.6129。可应用于生产壳寡 。

3、糖， 获得含量较高， 分子量范围 1500Dalton 2500Dalton， 且分子量范围相对集中的壳寡糖。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 一株壳聚糖酶生产菌株， 其保藏号为 CGMCC No.6129。 2. 根据权利要求 1 所述的壳聚糖酶高产菌株， 其特征在于 ： 蜡状芽孢杆菌， Bacillus cereus， 菌株代码为 JBSH-003， 该菌株的 16S 核糖体 DNA 即 16。

4、S rDNA 的基因序列如 Seq ID No:1 所示。 3. 利用如权利要求 1 所述菌株， 生产壳寡糖的方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： （1） 壳聚糖酶粗酶的制备 ： A. 菌种活化 ； B. 液体种子制备 ； C. 产酶发酵 ： 菌种活化后， 经液体发酵扩繁种子液， 再利用固体发酵方法生产得到壳 聚糖酶粗酶 ； D. 干燥粉碎 ： 将上述固体发酵的湿固酶进行低温真空干燥、 粉碎， 得高活性壳聚糖酶 制剂 ； （2） 对壳聚糖水解生产壳寡糖 ： 取壳聚糖， 用0.2M的醋酸溶液配制成含重量分数为6%-10%的壳聚糖的溶液， 用酸调节 溶液的pH至4.5-6.5， 溶胀充分后， 。

5、于45-65水浴中保温30min， 准备完毕后按照壳聚糖用 量的 0.02%-5.0%（w/w） ， 添加上述步骤 （1） 制备的固体壳聚糖粗酶， 开始计时， 反应 90min 后开始用氢氧化钠滴定法取样检测， 直到反应液刚好不产生沉淀， 用碱溶液调节反应液 pH 值至 7.0-8.0， 加热煮沸 10min 灭酶活， 终止反应， 即可得壳寡糖溶液。 4. 根据权利要求 3 所述生产方法， 其特征在于 ： 所获得的壳寡糖溶液冷却后， 用高速管 式离心机离心， 去除絮凝物， 即得澄清透明的壳寡糖溶液 ； 对壳寡糖溶液直接喷雾干燥， 或 用 600Dalton 的纳滤膜纳滤浓缩后喷雾干燥， 即得固。

6、体壳寡糖粉末。 5. 根据权利要求 3 所述生产方法， 其特征在于 ： 所述的配制壳聚糖溶液的壳聚糖， 其脱 乙酰度在66%以上 ； 所用调节壳聚糖pH至4.5-6.5的物质为醋酸、 盐酸、 苹果酸中的一种或 几种混合物 ； 所用调节反应液pH值至7.0-8.0的碱溶液选自氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠中 的一种或几种混合物的水溶液。 6. 根据权利要求 4 所述生产方法， 其特征在于 ： 所述的离心速度为 4000-16000r/min。 7. 根据权利要求 3 所述生产方法， 其特征在于 ： 所述的壳聚糖粗酶， 还可以采用液体发 酵的壳聚糖粗酶， 具体制备方法如下 ： 经液体发酵放大生产的。

7、发酵液， 经离心除杂、 微滤除菌、 纳滤膜超滤浓缩得浓缩液。 权 利 要 求 书 CN 102851239 A 2 1/7 页 3 一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 提供了一株产壳聚糖酶的微生物菌株， 特别是涉 及一株蜡状芽胞杆菌， 及利用该菌生产壳聚糖酶和利用该酶生产壳寡糖的方法。 背景技术 0002 壳寡糖是壳聚糖的低分子化产物， 多指聚合度在 2 12 之间、 平均分子量在 3003000Dalton之间的低分子量壳聚糖。 因壳寡糖具有比壳聚糖更大的生物学应用价值 而日益成为国内外学者研究的热点。目前， 壳聚糖低分子化的方。

8、式主要有三种， 物理法 （主 要指超声波法） 、 化学法 （主要有化学合成法和化学降解法） 以及生物酶法。近 20 年来， 生物 酶法制备壳寡糖得到了长足的发展， 因其成本低廉， 环境污染小， 被认为是最有潜力的壳寡 糖制备技术。 0003 生物酶法制备壳寡糖的关键点之一就是寻找到产酶活性高、 发酵周期短、 酸碱耐 受范围较广的专一性壳聚糖酶， 因此， 从自然界筛选高活性壳聚糖酶菌株成为研究人员的 重要任务之一。 近年来， 我国科学家在此领域取得了丰硕的成果， 一大批新型菌株不断被发 现。 专利CN 1884477A公开了一株腐皮镰孢菌突变株CGMCC No.1720， 该菌发酵产酶周期为 4。

9、4-50 小时， 壳聚糖酶活为 240mU/mL， 在酶解底物为 2% 的情况下需要 5-8 小时的酶解时间。 专利 CN101148646A 公开了一株枯草芽孢杆菌， 该菌株为诱导性壳聚糖酶产生菌， 液体深层 发酵所得壳聚糖酶平均酶活 518U/mL， 在底物浓度为 5%， 酶 - 底物比为 1:10 条件下需要的 酶解时间为 4-6 小时。上述两类壳聚糖酶制剂均为液体酶， 虽然应用方便， 但不利于保存和 运输， 在一定程度上限制了该酶的应用。中国专利 CN 101397752A 中采用基因工程手段， 构建壳聚糖酶高效表达菌株， 其壳聚糖酶表达载体为大肠杆菌， 发酵液折合酶活力为 350U/。

10、 ml， 该表达体系所产壳聚糖酶为胞内酶， 菌体细胞破碎工艺比较复杂， 影响了生产成本的降 低。但采用基因工程菌发酵产酶是今后酶制剂发展的一个方向。 0004 以上几个文献所报道的菌株， 所产壳聚糖酶的活力远高于其他文献报道的菌株， 但是仍存在种种缺陷和不足， 主要表现在从酶制剂生产利用的角度看， 其酶活性依然较低、 生产成本偏高， 且液体酶制剂不利于保存和运输等， 没有从根本上降低壳寡糖生产成本， 限 制了其大规模应用。 发明内容 0005 本发明针对上述技术存在的不足， 提供一种利用蜡状芽胞杆菌 Bacillus cereus， 通过液体发酵或固体发酵生产非诱导性壳聚糖酶的方法， 利用该方。

11、法生产的壳聚糖酶为胞 外酶， 且酶活较之现有壳聚糖酶， 提高了数倍， 所采用的菌株代码为 JBSH-003， 中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.6129。 0006 本发明提供的一株壳聚糖酶高产菌株， 其保藏号为 CGMCC No.6129 ； 0007 其来源如下 ： 0008 壳聚糖酶高产菌株 Bacillus cereus JBSH-003 的获得 ： 说 明 书 CN 102851239 A 3 2/7 页 4 0009 （1） 从黄河三角洲地区的腐败落叶及浅表层土壤中分离出 37 株能水解壳聚糖胶 体平板产生透明圈的菌落， 并分别进行分离纯化 。

12、； 0010 （2） 从 37 株产生水解圈的菌落中选出 9 株水解圈比较大的菌株 ； 0011 （3） 对 9 株待选菌进行比较深入的生理生化特性、 遗传稳定性、 产酶速率等研究， 最终筛选出一株产酶能力强、 易于培养并具有稳定的传代特性的菌株， 将其初步命名为 RH 09。 0012 （4） 以该菌株为出发菌株， 经 UV、 化学诱变剂反复多次诱变， 复筛， 最终获得了高产 菌株 JBSH-003。 0013 菌株 Bacillus cereus JBSH-003 的形态特征 ： 革兰氏染色阳性， 杆状， 菌体大， 两 端钝圆， 呈短链杆状排列， 无荚膜。培养 6h 后可形成小于菌体的圆形。

13、芽胞。 0014 该菌株在普通营养琼脂上形成圆形凸起的菌落， 表面粗糙有蜡光， 不透明， 似毛玻 璃。BAP 上菌落周围形成 溶血环。在卵黄琼脂平板上菌落周围形成乳白色混浊环。 0015 菌株 Bacillus cereus JBSH-003 的生理生化反应如下 ： 0016 碳水化合物试验 ： 该菌能分解葡萄糖、 麦芽糖、 糊精、 蔗糖、 水杨苷， 能利用柠檬酸 盐， 产酸不产气， 不分解乳糖、 木糖、 甘露醇， 不产生吲哚， VP 试验阳性 ； 含氮化合物试验 ： 醋 酸铅明胶培养基上， 该菌H2S阴性， 能液化明胶 ； 乳光反应 ： 10卵黄琼脂平板上， 培养3h无 菌落生长， 但在点种。

14、处可出现混浊环， 6h 后混浊环直径可扩大至 5 6mm ； 触酶试验阳性。 0017 菌株 Bacillus cereus JBSH-003 的上述生化反应， 与蜡状芽胞杆菌 （Bacillus cereus） 的生化反应一致， 所不同的是， 明胶穿刺反应中液化明胶的速度稍快， 乳光反应中， 所产生的混浊环较上述要大， 说明有较强的产酶能力。 据此， 可初步确定筛选所得菌株为蜡 状芽胞杆菌。 0018 发明人对其进行了 16S rDNA 测序， 其序列如 Seq ID No:1 所示， 该序列为菌株 JBSH-003 的 16S rDNA 的全序列。 0019 所测得的 16S rDNA 序。

15、列进行 BLSTN 比对， 比对结果显示， 菌株 Bacillus cereus JBSH-003 的 16S rDNA 的核苷酸序列与芽孢杆菌属 （Bacillus sp.） 不同菌株的核苷酸序列 有大于 99% 的同源性， 与其中明确标记为蜡状芽孢杆菌 （Bacillus cereus） 的 5 株菌株有 100% 的同源性， 进一步确定为一株蜡状芽孢杆菌。 0020 本发明所获得的菌株， 可以应用于日常的生产当中， 特别是可以应用于生产高活 性的壳聚糖酶， 具体步骤如下 ： 0021 A. 菌种活化 ； 0022 B. 液体种子制备 ； 0023 C. 产酶发酵 ： 菌种活化后， 经液体。

16、发酵扩繁种子液， 再利用固体发酵方法生产得 到壳聚糖酶粗酶 ； 0024 或经液体发酵扩繁种子液， 再经液体发酵放大生产的发酵液， 经离心除杂、 微滤除 菌、 纳滤膜超滤浓缩得浓缩液 ； 0025 D. 干燥粉碎 ： 将上述固体发酵的湿固酶进行低温真空干燥、 粉碎， 得高活性壳聚 糖酶制剂 ； 上述通过液体发酵制备的酶浓缩液， 通过喷雾干燥方式进行干燥 ； 0026 其中上述步骤 C 制备的发酵液浓缩液， 和制备的固体粗酶， 均可直接用于壳聚糖 水解制备壳寡糖。 说 明 书 CN 102851239 A 4 3/7 页 5 0027 其中的壳聚糖酶生产的具体步骤是 ： 0028 （1） 菌种活。

17、化 ： 将 4条件下保存在营养琼脂培养基上的 CGMCC No.6129 试管斜面 菌种移至室温条件下 （20 -25） 活化 4h-8h ； 0029 （2） 液体种子制备 ： 在无菌操作台上， 用 10mL 灭菌后的蒸馏水将经过活化的 CGMCC No.6129 试管斜面菌种制成菌体悬浮液， 冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中， 1 只试管 菌种接种 1 个三角瓶， 振荡培养 12-18h 制备种子液 ； 0030 （3） 发酵产酶 ： 取制备好的液体种子以 5%-10%（v/w） 的接种量接种于灭菌的固体 培养基中， 固体发酵制备壳聚糖酶 ； 0031 （4） 干燥粉碎 ： 将发酵完成的。

18、固体基质在低于 60的温度下烘干， 粉碎后过 80 目 筛， 测定酶活， 分装即得壳聚糖酶粗酶产品。 0032 菌株 CGMCC No.6129 产酶条件的确定， 其方法如下 ： 0033 （1） 采用单因子试验和正交试验， 通过改变温度、 初始 pH 值、 接种量、 装料量和培 养时间， 确定液体种子最佳培养条件和固体发酵最佳产酶条件 ； 0034 （2） 采用单因子试验和正交试验， 通过改变培养的碳氮源和无机盐组成确定该菌 株液体种子最佳培养基组成和固体发酵的最佳产酶培养基组成。 0035 经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株CGMCC No.6129液体种子培养基组成 及发酵条件如下 。

19、： 0036 液体种子培养基组成， 按重量份计为 ： 13份牛肉膏， 0.51份酵母粉， 12份 葡萄糖， 0.5-1 份硫酸铵， 3 5 份豆粕， 2 3 份玉米粉， 85-92 份软化水 ； 0037 液体种子培养条件 ： 接种量为每个三角瓶接种 1 只 CGMCC No.6129 菌株斜面培养 物， pH 值自然， 培养温度 33 35， 摇床转速 75-150r/min， 培养时间为 12h 18h ； 0038 经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株CGMCC No.6129固体发酵培养基组成 和产酶条件如下 ： 0039 固体培养基组成， 按重量份计为 ： 65 80 份麸皮， 1。

20、0 20 份豆粕， 8 15 份玉米 粉， 1 3 份硫酸铵， 固体物料与水的重量比为 1:1.05 1.5 ； 0040 固体发酵条件 ： 接种量为 5%-10% （v/w） ， pH 值自然， 培养温度为 33 35， 发酵 时间 40h 50h， 中间每隔 15h 翻曲一次。 0041 固体发酵结束以后， 将含有壳聚糖酶的发酵湿料于低于 60的条件下真空干燥， 粉碎并过 80 目筛， 即得壳聚糖酶粗品。 0042 菌株 CGMCC No.6129 所产生的壳聚糖酶酶活采用 DNS 法检测， 具体方法如下 ： 0043 准确称取 0.1g 壳聚糖酶粉末于试管中， 加 10mL 去离子水震荡。

21、 10min， 于 50水浴 中保温 10min。准确量取上述壳聚糖酶液 1mL， 加入含 5mL 1% 的壳聚糖溶液的试管中， 50 下保温 30min， 用 NaOH 溶液调节 pH 值到 8， 离心去除沉淀。吸取上清液 1mL， 加入 9mL 2M/ mL 的盐酸， 100水解 2h， DNS 法测定其还原糖含量， 计算得到酶活。以每分钟内产生相当 于 1mol 还原糖所需要的酶量为一个酶活单位 U。 0044 在温度 55 -60， pH 值为 5.0， 底物浓度 4%， 酶用量 5%（相对于底物， w/w） 条件 下， 对连续生产的 8 批壳聚糖酶进行测定的结果， 其平均酶活为 23。

22、57U/g， 最高为 2732U/g。 0045 利用上述过程制备的壳聚糖酶， 可以对壳聚糖进行降解， 并获得壳寡糖 （又称氨基 寡糖素、 低聚壳聚糖） 。 说 明 书 CN 102851239 A 5 4/7 页 6 0046 本发明所得壳聚糖酶用于以脱乙酰度高于 66% 的壳聚糖为原料进行壳寡糖的生 产。具体步骤如下 ： 0047 取壳聚糖， 用 0.2M 的醋酸溶液配制成含 6%-10%（w/v） 的壳聚糖的溶液， 用醋酸调 节溶液的 pH 至 4.5-6.5， 溶胀充分后， 于 45 -65水浴中保温 30min， 准备完毕后按照壳 聚糖用量的 0.02%-5.0%（w/w） 添加上述。

23、步骤 （1） 制备的固体壳聚糖粗酶或者 0.05%-5.0% （v/w） 的比例添加液体发酵的壳聚糖粗酶， 开始计时， 反应 90min 左右开始用氢氧化钠滴定 法取样检测， 直到反应液刚好不产生沉淀， 用碱溶液调节反应液 pH 值至 7.0-8.0， 加热煮沸 10min 灭酶活， 终止反应， 即可得壳寡糖溶液， 上述的反应一般需要 1.5h 2.5h， 为了加快 反应可采用搅拌的方式。对上述完成水解并灭酶的壳寡糖溶液冷却， 用高速管式离心机于 4000r/min-16000r/min 转速下离心， 去除絮凝物， 即得澄清透明的壳寡糖溶液 ； 对壳寡糖 溶液直接喷雾干燥， 或用 600Dal。

24、ton 的纳滤膜纳滤浓缩后喷雾干燥， 即得固体壳寡糖粉末。 0048 上述澄清透明的壳寡糖溶液， 其壳寡糖含量为 5-8.5% （w/v） ， 纳滤浓缩喷雾干燥得 到的固体壳寡糖粉末， 其壳寡糖含量为 92.5-98.5%（w/w） ； 0049 在上述壳聚糖的水解过程中， 采用固体发酵粗酶粉， 即可达到高效降解壳聚糖的 目的， 所制备的壳寡糖平均分子量为 300-5000Dalton， 更优化的结果为所制备的壳寡糖平 均分子量为 1500 2500Dalton。 0050 上述壳聚糖的水解过程中， 也可使用液体粗酶或含有粗酶的发酵液， 若使用粗酶 提取液或含有粗酶的发酵液， 则按照壳聚糖用量。

25、的 0.05%-5.0%（v/w） 添加液体酶制剂。 0051 该酶作用的温度范围为 30-65， 最佳温度为 55。该酶发挥作用的最适 pH 值为 5.5， 但是 pH 值在 4.5 6.5 之间壳对壳聚糖酶活的影响不大。 0052 酶用量和酶解时间的选择 ： 酶的用量越大反应时间越短。前述条件下， 酶用量为 0.05%时， 酶解时间为20.5h， 酶用量为0.3%时， 酶解时间为4.8h， 酶用量为1.0%时， 酶解时 间仅为 1.3h。酶在升温灭活过程中酶解反应仍然继续。生产过程中， 升温灭酶的过程大约 需要 0.5h， 如果反应速率过高， 反应过程不易控制， 所以反应时间最好控制在 2。

26、-3h， 既节约 反应能耗， 又便于控制反应过程。因此， 酶用量以 0.5% 左右较为适宜。 0053 上述的制备反应中， 所述的配制壳聚糖溶液的壳聚糖， 其脱乙酰度在 66% 以上 ； 所 用调节壳聚糖pH至4.5-6.5的物质为乙酸、 盐酸、 苹果酸中的一种或几种混合物。 所述的碱 溶液可以是氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠中的一种或几种混合物， 所述的离心速度为 4000r/ min-16000r/min。 0054 利用上述方法生产壳聚糖酶， 并进一步生产壳寡糖， 产物中基本不含单糖还原糖， 目标产物壳寡糖的平均分子量在1500Dalton左右， 聚合度相对集中， 5-8糖的含量居多。 。

27、许 多研究表明， 5-8 糖的壳寡糖具有较高的生物学活性， 免疫调节活性明显， 对植物的抗性诱 导能力也较强。除此之外， 0055 （1） 菌株 CGMCC No.6129 所产壳聚糖酶是壳聚糖的专一性内切酶， 且主要为胞外 酶， 有利于后期对酶制剂产品的进一步分离和纯化 ； 0056 （2） 菌株CGMCC No.6129产壳聚糖酶的产酶特性为非诱导性产酶， 通过液体发酵或 固体发酵产酶时， 发酵培养基中无需添加壳聚糖等产酶诱导因子进行诱导 ； 0057 （3） 利用该菌株固体发酵所产壳聚糖酶活性高达 2732U/g， 高于目前国内文献报道 的其他菌株。 该菌株的应用可大大缩短酶解工序的反应。

28、时间， 提高了生产效率， 客观上节约 说 明 书 CN 102851239 A 6 5/7 页 7 了生产成本 ； 0058 （4） 该菌株所产壳聚糖酶具有较宽的温度和 pH 值适应范围， 有利于酶活在不同条 件下有效发挥作用， 在温度 30 60之间， pH 值 4.5-6.5 之间都具有较高的酶活， 这一特 性尤其有利于该酶的工业化应用。 0059 （5） 该菌株易于培养， 固体发酵培养基组成成分简单、 廉价易得， 产酶条件不苛刻， 50条件下干燥前后， 酶活基本没有损失， 因而酶的制取成本较低。 0060 （6） 利用固体发酵CGMCC No.6129菌株生产固体壳聚糖酶对壳聚糖进行水解。

29、， 无需 进行产物分离和纯化， 固体发酵物直接干燥粉碎过筛后即可直接用于壳聚糖的水解， 且对 壳寡糖的水解效果和后期分离无较大的影响， 进一步降低了工艺复杂性和生产成本。 0061 保藏信息 0062 保藏时间 ： 2012 年 5 月 22 日 0063 保藏单位名称 ： 中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心 0064 保藏编号 ： CGMCC No.6129 0065 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院中科院微生物研究所 0066 分类命名 : 蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 具体实施方式 0067 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容做进。

30、一步的详细说 明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。 0068 实施例 1 0069 液体种子培养 0070 种子培养基组成 （w/w） 为 ： 牛肉膏 2%， 酵母粉 0.5%， 葡萄糖 2%， 硫酸铵 0.5%， 豆粕 3%， 玉米粉 3%， 余量为水 ； 初始 pH 值自然 ； 121， 0.15Mpa 灭菌 20min. 0071 种子培养条件 ： 无菌条件下， 用 10mL 灭菌后的蒸馏水将经过活化的 CGMCC No.6129试管斜面菌种冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中， 1只试管菌种接种1个三角 瓶， 。

31、培养温度 33 35， 摇床转速 150r/min， 培养时间为 12 18h ； 0072 实施例 2 0073 固体发酵培养 0074 固体发酵培养基组成 （w/w） ： 70% 麸皮， 15% 豆粕， 13% 玉米粉， 2% 硫酸铵 ； 料水比为 1:1.1 ； 初始 pH 值自然 ； 培养温度为 33， 发酵时间 48h ； 每隔 15h 翻曲一次。 0075 发酵完成后， 55烘干、 粉碎， 过 80 目筛， 即为壳聚糖酶粗酶。抽样并 DNS 法检测 酶活， 平均酶活 2547U/g。 0076 实施例 3 0077 固体发酵培养 0078 固体发酵培养基组成 （w/w） ： 80%。

32、 麸皮， 10% 豆粕， 7% 玉米粉， 3% 硫酸铵 ； 料水比为 1:1.15 ； 初始 pH 值自然 ； 培养温度为 33 35， 发酵时间 48h ； 每隔 15h 翻曲一次。 0079 发酵完成后， 50烘干并粉碎， 过筛， 即得到壳聚糖酶粗酶， 抽样并检测壳聚糖酶 活， 平均酶活 2732U/g。 说 明 书 CN 102851239 A 7 6/7 页 8 0080 实施例 4 ： 0081 酶用量的确定 0082 取壳聚糖 100g（脱乙酰度为 95.7%） ， 用醋酸溶液配制成 1L 10% 的壳聚糖溶液， 添 加适量 HAc 调节溶液的 pH 值为 5.0， 溶胀充分后， 。

33、于 55水浴中保温 30min。按表 1 所示的 比例添加固体壳聚糖酶 （酶用量为壳聚糖用量的百分比， W/W） ， 开始计时， 反应 60min 左右 开始， 用氢氧化钠滴定法取样检测 （每5min取样一次） ， 直到不再产生沉淀时为反应终点， 加 热煮沸 10min 灭酶。重复此实验 3 次， 记录反应终点所需的时间。结果见表 1。 0083 表 1 壳聚糖酶用量对酶解时间的影响 0084 0085 由表 1 可见， 酶的用量越大反应时间越短， 但是酶升温灭活过程中酶解反应仍然 继续。 生产过程中， 升温灭酶的过程大约需要0.5h， 如果反应速率过高， 反应过程不易控制， 所以反应时间最好。

34、控制在 2-3h， 既节约反应能耗， 又便于控制反应过程。因此， 酶用量以 0.5% 左右较为适宜。 0086 实施例 5 0087 取100g壳聚糖 （脱乙酰度为95.7%） ， 用醋酸溶液配制成1L10%的壳聚糖溶液， 添加 适量 HAc 调节溶液的 pH 值为 5.0， 溶胀充分后， 于 55水浴中保温 30min。准备完毕后按壳 聚糖用量的 0.5%（w/w） 添加自制固体壳聚糖酶， 开始计时， 反应 120min 左右开始检取样测 （每 5mi n 取样一次） 直到刚好不产生沉淀为止， 加热煮沸 10min 灭酶 , 终止反应。重复此 实验 3 次， 酶解所用时间分别为 145min。

35、， 150min， 140min。酶解产物经乙酰丙酮法检测平均 分子量为 1736Dalton。 0088 比较例 0089 取取100g壳聚糖 （脱乙酰度为95.7%） ， 用醋酸溶液配制成1L10%的壳聚糖溶液， 添 加适量 HAc 调节溶液的 pH 值为 5.0， 溶胀充分后， 于 55水浴中保温 30min。准备完毕后按 壳聚糖用量的 0.5%（v/w） 添加市售液体酶制剂和本发明实施例所获得的壳聚糖酶， 开始计 时， 反应 120min 左右开始检取样测 （每 10min 取样一次） 直到刚好不产生沉淀为止， 反应终 止， 加热煮沸 10min 灭酶。重复此实验 3 次， 酶解所用时。

36、间分别为 10.5h， 10.6h， 10.2h。酶 解产物经乙酰丙酮法检测平均分子量为 2659Dalton。实验结果如表 2。 0090 表 2 不同来源的酶制剂酶解效果比较 0091 0092 从表 2 可以看出， 市售的浓缩液体酶反应需要 10h， 而自制粗酶仅需要 2.4h， 极大 说 明 书 CN 102851239 A 8 7/7 页 9 地缩短了生产时间， 节约了生产成本 ； 且液体酶为浓缩酶， 需要低温保存， 而自制酶是粗酶， 仅需烘干即可， 制剂成本有较大的差异， 综合这两点， 可以大大降低壳寡糖生产成本。 说 明 书 CN 102851239 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102851239 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 102851239 A 11 。