一种用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102876562 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102876562 A *CN102876562A* (21)申请号 201210368780.6 (22)申请日 2012.09.27 C12M 1/00(2006.01) C12M 1/34(2006.01) (71)申请人 大连大学 地址 116622 辽宁省大连市经济技术开发区 学府大街 10 号 (72)发明人 郑国侠 李雅杰 王云华 魏俊峰 (74)专利代理机构 大连智慧专利事务所 21215 代理人 周志舰 (54) 发明名称 一种用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微 流控芯片系统 (。

2、57) 摘要 本发明目的在于提供一种用于海洋微藻培养 和增殖行为研究的微流控芯片系统， 通过规模集 成芯片的制作和芯片上多种单元技术的灵活组 合， 将海洋微藻的接种、 分批培养、 半连续恒化培 养、 海洋微藻种群增殖行为的在线监测过程集成 在一块功能芯片上完成 ； 该系统由两个基本单元 构成 ： 第一个基本单元为海洋微藻培养和增殖行 为研究微流控芯片， 第二个基本单元为海洋微藻 培养和增殖行为研究微流控芯片外围设备。其优 点在于高通量、 操作简便和低成本， 是一种进行海 洋微藻培养、 种群增殖研究和以微藻作为试验对 象的相关研究领域的新平台。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书。

3、 4 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 7 页 1/1 页 2 1. 一种用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 其特征在于 ： 该微流控 芯片系统将海洋微藻的接种、 分批培养、 半连续恒化培养、 海洋微藻种群增殖行为的在线监 测过程集成在一块功能芯片上完成 ； 该系统由两个基本单元构成 ： 第一个基本单元为海洋 微藻培养和增殖行为研究微流控芯片， 第二个基本单元为海洋微藻培养和增殖行为研究微 流控芯片外围设备 ； 其中海洋微藻培养和增殖行为研究微流控芯片单元由采用聚二甲基硅氧烷材料软刻 蚀及不可逆。

4、封接技术构建的多层微流控芯片， 分为三部分 ： 第一部分为芯片下层， 具有通过 软刻蚀技术产生液体流路通道 ； 第二部分为芯片上层， 具有微藻培养室、 细胞接种入口、 培 养液入口和废液出口 ； 第三部分为中间层， 包括五块微孔膜， 位于芯片上层与下层之间， 分 别对应于微藻培养室位置处。 2. 按照权利要求 1 所述的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片， 其特征在 于 ： 所述芯片上层与下层使用的材料为聚二甲基硅氧烷。 3. 按照权利要求 1 所述的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片， 其特征在 于 ： 所述微藻培养室以微孔膜为基底， 并通过微孔膜与芯片下层流路通道联通。 4。

5、. 按照权利要求 1 或 3 所述的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片， 其特 征在于 ： 所述微孔膜为聚碳酸酯膜， 孔径为 1 微米。 5. 按照权利要求 1 所述的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片， 其特征在 于 ： 所述芯片下层液体流路通道的宽度为 200 微米， 要求在与芯片上层微藻培养室对应位 置处有圆形液池结构， 该液池与微藻培养室直径相同， 该直径尺寸为 4 厘米。 6. 按照权利要求 1 所述的海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 其特征在 于 ： 所述微流控芯片外围设备由微量注射泵连接培养液入口， 并分别以推进和抽取的方式 实现培养液的平行供给和更换。

6、。 7. 按照权利要求 1 所述的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片， 其特征在 于 ： 所述芯片微藻培养室可以实现分批培养和半连续恒化培养两种微藻培养方式。 8. 按照权利要求 1 或 7 所述的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 其特征在于 ： 所述微藻培养单室同时也做为微藻实时观测单元， 可同时实现各种类型微藻 的培养和微藻种群增殖行为的在线监测。 权 利 要 求 书 CN 102876562 A 2 1/4 页 3 一种用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统 技术领域 0001 本发明主要涉及微流控芯片， 特别提供了一种海洋微藻培养和增殖行为研究的微 流控。

7、芯片系统。 背景技术 0002 微流控芯片实验室作为本世纪一项重要的科学技术已经在包括化学、 生物学、 医 学等多个领域展现了其独特的优势。 因其同细胞尺寸匹配、 环境同生理环境相近、 传热传质 快、 通量高可以集成等特点而成为新一代细胞研究的重要平台， 随着近二十年的发展， 基于 微流控芯片系统的细胞研究已经有所突破， 相关细胞操作已基本都可在芯片上实现。 0003 海洋微藻作为较原始的单细胞生物是海洋的基础生产者， 在海洋生态系统的能流 和物质流循环中起到至关重要的作用， 并通过其光合作用和代谢过程从而与全球变暖、 酸 雨等全球性环境问题相偶联。此外， 由于其品系特征突出、 地理分布广发、。

8、 易于培养等优势 而被广泛应用于细胞工程、 毒理研究、 药物筛选等领域。目前， 上述研究领域的常规实验室 研究方法基本是通过前期微藻培养和后期生理检测相结合， 工作量大， 实验过程繁琐并且 细胞和试剂消耗大。 微流控芯片与微藻尺寸匹配， 适于构建微小的理化环境， 因此将以微藻 作为对象的高通量的、 实时观测研究变为可能。 随着研究的不断深入， 微流控芯片系统或可 成为微藻研究的重要平台技术之一， 为以微藻为研究对象的相关领域的如生物工程、 生态 毒理及环境污染评价等方面提供技术与理论的支持。 发明内容 0004 本发明的目的是通过微流控芯片的制作和芯片上多种单元技术的灵活组合， 将微 藻的分批。

9、培养、 半连续恒化培养和种群增殖行为的实时在线观测过程集成在一块芯片上完 成， 从而构建一种适于高通量、 细胞及试剂消耗量低， 操作简便的微流控芯片系统， 为以微 藻为研究对象的相关领域的如生物工程、 生态毒理及环境监测等方面提供技术与理论的支 持。 0005 本发明提供了一种用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 该芯片 系统由两个基本单元构成， 第一个基本单元为微流控芯片 ； 第二个基本单元为微流控芯片 外围设备。 0006 其中海洋微藻培养和增殖行为研究微流控芯片单元由采用聚二甲基硅氧烷材料 软刻蚀及不可逆封接技术构建的多层微流控芯片， 分为三部分 ： 第一部分为芯片下层， 具。

10、有 通过软刻蚀技术产生液体流路通道 ； 第二部分为芯片上层， 具有微藻培养室、 细胞接种入 口、 培养液入口和废液出口 ； 第三部分为中间层， 包括五块微孔膜， 位于芯片上层与下层之 间， 分别对应于微藻培养室位置处。 0007 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所述微流控 芯片使用的材料为聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 。 0008 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所诉芯片微 说 明 书 CN 102876562 A 3 2/4 页 4 藻培养室以微孔膜为基底， 并通过微孔膜与芯片下层流路通道联通 ； 其中， 所选微孔膜为聚 碳酸酯膜，。

11、 其特征在于 ： 生物粘附性低， 以其作为培养室基底， 可减少细胞贴壁现象， 较好的 维持细胞的悬浮状态， 省略微藻常规实验室培养中的摇瓶步骤 ； 所选微孔膜孔径为 1 微米， 要求小于所培养微藻直径， 以便在更换培养液时对微藻细胞进行拦截。 0009 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所述芯片下 层液体流路通道的宽度为 200 微米， 要求在与芯片上层微藻培养室对应位置处有圆形液池 结构， 该液池与微藻培养室直径相同， 该直径尺寸为 2 厘米。 0010 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所述微流控 芯片外围设备为微量注射泵， 微量注射。

12、泵与微流控芯片上层的培养液入口处相连， 分别以 推进和抽取的方式实现培养液的平行供给和更换。 0011 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所诉芯片微 藻培养室可以实现分批培养和半连续恒化培养两种微藻培养方式。 0012 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所述微藻培 养单室同时也做为微藻实时观测单元， 可同时实现各种类型微藻的培养和微藻种群增殖行 为的在线观测。 0013 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 通过模集成 芯片的制作和芯片上多种单元技术的灵活组合， 将微藻的分批培养、 半连续恒化培养和种 群增殖行为的。

13、实时在线观测过程集成在一块芯片上完成 ； 该系统基本由两部分基本单元构 成 ： 第一个基本单元为海洋微藻培养和增殖行为研究微流控芯片， 第二个基本单元为海洋 微藻培养和增殖行为研究微流控芯片外围设备。 0014 其中， 用于海洋微藻培养和增殖行为研究微流控芯片采用 PDMS 软刻蚀及不可逆 封接技术构建的双层微流控芯片 ： 芯片下层为液体流路层 ； 芯片上层具有微藻培养室、 细 胞接种入口、 培养液入口和废液出口结构 ； 芯片上层与下层之间， 在微藻培养室处以微孔膜 隔开 ； 微藻培养室为 54 细胞培养池阵列， 可完成多组平行试验 ； 微藻培养室同时也做为 微藻实时观测单元可同时实现各种类型。

14、微藻的培养和微藻种群增殖实时在线观测功能 ； 微 藻培养室以微孔膜作为基底， 在维持细胞悬浮状态、 拦截细胞的同时， 可以实现培养液的供 给 ； 培养液的添加是通过芯片上层中心处培养液入口外接微量注射泵， 并以推进的方式维 持培养液的平行供给。 0015 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片系统， 所述微流控 芯片外围设备是用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片实现各功能的外部支持 及微藻种群增殖行为分析的检测装置， 主要包括微量注射泵、 荧光倒置显微镜及相关分析 软件等。 0016 本发明提供的用于海洋微藻培养和增殖行为研究的微流控芯片， 其优点在于 ： 高 通量、 操。

15、作简便和成本低， 是一种进行海洋微藻培养、 种群增殖研究和以微藻作为试验对象 的相关研究领域的新平台。 附图说明 0017 图 1 为微流控芯片结构示意图， 其中， 1 为芯片上层， 2 为微孔膜 （5） ， 3 为芯片下 层， 4 为培养液入口， 5 为废液出口 （5） ； 说 明 书 CN 102876562 A 4 3/4 页 5 图 2 为微流控芯片平面俯视图， 其中 4 为培养液入口， 5 为废液出口 （5） ， 6 为细胞接 种入口 （52） ， 7 为微藻培养室 （54） ， 8 为液体流路通道 ； 图 3 亚心扁藻芯片分批培养种群增殖结果图 ； 图 4 青岛大扁藻芯片分批培养种。

16、群增殖结果图 ； 图 5 三角褐指藻芯片分批培养种群增殖结果图 ； 图 6 小球藻芯片分批培养种群增殖结果图 ； 图 7 紫球藻芯片分批培养种群增殖结果图 ； 图 8 亚心扁藻芯片分批培养与半连续恒化培养种群增殖结果对照图 （a） 分批培养 （b） 恒化培养 ； 具体实施方式 0018 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发明。 0019 实施例 1 利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统， 构型如图 1 和图 2 所示， 接种微藻， 本 实施例选用亚心扁藻， 绿藻门， 中国沿海常见优势种， 接种密度为在 104cell/mL 以上。培 养方式为分批培养， 即一次性添。

17、加培养液之后， 培养期间不再更换营养成分， 培养周期为 9 天。培养液采用 f 2 营养液配方， 培养条件为温度 20 1， 明暗周期 12h ： 12 h， 光源 为白色日光灯， 照度为 60 mol photon m-2.s-1。每 24h 对芯片培养室内微藻进行显微镜 拍照， 为增加微藻辨识度， 采用激光诱导荧光模式， Image Pro 软件细胞计数分析， 在线观 测其种群增殖行为。其结果如图 3 所示， 亚心扁藻在芯片上细胞生长状态良好， 种群增殖趋 势与自然状态下营养盐一次性供给或常规分批培养方式的趋势基本一致， 呈现 “S” 形曲线。 根据其增殖趋势进行曲线拟合， 发现与 Ric。

18、hards 模型呈现较好的符合关系， 拟合优度大于 0.99。 0020 实施例 2 利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统， 构型如图 1 和图 2 所示， 接种微藻， 本 实施例选用青岛大扁藻， 绿藻门， 中国沿海常见优势种， 接种密度为在 104cell/mL 以上， 分 批培养， 培养周期为 9 天。培养液采用 f 2 营养液配方， 培养条件为温度 20 1， 明 暗周期 12h ： 12 h， 光源为白色日光灯， 照度为 60 mol photon m-2.s-1。每 24h 对芯片培 养室内微藻进行显微镜拍照， 为增加微藻辨识度， 采用激光诱导荧光模式， Image Pro 软件。

19、 细胞计数分析， 在线观测其种群增殖行为。其结果如图 4 所示， 亚心扁藻在芯片上细胞荧光 明亮， 生长状态良好， 根据其增殖趋势进行曲线拟合， 发现与 Richards 模型呈现较好的符 合关系， 拟合优度大于 0.99。 0021 实施例 3 利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统， 构型如图 1 和图 2 所示， 接种微藻， 本 实施例选用三角褐指藻， 硅藻门代表种， 接种密度为在 104cell/mL 以上， 分批培养， 培养周 期为 9 天。培养液采用 f 2 营养液配方， 培养条件为温度 20 1， 明暗周期 12h ： 12 h， 光源为白色日光灯， 照度为 60 mol ph。

20、oton m-2.s-1。每 24h 对芯片培养室内微藻进行 显微镜拍照， 为增加微藻辨识度， 采用激光诱导荧光模式， Image Pro 软件细胞计数分析， 在线观测其种群增殖行为。其结果如图 5 所示， 三角褐指藻在芯片上细胞外观基本呈现梭 说 明 书 CN 102876562 A 5 4/4 页 6 形和三出形， 说明其生长状态良好。 0022 实施例 4 利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统， 构型如图 1 和图 2 所示， 接种微藻， 本 实施例选用小球藻， 绿藻门， 常见藻种， 在饵料科学、 海洋天然产物提取等方面都有着光泛 的应用。 接种密度为在104cell/mL以上。 培。

21、养方式为分批培养， 即一次性添加培养液之后， 培养期间不再更换营养成分， 培养周期为 9 天。每 24h 对芯片培养室内微藻进行显微镜拍 照， 为增加微藻辨识度， 采用激光诱导荧光模式， Image Pro 软件细胞计数分析， 在线观测 其种群增殖行为。其结果如图 6 所示， 培养期间小球藻在芯片上 持续维持增殖状态， 细胞生长状态良好， 对其进行 Richards 模型拟合， 拟合度大于 0.99。 0023 实施例 5 利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统， 构型如图 1 和图 2 所示， 接种微藻， 本 实施例选用紫球藻， 红藻门唯一单细胞藻类， 其细胞活性物质被广泛应用于医药和美容。

22、行 业。 接种密度为在104cell/mL以上。 培养方式为分批培养， 即一次性添加培养液之后， 培养 期间不再更换营养成分， 培养周期为 9 天。每 24h 对芯片培养室内微藻进行显微镜拍照， 为 增加微藻辨识度， 采用激光诱导荧光模式， Image Pro 软件细胞计数分析， 在线观测其种群 增殖行为。其结果如图 7 所示， 紫球藻在芯片上细胞生长状态良好， 少有结团现象， 根据其 增殖趋势进行曲线拟合， 发现与 Richards 模型呈现较好的符合关系， 拟合优度大于 0.99。 0024 实施例 6 利用实验室自行设计并制作的微流控芯片系统， 构型如图 1 和图 2 所示， 接种微藻，。

23、 本实施例选用亚心扁藻。接种密度为在 105cell/mL 以上， 恒化培养， 培养周期为 15 天， 每隔 24h 更换培养室 1/2 体积培养液， 培养液采用 f 2 营养液配方， 培养条件为温度 20 1， 明暗周期 12h ： 12 h， 光源为白色日光灯， 照度为 60 mol photon m-2.s-1。每 24h 对芯片培养室内微藻进行显微镜拍照， 为增加微藻辨识度， 采用激光诱导荧光模式， Image Pro 软件细胞计数分析， 在线观测其种群增殖行为。其结果如图 8 所示， 亚心扁藻在 芯片分批培养条件下， 种群增殖呈 “S” 曲线， 尤其到培养后期， 种群增殖开始进入迟滞。

24、状态 ； 亚心扁藻在芯片半连续恒化培养条件下， 种群增殖一直保持线性趋势。说明所构建培养室 可以实现海洋微藻的高密度培养和长期培养， 为芯片平台的进一步应用创造条件。 说 明 书 CN 102876562 A 6 1/7 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 7 2/7 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 8 3/7 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 9 4/7 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 10 5/7 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 11 6/7 页 12 图 7 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 12 7/7 页 13 图 8 说 明 书 附 图 CN 102876562 A 13 。