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一种制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述中间体.pdf

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文档编号：5062912

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1、(10)申请公布号 CN 102875649 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102875649 A *CN102875649A* (21)申请号 201210364829.0 (22)申请日 2012.09.26 C07K 7/06(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址 518057 广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层 (72)发明人潘俊峰陆永章马亚平袁建成 (74)专利代理机构北京北翔知识产权代理有限公司 11285 代理人。

2、钟守期张广育 (54) 发明名称一种制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述中间体 (57) 摘要本发明涉及一种新的制备特拉匹韦的方法，其包括以下步骤： 1）以一种树脂作为载体，按照 Fmoc 固相合成方法顺序地偶联以下 5 种物质得到肽树脂： - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯-1-羧酸， -Fmoc-L-叔亮氨酸， -Fmoc-2-环己基甘氨酸，和 -2- 甲酸吡嗪； 2）裂解肽树脂，得到脱保护肽； 3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦；其中 Fmoc 为 9- 芴甲氧羰基。

3、，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。本发明制备特拉匹韦的方法操作简单、成本低且收率高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 14 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 14 页 1/2 页 2 1. 一种制备特拉匹韦的方法，该方法包括以下步骤： 1）以一种树脂作为载体，按照 Fmoc 固相合成方法顺序地偶联以下 5 种物质得到肽树脂： - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸， -Fmoc-L- 叔亮氨酸， -Fmoc-2- 环己基甘氨酸，和。

4、-2- 甲酸吡嗪； 2）裂解肽树脂，得到脱保护肽； 3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦；其中 Fmoc 为 9- 芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。 2. 权利要求 1 的方法，还包括纯化特拉匹韦的步骤，纯化优选通过重结晶方法而进行。 3. 权利要求 1 的方法，其中所述偶联在固相反应柱中进行；且其中各步骤均在室温和常压下进行。 4. 权利要求 1 的方法，其中所述树脂载体为 2-CTC 树脂或王树脂，树脂替代度为 0.2-1.1mmol/g，优选为 0.5-1.0mmol/g。 5.权利要求4的方法，其中所述树脂载。

5、体为2-CTC树脂时，裂解试剂为20%的TFE/DCM ；所述树脂载体为王树脂时，裂解试剂为 TFA、 PhSMe、 PhOMe、 EDT 和 H2O 的混合物，它们的体积比顺序地为 80-90 ： 0-2 ： 0-3 ： 0-5 ： 0-5。 6. 权利要求 1 的方法，其中步骤 1）中的每种物质进行偶联反应的时间为 2-6 小时，优选 3-5 小时；优选地，偶联之前，将步骤 1）中的每种物质中的羧基进行活化，活化在冰水浴中进行；活化剂优选为 DIPEA 或 DIPCDI。 7.权利要求1的方法，其中所述偶联在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂为DIPCD。

6、I、 A、或其结合，或者为DIPEA、 A、 B或其结合，其中A为HOBt或者为选自HOAt， B为PyBOP、 PyAOP、 HATU、 HBTU 和 TBTU 中的一种。 8. 权利要求 1 的方法，其中步骤 6）中特拉匹韦粗品的重结晶通过用良性溶剂溶解特拉匹韦粗品，然后加入不良溶剂析出特拉匹韦的晶体而实现，其中所述良性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，或其任意结合，优选为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯的单一溶剂，不良溶剂为正己烷、水、醚，或其任意结合，优选为正己烷、水或醚的单一溶剂。 9. 一种制备下式的特拉匹韦中间体的方法，权利要求书。

7、 CN 102875649 A 2 2/2 页 3 该方法包括以下步骤： 1）以一种树脂作为载体，按照 Fmoc 固相合成方法顺序地偶联以下 5 种物质得到肽树脂： - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸， -Fmoc-L- 叔亮氨酸， -Fmoc-2- 环己基甘氨酸，和 -2- 甲酸吡嗪； 2）裂解肽树脂；其中 Fmoc 为 9- 芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。 10. 一种特拉匹韦中间体，其结构如下：权利要求书 CN 102875649 A 3 1/14 页 4 一种制备特拉匹韦。

8、及其中间体的方法及所述中间体技术领域 0001 本发明涉及一种新的制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述特拉匹韦中间体。背景技术 0002 特拉匹韦是一种可逆性蛋白酶抑制剂，可有效抑制 HVC 病毒的复制，用于丙型肝炎的治疗，其结构如下所示： 0003 0004 该药安全性高，且用药时间短，能减少长期用药给患者带来的不良反应。 0005 目前，特拉匹韦主要通过液相方法合成（参见 Drugs ofthe Future2007,32(9):788-798）。液相合成收率低；且合成中需要昂贵的催化剂和高压设备，使得成本高、操作复杂。发明内容。

9、0006 本发明提供一种制备特拉匹韦的方法，包括以下步骤： 0007 1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂： 0008 - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： 0009 0010 -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸， 0011 -Fmoc-L- 叔亮氨酸， 0012 -Fmoc-2- 环己基甘氨酸，和 0013 -2- 甲酸吡嗪； 0014 2）裂解肽树脂，得到脱保护肽； 0015 3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦； 0016 其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的。

10、氨原子相连。 0017 优选地，本发明方法还包括纯化特拉匹韦的步骤。 0018 本发明制备特拉匹韦的方法操作简单、成本低且收率高。说明书 CN 102875649 A 4 2/14 页 5 0019 此外，本发明还提供了一种制备特拉匹韦中间体的方法，该方法包括以下步骤： 0020 1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂： 0021 - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： 0022 0023 -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸， 0024 -Fmoc-L- 叔亮氨酸， 0025 -Fmoc-2- 环己基甘氨酸，和 0。

11、026 -2- 甲酸吡嗪； 0027 2）裂解肽树脂，得到特拉匹韦中间体； 0028 其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。 0029 此外，本发明还提供了一种通过上述方法制备的特拉匹韦中间体，其结构如下： 0030 具体实施方式 0031 对本发明中所用缩写及其含义说明如下： 0032 说明书 CN 102875649 A 5 3/14 页 6 0033 0034 本发明提供一种制备特拉匹韦的方法，该方法包括以下步骤：说明书 CN 102875649 A 6 4/14 页 7 0035 1）以一种树脂作为载体，按照Fm。

12、oc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂： 0036 - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： 0037 0038 -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸 0039 （Fmoc-octahydrocyclopentacpyrrole-1-carboxylic acid）， 0040 -Fmoc-L- 叔亮氨酸（Fmoc-L-tert-leucine）， 0041 -Fmoc-2- 环己基甘氨酸（Fmoc-2-Cyclohexylglycine），和 0042 -2- 甲酸吡嗪（Pyrazinoic acid）； 0043 2）裂解肽树脂，得到脱保护肽；。

13、0044 3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦； 0045 其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。 0046 步骤 1） 0047 本发明中 “肽” 是指类似地通过多肽合成中的 Fmoc 固相合成方法得到的上述 5 种物质的偶联产物。 0048 第一种物质氨基酸 Fmoc-P-OH 可按如下方法制备： 0049 （1）将1-硝基丁烷与乙醛酸在一种溶剂与三乙胺的存在下在惰性气体（优选氮气）气氛中进行反应，得到中间产物 1 ； 0050 （2）将中间产物 1 在 Pd/C 存在下用还原剂还原，并将还原的产物与 Fmoc-O。

14、Su 反应得到中间产物 2 ； 0051 （3）将中间产物 2 与 IBX 反应，得到 Fmoc-P-OH。 0052 其中所用还原剂可为H2或甲酸铵；溶剂可按本领域技术人员已知的常规方法进行选择，例如甲醇。 0053 上述制备过程可用以下反应式表示： 0054 0055 对于步骤 1）中的其他四种物质，均可商购得到或按文献已知的方法制备。 0056 对所述树脂载体无特别限定，只要其具有可与上述 5 种物质中的羧基进行反应的活性位点且不与所述 5 种物质中的其他基团反应即可。所述树脂载体优选为 2-CTC 树脂或王树脂两类，树脂替代度为 0.2-1.1mmol/g，。

15、优选为 0.5-1.0mmol/g。 0057 本发明所用王树脂类的结构如下：说明书 CN 102875649 A 7 5/14 页 8 0058 0059 所用 2-CTC 树脂类的结构如下： 0060 0061 其中代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。 0062 上述两种树脂均可商购得到（天津南开和成科技有限公司）或按文献已知的方法制备。 0063 偶联优选在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂优选为 DIPCDI、 A、或其结合，或者为 DIPEA、 A、 B 或其结合，其中 A 为 HOBt 或者为选自 HOAt， B 为 PyBOP、 PyAOP、 HAT。

16、U、 HBTU 和 TBTU 中的一种。 0064 所述偶联在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。 0065 此外，每种物质进行偶联反应的时间通常为 2-6 小时，优选 3-5 小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力（例如 0.01-1.5 大气压）下进行；温度优选为室温（指 205），也可在适当提高或降低的温度下（例如 0-50）进行。 0066 优选地，偶联之前，将步骤 1）中的每种物质中的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为 DIPEA 或 DIPCDI。 0067 偶联上述 5 。

17、种物质来制备肽树脂可采用多肽合成领域中技术人员已知的 Fmoc 固相合成方法来实现，例如可以参见文献 Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,W.C.Chan,Peter D.White 著， March 2,2000 （ISBN-10:0199637245） , 英国 Oxford University Press。 0068 在一个具体实施方案中， 5 种物质的偶联过程为： 0069 （1）将所选树脂载体加入到一个固相反应柱中，洗涤，并使树脂溶胀；之后，将第一个待偶联的物质氨基酸 Fmoc-P-OH 。

18、溶解并活化后，加入上述柱中进行反应；反应完成后，得到一次偶联的肽树脂； 0070 （2）将（1）中所得肽树脂，进行洗涤，并脱除 Fmoc，接着再次洗涤树脂，直至用检测剂（例如茚三酮）检测到树脂显色为止；随后将合适量（针对（1）中所得肽树脂上氨基酸的量而言）的第二个待偶联的物质 Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸和偶联剂溶解并活化后，一起加入柱中，进行反应，待检测到树脂无色透明时，反应终止； 0071 （3）按与（2）相同的操作依次偶联 Fmoc-L- 叔亮氨酸、 Fmoc-2- 环己基甘氨酸和 2- 甲酸吡嗪，最终。

19、得到肽树脂。 0072 其中在步骤（1）中，在氨基酸 Fmoc-P-OH 偶联至树脂载体上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤，以避免其在下一步偶联反应中与另外说明书 CN 102875649 A 8 6/14 页 9 的待偶联物质反应形成副产物，以及除去所加入的封闭液的步骤。当所述树脂载体为2-CTC 树脂时，所加入的封闭液优选为无水甲醇；当所述树脂载体为王树脂时，所加入的封闭液优选为摩尔比为 1:1 的醋酐和吡啶。 0073 偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选 DMF。 0074 在偶联过程中（氨基酸。

20、 Fmoc-P-OH 的偶联除外），所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。 0075 脱除 Fmoc 的试剂可为可实现该目的的任何试剂，优选 20% 的哌啶 /DMF 溶液，即哌啶： DMF（体积比）为 1:4 的混合试剂。 0076 采用固相合成法偶联制备肽树脂的过程可用反应式表示如下（反应条件略）： 0077 说明书 CN 102875649 A 9 7/14 页 10 0078 其中，代表 2-CTC 树脂或王树脂。 0079 步骤 2） 0080 所得肽树脂中的树脂可通过裂解除去，得到所述的脱保护肽，如下所示： 0081 说明书。

21、 CN 102875649 A 10 8/14 页 11 0082 所述裂解优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的温度和压力下进行。 0083 如果采用 2-CTC 树脂，裂解试剂优选 20% 的 TFE/DCM，其中 TFE ： DCM 的体积比为 1:4 ； 0084 如果采用王树脂，裂解试剂优选为 TFA、 PhSMe、 PhOMe、 EDT 和 H2O 的混合物，它们的体积比顺序地为 80-90 ： 0-2 ： 0-3 ： 0-5 ： 0-5。 0085 所述的裂解制备脱保护肽的具体过程如下： 0086 使上步所得肽树脂与预先配制好的裂解试剂在室温下反应；反。

22、应完成后，过滤树脂，收集滤液；然后洗涤树脂，将洗涤液与滤液合并，进行减压浓缩；向浓缩液中加入合适的试剂（例如冰乙醚）中沉淀出脱保护肽，将其离心分离，洗涤，并减压干燥。 0087 步骤 3） 0088 表述 “在液相条件下” 是指脱保护肽在与环丙胺反应之前为溶液形式，这通过将上步所得脱保护肽加入一种溶剂中而实现，所用溶剂为非质子性溶剂，优选 THF、 DCM、 DMF、或其结合。 0089 脱保护肽在液相条件下与环丙胺的反应在 EDC（1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺）盐酸盐和 NMM（N- 甲基吗啉）的存在下进行，反应式如下。

23、： 0090 0091 上述反应优选在常温常压下进行，也可在适当提高或降低的温度或压力下进行。 0092 将所得产物进行萃取和干燥，过滤，蒸发除去溶剂，得到特拉匹韦。 0093 萃取可通过能实现此目的的所有常规萃取剂进行，优选饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液；干燥可通过能实现此目的的所有常规干燥剂进行，优选无水硫酸钠。 0094 优选地，制备特拉匹韦的方法还包括纯化特拉匹韦的步骤。纯化可采用快速薄层色谱法等常规用于纯化特拉匹韦的方法进行。 0095 本发明中，优选地，纯化通过重结晶方法而进行，即通过用溶剂溶解特拉匹韦，然后析出特拉匹韦的晶体而实现。 0096。

24、在一个具体实施方案中，纯化特拉匹韦的步骤通过用良性溶剂溶解特拉匹韦，然后加入不良溶剂析出特拉匹韦的晶体而实现。此处 “良性溶剂” 是指在室温和常压下对特拉匹韦的溶解度大于 90 重量 %、优选大于 95 重量 %、更优选大于 99 重量 % 的溶剂；“不良溶说明书 CN 102875649 A 11 9/14 页 12 剂” 是指在室温和常压下对特拉匹韦的溶解度小于 10 重量 %、优选小于 5%，更优选小于 1% 的溶剂。良性溶剂优选为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，或其任意结合，但不限于此，更优选为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯的单一溶剂。不良溶剂优。

25、选为正己烷、水、醚，或其任意结合，但不限于此，更优选为正己烷、水或醚的单一溶剂。 0097 重结晶优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的压力下进行。重结晶可使用常规用于此目的所有设备而实现。 0098 此外，本发明提供一种制备特拉匹韦中间体的方法，该方法包括以下步骤： 0099 1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂： 0100 - 氨基酸 Fmoc-P-OH ： 0101 0102 -Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸， 0103 -Fmoc-L- 叔亮氨酸， 0104 -Fmoc-2- 环己基甘。

26、氨酸，和 0105 -2- 甲酸吡嗪； 0106 2）裂解肽树脂； 0107 其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。 0108 在本发明中，对于制备特拉匹韦方法的步骤 1）和 2）中的所有说明相应地适用于此处制备特拉匹韦中间体的方法。 0109 此外，本发明还提供了一种由上述方法制备的特拉匹韦中间体，其结构如下： 0110 0111 本发明主要采用了多肽合成中的 Fmoc 固相合成方法来制备特拉匹韦及其中间体，且制备中各步骤均可在室温和常压下进行，使得该方法易于操作、成本低，且所制备的特拉匹韦收率高。 0112 以下参照。

27、实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。 0113 1.（1） Fmoc-P-OH 氨基酸的制备例 0114 称取 10.3 克 1- 硝基丁烷装入一个 250ml 玻璃烧瓶中，加入 100ml 甲醇，并在氮气保护下加入 1.2 当量乙醛酸（glyoxylic acid） 8.88 克，慢慢加入三乙胺 0.8ml，室温反应说明书 CN 102875649 A 12 10/14 页 13 3 小时，薄层色谱检测原料反应完全，减压旋转蒸发掉甲醇，采用乙酸乙酯 - 石油醚（体积比 1:1）重结晶得到中间体。 0115 向得到的中间体中。

28、加入 50ml 甲醇、 0.5 克钯碳和 6.3 克甲酸铵，室温反应 2 小时，薄层色谱检测原料反应完全，过滤，减压旋转蒸发掉甲醇，得到油状物，将其用 200mlTHF- 水（THF ： H2O=1:1，体积比）的混合溶液溶解，加入 10.6 克碳酸钠，然后慢慢滴加含有37.1克Fmoc-OSu的100mlTHF溶液， 20分钟滴加完毕，室温反应，薄层色谱监测反应直到原料反应完全。减压旋转蒸发掉 THF，水相用 100ml 乙酸乙酯萃取 3 次，弃去有机相；向水相中加入200ml乙酸乙酯，混合液用1N盐酸调节至pH=1，分液萃取，有机相用100m。

29、l饱和氯化钠水溶液洗涤2次，无水硫酸钠干燥2小时，减压旋转蒸发掉乙酸乙酯，得到油状物，将油状物用乙酸乙酯 - 石油醚重结晶，得到白色固体 31.28 克。 0116 将所得白色固体溶解到 200ml 溶剂（THF ： DMSO=4:1，体积比）中，加入 2- 碘酰基苯甲酸 28.2 克，反应 2 小时，反应结束后，减压旋转蒸发掉 THF，向其中加入 100ml 水和 200ml 二氯甲烷，萃取，有机用相无水硫酸钠干燥 2 小时，过滤，减压旋转蒸发掉二氯甲烷，得到油状物，油状物用 300ml 乙酸乙酯 - 石油醚（乙酸乙酯：石油醚 =1:4，。

30、体积比）重结晶，得到白色固体 30.4 克，计算得到收率 82.8%。 0117 （2）其余四种物质均购自 Bachem（瑞士， Bubendorf）。 0118 2.Fmoc-P-CTC 树脂的制备实施例（1）至（3）（氨基酸 Fmoc-P-OH 偶联至 2-CTC 树脂） 0119 （1）称取替代度为 0.3mmol/g 的 2-CTC 树脂（购自天津南开和成科技有限公司，下同） 20g，加入到固相反应柱（250ml，购自四川蜀牛）中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取6.6gFmoc-P-OH氨基酸用（25ml）。

31、 DMF溶解，冰水浴下加入4.78mL DIPEA活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤 3 次， DCM 洗涤 3 次，将甲醇收缩抽干，得到 Fmoc-P-CTC 树脂，检测得替代度为 0.26mmol/ g。 0120 （2）称取替代度为 0.7mmol/g 的 2-CTC 树脂 20g，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 15.4gFmoc-P-OH 氨基酸用 DMF 溶解，冰水浴下加入 14.6mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中。

32、，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭 1 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗涤 3 次，用 20mL 无水甲醇封闭 30 分钟，将甲醇收缩抽干，得到 Fmoc-P-CTC 树脂，检测得替代度为 0.56mmol/g。 0121 （3）称取替代度为 1.1mmol/g 的 2-CTC 树脂 9.1g，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 11.0gFmoc-P-OH 氨基酸用 DMF 溶解，冰水浴下加入 10.5mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入15mL无水甲醇。

33、封闭 1 小时。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗涤 3 次，用 15mL 无水甲醇封闭 30 分钟，将甲醇收缩抽干，得到 Fmoc-P-CTC 树脂，检测得替代度为 0.92mmol/g。 0122 3.Fmoc-P- 王树脂的制备实施例（1） -（2）（氨基酸 Fmoc-P-OH 偶联至王树脂） 0123 （1）称取替代度为 1.1mmol/g 的王树脂（购自天津南开和成科技有限公司，下同） 9.1g，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟后，取 11.0g Fmoc-P-OH氨基酸和4.86克HOBt用DMF溶解，。

34、冰水浴下加入5.6mL DIPCDI活化后，加入上述装有树脂的反应柱中， 2 分钟后加入 120 毫克 DMAP，反应 2 小时后。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 说明书 CN 102875649 A 13 11/14 页 14 洗涤 3 次，用醋酐和吡啶（摩尔比 1:1）的混合溶液 25ml 封闭过夜，抽滤掉反应液，用 DMF 洗涤 3 次，将甲醇收缩抽干，得到 Fmoc-P- 王树脂，检测替代度为 0.83mmol/g。 0124 （2）称取替代度为 0.2mmol/g 的王树脂 25g，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶。

35、胀树脂 30 分钟后，取 5.51gFmoc-P-OH 氨基酸和 0.74 克 HOBt 用 DMF 溶解，冰水浴下加入 0.86mL DIPCDI 活化后，加入上述装有树脂的反应柱中， 2 分钟后加入 42 毫克 DMAP，反应 2 小时后。用 DMF 洗涤 3 次， DCM 洗涤 3 次，用醋酐和吡啶（摩尔比 1:1）的混合溶液 25ml 封闭过夜，抽滤掉反应液， DMF 洗涤 3 次，将甲醇收缩抽干，得到 Fmoc-P- 王树脂，检测替代度为 0.175mmol/g。 0125 4. 肽树脂的制备实施例（1）至（3）（其他 4 种物质顺序偶联至 Fmoc。

36、-P-CTC 树脂） 0126 （1）称取替代度为 0.56mmol/g 的 Fmoc-P-CTC 树脂 17.86 克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂，有颜色。称取 11.3 克 Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸和 4.45 克 HOBt，用 25mlDMF 溶解，冰水浴下加入 5.2ml DIPCDI 活化 5 分钟，将混合液加入到反应柱中，。

37、室温反应 2 小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0127 反应结束后，用 DMF 洗涤树脂 3 次，加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂有颜色。称取 10.59 克 Fmoc-L- 叔亮氨酸和 4.45 克 HOBt，用 25mlDMF 溶解，冰水浴下加入 5.2ml DIPCDI 活化 5 分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应 2 小时，以茚三酮检测树脂，显色，延长反应 1 小时，再以茚。

38、三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0128 按照同样的方法依次偶联 Fmoc-2- 环己基甘氨酸和 2- 甲酸吡嗪，偶联结束后，对树脂收缩抽干，得到肽树脂 18.7 克，树脂增重率 84.8%。 0129 （2）称取替代度为 0.56mmol/g 的 Fmoc-P-CTC 树脂 17.86 克，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟，加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂。

39、有颜色。称取 11.3 克 Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸、 4.45 克 HOBt 和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应 2 小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0130 反应结束后，用 DMF 洗涤树脂 3 次，加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂有颜色。称取 10.59 克 Fmoc-L- 叔亮。

40、氨酸、 4.45 克 HOBt 和 15.6 克 PyBOP，用 25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应 2 小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0131 按照同样的方法依次偶联 Fmoc-2- 环己基甘氨酸和 2- 甲酸吡嗪，偶联结束后，树脂收缩抽干，得到肽树脂 20.9 克，树脂增重率 94.8%。 0132 （3）称取替代度为 0.92mmol/g 的 Fmoc-P-CTC 树脂 10.87 克，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟，。

41、加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂，有颜色。称取 Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸 11.3 克、 4.45 克 HOBt 说明书 CN 102875649 A 14 12/14 页 15 和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应 2 小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0133 反应结束后，用 DM。

42、F 洗涤树脂 3 次，加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂有颜色。称取 10.59 克 Fmoc-L- 叔亮氨酸、 4.45 克 HOBt 和 15.6 克 PyBOP，用 25mlDCM 溶解，冰水浴下加入 10.5ml DIPEA 活化 5 分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应 2 小时，以茚三酮检测反应终点，树脂有颜色，延长反应 1 小时，再以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0134 按照同样的方。

43、法依次偶联 Fmoc-2- 环己基甘氨酸和 2- 甲酸吡嗪，偶联结束后，将树脂收缩抽干，得到肽树脂 12.03 克，树脂增重率 80.2%。 0135 5. 肽树脂的制备实施例（其他 4 种物质顺序偶联至 Fmoc-P- 王树脂） 0136 称取替代度为 0.45mmol/g 的 Fmoc-P- 王树脂 22.22 克，加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2 次，用 DMF 溶胀树脂 30 分钟，加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚。

44、三酮检测树脂有颜色。称取 Fmoc- 八氢环戊烯并 C 吡咯 -1- 羧酸 11.3 克、 4.45 克 HOBt 和 15.6 克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5mlDIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应 2 小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0137 反应结束后，用 DMF 洗涤树脂 3 次，加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 5 分钟，抽掉反应液，再加入 20% 哌啶 /DMF 溶液，反应 10 分钟，反应结束。之后用 DMF 洗涤树脂 6 次，茚三酮检测树脂有颜色。称取 10.59 克 Fm。

45、oc-L- 叔亮氨酸、 4.45 克 HOBt 和 15.6 克 PyBOP，用 25mlDCM 溶解，冰水浴下加入 10.5ml DIPEA 活化 5 分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，有颜色，延长反应1小时，再以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。 0138 按照同样的方法依次偶联 Fmoc-2- 环己基甘氨酸和 2- 甲酸吡嗪，偶联结束后，将树脂收缩抽干，得到肽树脂 23.85 克，树脂增重率 90.4%。 0139 6. 脱保护肽的制备实施例（1）至（2）（脱除树脂载体，得到特拉匹韦中间体） 0140 （1）将。

46、实施例 4.（2）得到的肽树脂 20.9 克加入到一个 500ml 单口瓶中，加入预先配制好的 TFE ： DCM=1:4（V:V） 220ml，室温反应 3 小时，过滤树脂，收集滤液，用 DCM 洗涤树脂，合并洗涤液与滤液，然后将其减压浓缩到 40ml，将浓缩液缓慢加入 400ml 冰乙醚中沉淀。将沉淀离心脱水，用冰乙醚洗涤，洗涤 5 次，减压干燥得到固体 6.12 克，用 HPLC 检测得纯度 92.3%，计算得收率 95.6%。 0141 ESI， m/z， (M+Na+)662.4。 0142 （2）将实施例 5 得到的肽树脂 23.85 克加入到。

47、一个 500ml 单口瓶中，加入预先配制好的 TFA ： PhSMe ： PhOMe ： EDT=90:5:3:2（V:V） 250ml，室温反应 2.5 小时，过滤树脂，收集滤液。用TFA洗涤树脂，合并洗涤液与滤液，然后将其缓慢加入2500ml冰乙醚中沉淀。将沉淀离心脱水，用冰乙醚洗涤，洗涤5次，减压干燥得到固体5.58克，用HPLC检测得纯度91.6%，计算得收率 87.2%。 0143 ESI， m/z， (M+Na+)662.4。 0144 7. 特拉匹韦的制备实施例（1）至（2）说明书 CN 102875649 A 15 13/14 页 1。

48、6 0145 （1）将实施例 6.（1）得到的固体 6.12 克加入到一个 250ml 单口瓶中，加入 80ml DCM，再加入 EDCHCl 2.07 克、环丙胺 0.5 克，室温反应，薄层色谱监测反应终点， 4 小时后反应结束。用饱和碳酸氢钠水溶液萃取 2 次，每次 100ml，用饱和氯化钠水溶液萃取 3 次，每次 100ml，有机相用无水硫酸钠干燥 2 小时，过滤，旋转蒸发掉 DCM。得到 6.28 克产品， HPLC 检测得纯度 95.2%，计算得收率 92.48%， ESI， m/z， C36H53N7O6Na+(M+Na+) 计算值为 702.3950，实测值为 702.3929。 0146 （2）将实施例 6.（2）得到的固体 5.58 克加入到 250ml 单口瓶中，加入 60ml DCM，再加入 EDC HCl1.89 克，环丙胺 0.46 克，室温反应 4 小时，薄层色谱监测反应终点。用饱和碳酸氢钠水溶液萃取 2 次，每次 100ml，饱和氯化钠水溶液萃取 3 次，每次 100ml。有机相用无水硫酸钠干燥 2 小时，过滤，旋转蒸发掉。

摘要
申请专利号：	CN201210364829.0	申请日：	2012.09.26
公开号：	CN102875649A	公开日：	2013.01.16
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|著录事项变更IPC(主分类):C07K 7/06变更事项:发明人变更前:潘俊峰陆永章马亚平袁建成变更后:潘俊锋陆永章马亚平袁建成\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 7/06申请日:20120926\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K7/06; C07K1/06; C07K1/04	主分类号：	C07K7/06
申请人：	深圳翰宇药业股份有限公司
发明人：	潘俊峰; 陆永章; 马亚平; 袁建成
地址：	518057 广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层
优先权：
专利代理机构：	北京北翔知识产权代理有限公司 11285	代理人：	钟守期;张广育
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内容摘要

本发明涉及一种新的制备特拉匹韦的方法，其包括以下步骤：1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：-氨基酸Fmoc-P-OH：-Fmoc-八氢环戊烯并[C]吡咯-1-羧酸，-Fmoc-L-叔亮氨酸，-Fmoc-2-环己基甘氨酸，和-2-甲酸吡嗪；2）裂解肽树脂，得到脱保护肽；3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦；其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。本发明制备特拉匹韦的方法操作简单、成本低且收率高。

权利要求书

权利要求书一种制备特拉匹韦的方法，该方法包括以下步骤：
1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：
‑氨基酸Fmoc‑P‑OH：

‑Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸，
‑Fmoc‑L‑叔亮氨酸，
‑Fmoc‑2‑环己基甘氨酸，和
‑2‑甲酸吡嗪；
2）裂解肽树脂，得到脱保护肽；
3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦；
其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。
权利要求1的方法，还包括纯化特拉匹韦的步骤，纯化优选通过重结晶方法而进行。
权利要求1的方法，其中所述偶联在固相反应柱中进行；且其中各步骤均在室温和常压下进行。
权利要求1的方法，其中所述树脂载体为2‑CTC树脂或王树脂，树脂替代度为0.2‑1.1mmol/g，优选为0.5‑1.0mmol/g。
权利要求4的方法，其中所述树脂载体为2‑CTC树脂时，裂解试剂为20%的TFE/DCM；所述树脂载体为王树脂时，裂解试剂为TFA、PhSMe、PhOMe、EDT和H2O的混合物，它们的体积比顺序地为80‑90：0‑2：0‑3：0‑5：0‑5。
权利要求1的方法，其中步骤1）中的每种物质进行偶联反应的时间为2‑6小时，优选3‑5小时；优选地，偶联之前，将步骤1）中的每种物质中的羧基进行活化，活化在冰水浴中进行；活化剂优选为DIPEA或DIPCDI。
权利要求1的方法，其中所述偶联在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂为DIPCDI、A、或其结合，或者为DIPEA、A、B或其结合，其中A为HOBt或者为选自HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU中的一种。
权利要求1的方法，其中步骤6）中特拉匹韦粗品的重结晶通过用良性溶剂溶解特拉匹韦粗品，然后加入不良溶剂析出特拉匹韦的晶体而实现，其中所述良性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，或其任意结合，优选为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯的单一溶剂，不良溶剂为正己烷、水、醚，或其任意结合，优选为正己烷、水或醚的单一溶剂。
一种制备下式的特拉匹韦中间体的方法，

该方法包括以下步骤：
1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：
‑氨基酸Fmoc‑P‑OH：

‑Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸，
‑Fmoc‑L‑叔亮氨酸，
‑Fmoc‑2‑环己基甘氨酸，和
‑2‑甲酸吡嗪；
2）裂解肽树脂；
其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。
一种特拉匹韦中间体，其结构如下：

说明书

说明书一种制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述中间体
技术领域
本发明涉及一种新的制备特拉匹韦及其中间体的方法及所述特拉匹韦中间体。
背景技术
特拉匹韦是一种可逆性蛋白酶抑制剂，可有效抑制HVC病毒的复制，用于丙型肝炎的治疗，其结构如下所示：

该药安全性高，且用药时间短，能减少长期用药给患者带来的不良反应。
目前，特拉匹韦主要通过液相方法合成（参见Drugs ofthe Future2007,32(9):788‑798）。液相合成收率低；且合成中需要昂贵的催化剂和高压设备，使得成本高、操作复杂。
发明内容
本发明提供一种制备特拉匹韦的方法，包括以下步骤：
1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：
‑氨基酸Fmoc‑P‑OH：

‑Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸，
‑Fmoc‑L‑叔亮氨酸，
‑Fmoc‑2‑环己基甘氨酸，和
‑2‑甲酸吡嗪；
2）裂解肽树脂，得到脱保护肽；
3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦；
其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。
优选地，本发明方法还包括纯化特拉匹韦的步骤。
本发明制备特拉匹韦的方法操作简单、成本低且收率高。
此外，本发明还提供了一种制备特拉匹韦中间体的方法，该方法包括以下步骤：
1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：
‑氨基酸Fmoc‑P‑OH：

‑Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸，
‑Fmoc‑L‑叔亮氨酸，
‑Fmoc‑2‑环己基甘氨酸，和
‑2‑甲酸吡嗪；
2）裂解肽树脂，得到特拉匹韦中间体；
其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。
此外，本发明还提供了一种通过上述方法制备的特拉匹韦中间体，其结构如下：

具体实施方式
对本发明中所用缩写及其含义说明如下：

本发明提供一种制备特拉匹韦的方法，该方法包括以下步骤：
1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：
‑氨基酸Fmoc‑P‑OH：

‑Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸
（Fmoc‑octahydrocyclopenta[c]pyrrole‑1‑carboxylic acid），
‑Fmoc‑L‑叔亮氨酸（Fmoc‑L‑tert‑leucine），
‑Fmoc‑2‑环己基甘氨酸（Fmoc‑2‑Cyclohexylglycine），和
‑2‑甲酸吡嗪（Pyrazinoic acid）；
2）裂解肽树脂，得到脱保护肽；
3）脱保护肽在液相条件下与环丙胺反应，得到特拉匹韦；
其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。
步骤1）
本发明中“肽”是指类似地通过多肽合成中的Fmoc固相合成方法得到的上述5种物质的偶联产物。
第一种物质氨基酸Fmoc‑P‑OH可按如下方法制备：
（1）将1‑硝基丁烷与乙醛酸在一种溶剂与三乙胺的存在下在惰性气体（优选氮气）气氛中进行反应，得到中间产物1；
（2）将中间产物1在Pd/C存在下用还原剂还原，并将还原的产物与Fmoc‑OSu反应得到中间产物2；
（3）将中间产物2与IBX反应，得到Fmoc‑P‑OH。
其中所用还原剂可为H2或甲酸铵；溶剂可按本领域技术人员已知的常规方法进行选择，例如甲醇。
上述制备过程可用以下反应式表示：

对于步骤1）中的其他四种物质，均可商购得到或按文献已知的方法制备。
对所述树脂载体无特别限定，只要其具有可与上述5种物质中的羧基进行反应的活性位点且不与所述5种物质中的其他基团反应即可。所述树脂载体优选为2‑CTC树脂或王树脂两类，树脂替代度为0.2‑1.1mmol/g，优选为0.5‑1.0mmol/g。
本发明所用王树脂类的结构如下：

所用2‑CTC树脂类的结构如下：

其中代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。
上述两种树脂均可商购得到（天津南开和成科技有限公司）或按文献已知的方法制备。
偶联优选在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂优选为DIPCDI、A、或其结合，或者为DIPEA、A、B或其结合，其中A为HOBt或者为选自HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU中的一种。
所述偶联在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。
此外，每种物质进行偶联反应的时间通常为2‑6小时，优选3‑5小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力（例如0.01‑1.5 大气压）下进行；温度优选为室温（指20±5℃），也可在适当提高或降低的温度下（例如0‑50℃）进行。
优选地，偶联之前，将步骤1）中的每种物质中的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA或DIPCDI。
偶联上述5种物质来制备肽树脂可采用多肽合成领域中技术人员已知的Fmoc固相合成方法来实现，例如可以参见文献Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,W.C.Chan,Peter D.White著，March 2,2000（ISBN‑10:0199637245）,英国Oxford University Press。
在一个具体实施方案中，5种物质的偶联过程为：
（1）将所选树脂载体加入到一个固相反应柱中，洗涤，并使树脂溶胀；之后，将第一个待偶联的物质氨基酸Fmoc‑P‑OH溶解并活化后，加入上述柱中进行反应；反应完成后，得到一次偶联的肽树脂；
（2）将（1）中所得肽树脂，进行洗涤，并脱除Fmoc，接着再次洗涤树脂，直至用检测剂（例如茚三酮）检测到树脂显色为止；随后将合适量（针对（1）中所得肽树脂上氨基酸的量而言）的第二个待偶联的物质Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸和偶联剂溶解并活化后，一起加入柱中，进行反应，待检测到树脂无色透明时，反应终止；
（3）按与（2）相同的操作依次偶联Fmoc‑L‑叔亮氨酸、Fmoc‑2‑环己基甘氨酸和2‑甲酸吡嗪，最终得到肽树脂。
其中在步骤（1）中，在氨基酸Fmoc‑P‑OH偶联至树脂载体上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤，以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物，以及除去所加入的封闭液的步骤。当所述树脂载体为2‑CTC树脂时，所加入的封闭液优选为无水甲醇；当所述树脂载体为王树脂时，所加入的封闭液优选为摩尔比为1:1的醋酐和吡啶。
偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。
在偶联过程中（氨基酸Fmoc‑P‑OH的偶联除外），所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。
脱除Fmoc的试剂可为可实现该目的的任何试剂，优选20%的哌啶/DMF溶液，即哌啶：DMF（体积比）为1:4的混合试剂。
采用固相合成法偶联制备肽树脂的过程可用反应式表示如下（反应条件略）：

其中，代表2‑CTC树脂或王树脂。
步骤2）
所得肽树脂中的树脂可通过裂解除去，得到所述的脱保护肽，如下所示：

所述裂解优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的温度和压力下进行。
如果采用2‑CTC树脂，裂解试剂优选20%的TFE/DCM，其中TFE：DCM的体积比为1:4；
如果采用王树脂，裂解试剂优选为TFA、PhSMe、PhOMe、EDT和H2O的混合物，它们的体积比顺序地为80‑90：0‑2：0‑3：0‑5：0‑5。
所述的裂解制备脱保护肽的具体过程如下：
使上步所得肽树脂与预先配制好的裂解试剂在室温下反应；反应完成后，过滤树脂，收集滤液；然后洗涤树脂，将洗涤液与滤液合并，进行减压浓缩；向浓缩液中加入合适的试剂（例如冰乙醚）中沉淀出脱保护肽，将其离心分离，洗涤，并减压干燥。
步骤3）
表述“在液相条件下”是指脱保护肽在与环丙胺反应之前为溶液形式，这通过将上步所得脱保护肽加入一种溶剂中而实现，所用溶剂为非质子性溶剂，优选THF、DCM、DMF、或其结合。
脱保护肽在液相条件下与环丙胺的反应在EDC（1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺）盐酸盐和NMM（N‑甲基吗啉）的存在下进行，反应式如下：

上述反应优选在常温常压下进行，也可在适当提高或降低的温度或压力下进行。
将所得产物进行萃取和干燥，过滤，蒸发除去溶剂，得到特拉匹韦。
萃取可通过能实现此目的的所有常规萃取剂进行，优选饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液；干燥可通过能实现此目的的所有常规干燥剂进行，优选无水硫酸钠。
优选地，制备特拉匹韦的方法还包括纯化特拉匹韦的步骤。纯化可采用快速薄层色谱法等常规用于纯化特拉匹韦的方法进行。
本发明中，优选地，纯化通过重结晶方法而进行，即通过用溶剂溶解特拉匹韦，然后析出特拉匹韦的晶体而实现。
在一个具体实施方案中，纯化特拉匹韦的步骤通过用良性溶剂溶解特拉匹韦，然后加入不良溶剂析出特拉匹韦的晶体而实现。此处“良性溶剂”是指在室温和常压下对特拉匹韦的溶解度大于90重量%、优选大于95重量%、更优选大于99重量%的溶剂；“不良溶剂”是指在室温和常压下对特拉匹韦的溶解度小于10重量%、优选小于5%，更优选小于1%的溶剂。良性溶剂优选为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，或其任意结合，但不限于此，更优选为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯的单一溶剂。不良溶剂优选为正己烷、水、醚，或其任意结合，但不限于此，更优选为正己烷、水或醚的单一溶剂。
重结晶优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的压力下进行。重结晶可使用常规用于此目的所有设备而实现。
此外，本发明提供一种制备特拉匹韦中间体的方法，该方法包括以下步骤：
1）以一种树脂作为载体，按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联以下5种物质得到肽树脂：
‑氨基酸Fmoc‑P‑OH：

‑Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸，
‑Fmoc‑L‑叔亮氨酸，
‑Fmoc‑2‑环己基甘氨酸，和
‑2‑甲酸吡嗪；
2）裂解肽树脂；
其中Fmoc为9‑芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氨原子相连。
在本发明中，对于制备特拉匹韦方法的步骤1）和2）中的所有说明相应地适用于此处制备特拉匹韦中间体的方法。
此外，本发明还提供了一种由上述方法制备的特拉匹韦中间体，其结构如下：

本发明主要采用了多肽合成中的Fmoc固相合成方法来制备特拉匹韦及其中间体，且制备中各步骤均可在室温和常压下进行，使得该方法易于操作、成本低，且所制备的特拉匹韦收率高。
以下参照实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。
1.（1）Fmoc‑P‑OH氨基酸的制备例
称取10.3克1‑硝基丁烷装入一个250ml玻璃烧瓶中，加入100ml甲醇，并在氮气保护下加入1.2当量乙醛酸（glyoxylic acid）8.88克，慢慢加入三乙胺0.8ml，室温反应3小时，薄层色谱检测原料反应完全，减压旋转蒸发掉甲醇，采用乙酸乙酯‑石油醚（体积比1:1）重结晶得到中间体。
向得到的中间体中加入50ml甲醇、0.5克钯碳和6.3克甲酸铵，室温反应2小时，薄层色谱检测原料反应完全，过滤，减压旋转蒸发掉甲醇，得到油状物，将其用200mlTHF‑水（THF：H2O=1:1，体积比）的混合溶液溶解，加入10.6克碳酸钠，然后慢慢滴加含有37.1克Fmoc‑OSu的100mlTHF溶液，20分钟滴加完毕，室温反应，薄层色谱监测反应直到原料反应完全。减压旋转蒸发掉THF，水相用100ml乙酸乙酯萃取3次，弃去有机相；向水相中加入200ml乙酸乙酯，混合液用1N盐酸调节至pH=1，分液萃取，有机相用100ml饱和氯化钠水溶液洗涤2次，无水硫酸钠干燥2小时，减压旋转蒸发掉乙酸乙酯，得到油状物，将油状物用乙酸乙酯‑石油醚重结晶，得到白色固体31.28克。
将所得白色固体溶解到200ml溶剂（THF：DMSO=4:1，体积比）中，加入2‑碘酰基苯甲酸28.2克，反应2小时，反应结束后，减压旋转蒸发掉THF，向其中加入100ml水和200ml二氯甲烷，萃取，有机用相无水硫酸钠干燥2小时，过滤，减压旋转蒸发掉二氯甲烷，得到油状物，油状物用300ml乙酸乙酯‑石油醚（乙酸乙酯：石油醚=1:4，体积比）重结晶，得到白色固体30.4克，计算得到收率82.8%。
（2）其余四种物质均购自Bachem（瑞士，Bubendorf）。
2.Fmoc‑P‑CTC树脂的制备实施例（1）至（3）（氨基酸Fmoc‑P‑OH偶联至2‑CTC树脂）
（1）称取替代度为0.3mmol/g的2‑CTC树脂（购自天津南开和成科技有限公司，下同）20g，加入到固相反应柱（250ml，购自四川蜀牛）中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取6.6gFmoc‑P‑OH氨基酸用（25ml）DMF溶解，冰水浴下加入4.78mL DIPEA活化3分钟，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，将甲醇收缩抽干，得到Fmoc‑P‑CTC树脂，检测得替代度为0.26mmol/g。
（2）称取替代度为0.7mmol/g的2‑CTC树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取15.4gFmoc‑P‑OH氨基酸用DMF溶解，冰水浴下加入14.6mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入20mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用20mL无水甲醇封闭30分钟，将甲醇收缩抽干，得到Fmoc‑P‑CTC树脂，检测得替代度为0.56mmol/g。
（3）称取替代度为1.1mmol/g的2‑CTC树脂9.1g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取11.0gFmoc‑P‑OH氨基酸用DMF溶解，冰水浴下加入10.5mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入15mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用15mL无水甲醇封闭30分钟，将甲醇收缩抽干，得到Fmoc‑P‑CTC树脂，检测得替代度为0.92mmol/g。
3.Fmoc‑P‑王树脂的制备实施例（1）‑（2）（氨基酸Fmoc‑P‑OH偶联至王树脂）
（1）称取替代度为1.1mmol/g的王树脂（购自天津南开和成科技有限公司，下同）9.1g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取11.0g Fmoc‑P‑OH氨基酸和4.86克HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入5.6mL DIPCDI活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，2分钟后加入120毫克DMAP，反应2小时后。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用醋酐和吡啶（摩尔比1:1）的混合溶液25ml封闭过夜，抽滤掉反应液，用DMF洗涤3次，将甲醇收缩抽干，得到Fmoc‑P‑王树脂，检测替代度为0.83mmol/g。
（2）称取替代度为0.2mmol/g的王树脂25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.51gFmoc‑P‑OH氨基酸和0.74克HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入0.86mL DIPCDI活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，2分钟后加入42毫克DMAP，反应2小时后。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用醋酐和吡啶（摩尔比1:1）的混合溶液25ml封闭过夜，抽滤掉反应液，DMF洗涤3次，将甲醇收缩抽干，得到Fmoc‑P‑王树脂，检测替代度为0.175mmol/g。
4.肽树脂的制备实施例（1）至（3）（其他4种物质顺序偶联至 Fmoc‑P‑CTC树脂）
（1）称取替代度为0.56mmol/g的Fmoc‑P‑CTC树脂17.86克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂，有颜色。称取11.3克Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸和4.45克HOBt，用25mlDMF溶解，冰水浴下加入5.2ml DIPCDI活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取10.59克Fmoc‑L‑叔亮氨酸和4.45克HOBt，用25mlDMF溶解，冰水浴下加入5.2ml DIPCDI活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，显色，延长反应1小时，再以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
按照同样的方法依次偶联Fmoc‑2‑环己基甘氨酸和2‑甲酸吡嗪，偶联结束后，对树脂收缩抽干，得到肽树脂18.7克，树脂增重率84.8%。
（2）称取替代度为0.56mmol/g的Fmoc‑P‑CTC树脂17.86克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取11.3克Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸、4.45克HOBt和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取10.59克Fmoc‑L‑叔亮氨酸、4.45克HOBt和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
按照同样的方法依次偶联Fmoc‑2‑环己基甘氨酸和2‑甲酸吡嗪，偶联结束后，树脂收缩抽干，得到肽树脂20.9克，树脂增重率94.8%。
（3）称取替代度为0.92mmol/g的Fmoc‑P‑CTC树脂10.87克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂，有颜色。称取Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸11.3克、4.45克HOBt和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取10.59克Fmoc‑L‑叔亮氨酸、4.45克HOBt和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点，树脂有颜色，延长反应1小时，再以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
按照同样的方法依次偶联Fmoc‑2‑环己基甘氨酸和2‑甲酸吡嗪，偶联结束后，将树脂收缩抽干，得到肽树脂12.03克，树脂增重率80.2%。
5.肽树脂的制备实施例（其他4种物质顺序偶联至Fmoc‑P‑王树脂）
称取替代度为0.45mmol/g的Fmoc‑P‑王树脂22.22克，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc‑八氢环戊烯并[C]吡咯‑1‑羧酸11.3克、4.45克HOBt和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5mlDIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入20%哌啶/DMF溶液，反应5分钟，抽掉反应液，再加入20%哌啶/DMF溶液，反应10分钟，反应结束。之后用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取10.59克Fmoc‑L‑叔亮氨酸、4.45克HOBt和15.6克PyBOP，用25mlDCM溶解，冰水浴下加入10.5ml DIPEA活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测树脂，有颜色，延长反应1小时，再以茚三酮检测树脂，呈无色透明，终止反应。
按照同样的方法依次偶联Fmoc‑2‑环己基甘氨酸和2‑甲酸吡嗪，偶联结束后，将树脂收缩抽干，得到肽树脂23.85克，树脂增重率90.4%。
6.脱保护肽的制备实施例（1）至（2）（脱除树脂载体，得到特拉匹韦中间体）
（1）将实施例4.（2）得到的肽树脂20.9克加入到一个500ml单口瓶中，加入预先配制好的TFE：DCM=1:4（V:V）220ml，室温反应3小时，过滤树脂，收集滤液，用DCM洗涤树脂，合并洗涤液与滤液，然后将其减压浓缩到40ml，将浓缩液缓慢加入400ml冰乙醚中沉淀。将沉淀离心脱水，用冰乙醚洗涤，洗涤5次，减压干燥得到固体6.12克，用HPLC检测得纯度92.3%，计算得收率95.6%。
ESI，m/z，([M+Na]+)662.4。
（2）将实施例5得到的肽树脂23.85克加入到一个500ml单口瓶中，加入预先配制好的TFA：PhSMe：PhOMe：EDT=90:5:3:2（V:V）250ml，室温反应2.5小时，过滤树脂，收集滤液。用TFA洗涤树脂，合并洗涤液与滤液，然后将其缓慢加入2500ml冰乙醚中沉淀。将沉淀离心脱水，用冰乙醚洗涤，洗涤5次，减压干燥得到固体5.58克，用HPLC检测得纯度91.6%，计算得收率87.2%。
ESI，m/z，([M+Na]+)662.4。
7.特拉匹韦的制备实施例（1）至（2）
（1）将实施例6.（1）得到的固体6.12克加入到一个250ml单口瓶中，加入80ml DCM，再加入EDC·HCl 2.07克、环丙胺0.5克，室温反应，薄层色谱监测反应终点，4小时后反应结束。用饱和碳酸氢钠水溶液萃取2次，每次100ml，用饱和氯化钠水溶液萃取3次，每次 100ml，有机相用无水硫酸钠干燥2小时，过滤，旋转蒸发掉DCM。得到6.28克产品，HPLC检测得纯度95.2%，计算得收率92.48%，ESI，m/z，C36H53N7O6Na+([M+Na]+)计算值为702.3950，实测值为702.3929。
（2）将实施例6.（2）得到的固体5.58克加入到250ml单口瓶中，加入60ml DCM，再加入EDC·HCl1.89克，环丙胺0.46克，室温反应4小时，薄层色谱监测反应终点。用饱和碳酸氢钠水溶液萃取2次，每次100ml，饱和氯化钠水溶液萃取3次，每次100ml。有机相用无水硫酸钠干燥2小时，过滤，旋转蒸发掉DCM。得到6.14克产品，HPLC检测得纯度95.2%，计算得收率90.42%。
ESI，m/z，([M+Na]+)702.3924（计算值为702.3950）。
8.特拉匹韦的纯化实施例（1）至（5）
（1）将实施例7.（1）得到的特拉匹韦6.28克加入到一个250ml单口瓶中，加入60ml甲醇，慢慢加热直到溶解，滴加20ml去离子水，放置到室温，慢慢析出白色固体。将沉淀过滤，用去离子水洗涤，真空干燥，得到特拉匹韦5.56克，用HPLC检测得纯度99.5%，计算得总收率81.9%。
13CNMR：(200MHz,CDCl3)：δ=197.6(C),172.7(C),171.1(C),171.0(C),160.8(C),159.9(C),147.1(CH),145.0(C),144.7(CH),142.9(CH),62.6(CH),58.6(CH),53.7(CH),53.4(CH),42.9(CH2),39.4(CH),37.8(CH),36.7(C)，31.8(CH),24.5(CH),32.0(CH2),28.3(CH2),27.5(CH2),25.1(CH2),23.7(CH3),17.2(CH2),7.2(CH2)。
（2）将实施例7.（1）得到的特拉匹韦6.28克加入到一个250ml单口瓶中，加入60ml丙酮，慢慢加热直到溶解，滴加25ml去离子水，放置到室温，慢慢析出白色固体。将该固体过滤，用去离子水洗涤，真空干燥，得到特拉匹韦5.48克，用HPLC检测得纯度99.46%，总收率80.7%。
13CNMR：(200MHz,CDCl3)：δ=197.5(C),172.7(C),171.0(C),171.0(C),160.7(C),159.9(C),147.1(CH),145.0(C),144.7(CH),142.9(CH),62.6(CH),58.6(CH),53.7(CH),53.4(CH),42.9(CH2),39.4(CH),37.8(CH),36.7(C)，31.8(CH),24.5(CH),32.0(CH2),28.3(CH2),27.5(CH2),25.1(CH2),23.7(CH3),17.1(CH2),7.2(CH2)。
（3）将实施例7.（1）得到的特拉匹韦6.28克加入到一个250ml单口瓶中，加入60ml乙酸乙酯，慢慢加热直到溶解，加入60ml正己烷，放置到室温，慢慢析出白色固体。将该固体过滤，用正己烷洗涤，真空干燥，得到特拉匹韦5.60克，用HPLC检测得纯度99.18%，总收率82.47%。
13CNMR：(200MHz,CDCl3)：δ=197.6(C),172.6(C),171.1(C),171.0(C),160.8(C),159.8(C),147.1(CH),145.0(C),144.7(CH),142.9(CH),62.7(CH),58.6(CH),53.7(CH),53.4(CH),42.8(CH2),39.4(CH),37.8(CH),36.7(C)，31.8(CH),24.5(CH),32.0(CH2),28.3(CH2),27.5(CH2),25.1(CH2),23.7(CH3),17.3(CH2),7.2(CH2)。
（4）将实施例7.（1）得到的特拉匹韦6.28克加入到一个250ml单口瓶中，加入60ml丙酮，慢慢加热直到溶解，加入60ml正己烷，放置到室温，慢慢析出白色固体。将该固体过滤，用正己烷洗涤，真空干燥，得到特拉匹韦5.35克，用HPLC检测得纯度99.2%，总收率78.79%。
13CNMR：(200MHz,CDCl3)：δ=197.7(C),172.8(C),171.1(C),171.0(C),160.9(C),159.9(C),147.1(CH),145.0(C),144.7(CH),142.8(CH),62.6(CH),58.6(CH),53.7(CH),53.4(CH),42.9(CH2),39.4(CH),37.8(CH),36.7(C)，31.9(CH),24.5(CH),32.0(CH2),28.3(CH2),27.5(CH2),25.1(CH2),23.6(CH3),17.2(CH2),7.1(CH2)。
（5）（1）将实施例7.（2）得到的特拉匹韦6.28克加入到一个250ml单口瓶中，加入60ml甲醇，慢慢加热直到溶解，滴加20ml去离子水，放置到室温，慢慢析出白色固体。将沉淀过滤，用去离子水洗涤，真空干燥，得到特拉匹韦5.56克，用HPLC检测得纯度99.5%，计算得总收率81.9%。
13CNMR：(200MHz,CDCl3)：δ=197.4(C),172.7(C),171.0(C),171.1(C),160.8(C),159.7(C),147.1(CH),145.0(C),144.7(CH),142.8(CH),62.6(CH),58.6(CH),53.7(CH),53.4(CH),42.9(CH2),39.4(CH),37.8(CH),36.7(C)，31.8(CH),24.5(CH),32.0(CH2),28.3(CH2),27.5(CH2),25.1(CH2),23.8(CH3),17.2(CH2),7.4(CH2)。
比较例1‑2
按与上述相同的方法制得实施例7.（1）和实施例7.（2）中的特拉匹韦，然后将其通过快速薄层色谱法纯化测得，由实施例7.（1）的特拉匹韦制得的特拉匹韦的纯度为80%，算得其总收率66%；由实施例7.（2）中的特拉匹韦制得的特拉匹韦的纯度为85%，算得其总收率70%。
虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。