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1、(10)申请公布号 CN 102787118 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102787118 A *CN102787118A* (21)申请号 201110124292.6 (22)申请日 2011.05.16 C12N 15/13(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 孙毅 地址 215219 江苏省苏州市高新区泰山路 2 号博济科技创业园苏州爱特博德生物 科技有限公司 申请人 曾桥 史占平 梁爱斌 (72)发明人 孙毅 曾桥 史占平 梁爱斌 (54) 发明名称 一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗 体可变区获取方法 (。
2、57) 摘要 本发明提供一种结合 SOLID 测序和单细胞 RT-PCR 的人抗体可变区获取方法。通过细胞表 面分子标记筛选表达特异抗体的单细胞， 将单细 胞 mRNA 进行一次反转录， 获得 cDNA 序列， 然后 用我们设计的 IgG/M 特异引物群进行一次 PCR 扩增， 以扩增的产物作为模板， 再用 SOLID 测序 引物 (Barcoded Primers) 进行一次 PCR。最后 取 Barcoded Primers 扩增产物作为模板， 进行 SOLID 测序， 测序的结果进行生物信息学分析， 即 可获得人类抗体可变区基因序列。本发明可广泛 用于获取多种疾病中特异性抗体的重链和轻链。
3、可 变区序列， 其快速， 高效的优势为全人源化抗体药 物的生产提供了一个有效手段。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种结合 SOLID 测序和单细胞 RT-PCR 的人抗体可变区获取方法， 其特征在于， 所述 方法步骤如下 ： (1) 从特异免疫力供体获取抗凝外周血 ； (2) 分离外周血单核细胞 (PBMCs) ； (3) 以 CD3-和 CD19+为 gate 对 PBMCs 进行初次分选 ； (4) 以 CD27h。
4、igh和 CD38high为 gate 对初次分选的细胞再次分选 ； (5) 获取具有抗体分泌功能的浆细胞， 并稀释成单细胞 ； (6) 裂解单细胞并进行反转录获得单细胞 cDNA 序列 ； (7)IgG/M 特异引物 PCR 扩增 ； (8)Barcode Primer 测序引物 PCR 扩增 ； (9)SOLID 芯片测序， 生物信息学分析， 获得抗体可变区基因序列。 权 利 要 求 书 CN 102787118 A 2 1/3 页 3 一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取 方法 技术领域 0001 本发明涉及人类特异性抗体可变区序列获取技术领域， 特别涉及一种结合。
5、 SOLID 测序和单细胞 RT-PCR 的人抗体可变区获取方法。 背景技术 0002 从2002年的SARS大规模爆发， 到2008年EV71病毒引发的手足口病， 再到2009年 墨西哥甲型 H1N1 流感病毒引发的全球流感大流行， 一旦爆发它们就很快在大范围内或全 球蔓延。常规的抗病毒药物开发是一个漫长的过程， 无法在短时间内满足需要。而且， 这些 感染病菌的变异之快， 使得我们在短时间内找到行之有效的防控办法变得越来越困难。对 于这类病原体引发的爆发性、 流行性疾病， 非常迫切需要在很短时间内找到有效的预防和 治疗方法。抗体治疗已成为多种疾病特异性治疗的新型手段和发展方向。尤其是全人源化。
6、 单克隆抗体与人体结合性最好， 也是最安全和有效的单克隆抗体， 必将代表未来抗体治疗 的发展方向。 0003 目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、 基因工程小鼠制备全人抗体、 转 染色体牛。 0004 抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。 0005 噬菌体抗体库技术 ： 从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因 ； PCR扩增 抗体全套基因片段 ( 如 VH、 VL)， 将体外扩增的 VH、 VL 基因片段随机克隆入相应载体， 形成 组合文库 ； 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因III(g3)或基因VIII(g8)的先导 系列下游， 使外源基因表达的多肽以融合。
7、蛋白的形式展示在外壳蛋白gp III或gp VIII的 N 端。用固相化抗原经 “亲和结合 - 洗脱 - 扩增” 数个循环筛选出表达特异性好、 亲和力强 的抗体噬菌体库。 0006 核糖体展示技术 ： 将基因型和表型联系在一起， 编码蛋白的 DNA 在体外进行转录 与翻译， 由于对 DNA 进行了特殊的加工与修饰， 如 ： 去掉 3末端终止密码子， 核糖体翻译到 mRNA 末端时， 由于缺乏终止密码子， 停留在 mRNA 的 3末端不脱离， 从而形成蛋白质 - 核 糖 -2mRNA 三聚体， 将目标蛋白特异性的配基固相化， 如 ： 固定在 ELISA 微孔或磁珠表面， 含 有目标蛋白的核糖体三。
8、聚体就可在 ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出， 对筛选分离得到的复 合物进行分解， 释放出的 mRNA 进行逆转录酶链聚合反应 (RT-PCR)， PCR 产物进入下一轮循 环， 经过多次循环， 使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。 0007 上述全人源化抗体技术中， 制备和生产流程复杂， 需要时间和周期漫长， 无法适用 于某些突发、 流行性疾病的抗体药物的研发和生产， 且对某些病原体或抗原快速变异方面 显得无能为力。人源化抗体最关键的技术在于特异抗体可变区基因序列的扩增。由于每个 抗原有很多抗原决定簇， 机体免疫系统会针对不同的抗原决定簇产生不同的抗体， 而且根 据抗原决定簇的不同。
9、， 所产生抗体与抗原的结合能力和抗体的效价也不相同。 因此， 要从成 千上万的抗体中将效价高， 结合能力强的特异抗体的可变区基因挑选出来， 传统方法的工 说 明 书 CN 102787118 A 3 2/3 页 4 作量可想而知。 发明内容 0008 为了克服现有技术存在的不足， 本发明提供一种结合 SOLID 测序和单细胞 RT-PCR 的人抗体可变区获取方法， 旨在结合传统的RT-PCR技术和高效的SOLID测序技术快速获得 人类抗体可变区序列。 0009 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0010 一种结合 SOLID 测序和单细胞 RT-PCR 的人抗体可变区获取方法， 。
10、其具体步骤如 下 ： 0011 (1) 从特异免疫力供体获取抗凝外周血 ； 0012 (2) 分离外周血单核细胞 (PBMCs) ； 0013 (3) 以 CD3-和 CD19+为 gate 对 PBMCs 进行初次分选 ； 0014 (4) 以 CD27high和 CD38high为 gate 对初次分选的细胞再次分选 ； 0015 (5) 获取具有抗体分泌功能的浆细胞， 并稀释成单细胞 ； 0016 (6) 裂解单细胞并进行反转录获得单细胞 cDNA 序列 ； 0017 (7)IgG/M 特异引物 PCR 扩增 ； 0018 (8)Barcoded Primers 测序引物 PCR 扩增 。
11、； 0019 (9)SOLID 芯片测序， 生物信息学分析， 获得抗体可变区基因序列。 0020 本发明带来的有益效果是 ： 提供了一个良好的技术平台， 可广泛用于获取多种传 染性 / 感染性、 肿瘤性疾病、 自身免疫性疾病中特异性抗体的重链和轻链可变区序列。特别 是针对某些突发、 重大流行性疾病， 如 SARS、 禽流感等疾病时， 该技术更能体现出其快速， 高 效的优势。此外， 本发明也为全人源化抗体药物的生产提供了一个有效手段。 附图说明 0021 图 1 为人类抗体可变区扩增图 具体实施方式 0022 下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述， 以使本发明的优点和特征能 更易于被本领。
12、域技术人员理解， 从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。 0023 本发明的具体实施例为 ： 从具有特异免疫力的供体中获取抗凝外周血， 分离外周 血单核细胞 (PBMCs)， 首先以 CD3-、 CD19+为 gate 用流式细胞仪分选活的 PBMCs， 然后以 CD27high、 CD38high为gate对初次分选的细胞进行再分选， 最终获得具有抗体分泌功能的浆细 胞。将获得的浆细胞稀释成单个细胞， 然后， 经细胞裂解液裂解， 将单细胞 mRNA 进行一次反 转录， 获得 cDNA 序列， 然后用我们设计的 IgG/M 特异引物群进行一次 PCR 扩增， 以扩增的产 物作为模板， 。
13、再用 SOLID 测序引物 (Barcoded Primers) 进行一次 PCR。该引物能同时携带 96个不同标记， 即一次可以做96个不同细胞。 最后我们取这些带有标记的扩增产物作为模 板， 进行SOLID测序。 这里的测序芯片可以分为单分区芯片， 4分区芯片和8分区芯片， 每个 分区最多可以测序 96 个细胞， 8 分区芯片一次可以测序 768 个细胞。最后将测序的结果进 行生物信息学分析， 即可获得如图 1 所示的人类抗体可变区基因序列。 说 明 书 CN 102787118 A 4 3/3 页 5 0024 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内， 可不经过创造性劳动想到的变化或 替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应该以权利要求书所限 定的保护范围为准。 说 明 书 CN 102787118 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102787118 A 6 。