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1、(10)申请公布号 CN 102787147 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102787147 A *CN102787147A* (21)申请号 201210316992.X (22)申请日 2012.08.31 C12P 17/12(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 南京工业大学 地址 211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路 30 号 (72)发明人 曹飞 黄荣醒 武红丽 周佳栋 张煜 姚琴 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一种酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法 。
2、(57) 摘要 本发明公开了一种酶法制备 L- 二氢乳清酸 的方法。该方法包括下列步骤 ： 采用氰酸盐和 L- 天冬氨酸及其盐为原料， 在碱性条件下进行反 应， 形成 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸 ； 以二氢乳清酸 酶或含有二氢乳清酸酶的菌体为催化剂， 在弱酸 性条件下， 催化 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸环合制备 L- 二氢乳清酸 ； 将所得二氢乳清酸酶转化溶液经 分离， 浓缩， 结晶得 L- 二氢乳清酸。本方法采用 二氢乳清酸酶催化 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸制备 L- 二氢乳清酸， 原料制备、 反应体系简单， 产物分 离容易， 避免了化学合成方法中原料的难以获取 的缺点， 二氢乳。
3、清酸酶活性高、 反应时间短。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 一种酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于包括下列步骤 ： 1） 以氰酸盐、 L- 天冬氨酸或者 L- 天冬氨酸盐为原料， 在碱性条件下进行反应， 形成 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸， 氰酸盐与 L- 天冬氨酸或者 L- 天冬氨酸盐的摩尔比为 11.4:1 ； 2） 以二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的菌体为催化剂， 在弱酸性条件下， 催化步骤 1)。
4、 得到的 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸环合得到含 L- 二氢乳清酸的溶液 ； 3） 将所得含 L- 二氢 乳清酸的溶液分离， 浓缩， 结晶， 获得 L- 二氢乳清酸。 2. 根据权利要求 1 所述的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于步骤 1） 中， 所述 的 L- 天冬氨酸盐为 L- 天冬氨酸的钠、 钾盐中的任意一种。 3. 根据权利要求 1 所述的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于步骤 1） 中， 所述 的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。 4. 根据权利要求 1 所述的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于步骤 1） 中， 所述 的碱性条件为 pH8.510.0。 。
5、5. 根据权利要求 1 所述的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于步骤 2） 中， 所述的菌体为大肠杆菌 K-12 ； 所述的二氢乳清酸酶为含有二氢乳清酸酶基因 pET-22b(+)-DHO-his 质粒的重组菌株E.coliRosetta(DE3) 所表达、 纯化的二氢乳清酸酶。 6. 根据权利要求 1 所述的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于步骤 2） 中， 所述 的弱酸性条件为 pH2.04.0。 7. 根据权利要求 1 所述的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 其特征在于步骤 2） 中， 二氢 乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的菌体与 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸的重。
6、量比为 1:180。 权 利 要 求 书 CN 102787147 A 2 1/4 页 3 一种酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种酶法制备 L- 二氢乳清酸 （1） 的方法。 背景技术 0002 L- 二氢乳清酸， 结构式如下 ： 0003 0004 又名二氢 -L- 乳清酸 L-4,5- 二氢乳清酸 ； L-2,6- 二氧六氢 -4- 嘧啶羧酸 ； L- 六 氢-2,6-二氧-4-嘧啶羧酸， 是生物合成嘧啶类核苷酸碱基如胸腺嘧啶、 尿嘧啶、 胞嘧啶、 羟 甲基胞嘧啶的重要前体， 也是合成抗肿瘤类药物合成的重要中间体。 0005 目前， 报道的 L- 二氢乳清。
7、酸制备方法主要有提取法、 化学合成法。Miller 等采用 N- 羧乙氧基天冬酰胺为原料， 在乙醇钠为催化剂的作用下， 环合成为二氢乳清酸钠盐， 盐 酸中和后结晶获得二氢乳清酸， 该方法根据使用原料不同可以获得 L、 D、 DL- 二氢乳清酸， 但该方法所需原料 N- 羧乙氧基天冬酰胺复杂， 需要多步反应制备获得， 反应中使用的乙 醇钠也不易获取 （US 2,753,347） ； U米尔伯特等公开了利用一种通过在阴离子交换材料， 在碱水混合物中、 约1.1MPa至约40MPa压力下进行层析得到L-二氢乳清酸的方法。 该方法 可以用来研究 N-4（三氟甲基苯基） -5- 甲基异噁唑 -4- 甲酰。
8、胺、 N-4（三氟甲基苯基） -2- 氰 基 -3- 羟基丁烯酰胺及类似化合物的体内和体外活性 （ZL98812046.1） 。 0006 二氢乳清酸酶(DHOase， EC 3.5.2.3)属于环酰胺水解酶类， 能够催化L-二氢乳清 酸 （L-DHO） 水解生成 N- 氨基甲酰 L- 天冬氨酸 （L-CA)， 是嘧啶核苷酸从头生物合成中的第 三步关键酶。 该酶活性中心处含两个金属锌离子， 当二氢乳清酸结合在活性中心， 其羰基上 的氧原子被连接在 位的金属锌离子上， 羰基被极化 ； 活性中心处羟基亲核攻击， 二氢乳 清酸， 形成一个连接两金属离子、 二氢乳清酸以及酶的活性基团的四面体中间物 ；。
9、 进一步使 酰胺键断裂导致四面体复合物的解体形成氨甲酰天冬氨酸。 由于该酶处于嘧啶核苷酸生物 合成途径中的关键步骤， 因此， 以该酶为靶标， 设计二氢乳清酸的抑制剂在在抗癌和抗疟疾 药物的筛选中具有重要的用途 ； 同时， Schroeder 等利用其水解作用， 催化水解开环心血管 药物右丙亚胺获取活性中间体。 0007 虽然， 目前二氢乳清酸酶的研究主要集中在水解反应上， 但在生物体内， 该酶催化 过程是可逆的。即在碱性条件下， 有利于水解反应进行， 而调整 pH 为酸性条件时， 则可实现 N-氨基甲酰L-天冬氨酸到L-二氢乳清酸方向转化。 目前尚无利用二氢乳清酸酶逆向催化 环合活性制备 L-。
10、 二氢乳清酸的报道。 发明内容 说 明 书 CN 102787147 A 3 2/4 页 4 0008 本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法。 0009 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ： 0010 一种酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法， 包括下列步骤 ： 0011 （1） L- 天冬氨酸及其盐制备 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸。 0012 以氰酸盐和 L- 天冬氨酸及其盐为原料， 氰酸盐与天冬氨酸的摩尔比为 11.4:1， 在碱性条件下进行反应， 形成 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸 （3） 。 0013 0014 其中， 所述的 L- 天冬氨。
11、酸及其盐为 L- 天冬氨酸、 L- 天冬氨酸的钠、 钾盐中的任 意一种。所述的氰酸盐为氰酸钠或氰酸钾。所述的碱性条件下反应条件为 pH8.5 10.0、 6080、 搅拌反应 13h， 调碱所适用的碱可以是氢氧化钠或是氢氧化钾。 0015 （2） N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸经二氢乳清酸酶催化环合制备 L- 二氢乳清酸。 0016 以二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的湿菌体为催化剂， 在弱酸性条件下， 催化 环合 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸 （3） 制备 L- 二氢乳清酸 （1） 。 0017 0018 其中， 所述的菌体为含有二氢乳清酸酶的大肠杆菌 K-12（Escherichia co。
12、li K-12， 中国工业微生物菌种保藏管理中心， 编号 CICC20091) ； 所述的二氢乳清酸酶为含有 二氢乳清酸酶基因pET-22b(+)-DHO-his质粒的重组菌株E.coli Rosetta(DE3)所表达、 纯 化的二氢乳清酸酶。所述的弱酸性条件为 pH2.04.0， 酶或湿菌体与 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨 酸的重量比为 1:180。催化水解反应温度为 3540， 反应时间 1015 分钟。 0019 （3） 将所得 L- 二氢乳清酸溶液分离， 浓缩， 结晶。 0020 取酶反应后的反应液， 加入三氯乙酸后使酶失活， 离心除去蛋白或菌体， 然后减压 蒸发结晶， 无水乙醇重结。
13、晶， 得 L- 二氢乳清酸晶体。 0021 有益效果 ： 0022 本发明利用二氢乳清酸酶的逆向环合过程， 催化环合N-氨甲酰-L-天冬氨酸制备 L- 二氢乳清酸， 开发出一种新的、 简便的、 易于规模化制备 L- 二氢乳清酸的新方法， 避免了 化学合成方法中原料的难以获取的缺点。 0023 本发明的酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法与其他制备方法相比有如下优点 ： 0024 1、 采用二氢乳清酸酶催化 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸制备 L- 二氢乳清酸， 原料制备、 反应体系简单， 产物分离容易。 0025 2、 二氢乳清酸酶活性高、 反应时间短。 说 明 书 CN 102787147 A 。
14、4 3/4 页 5 具体实施方式 0026 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 反应条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。 0027 实施例 1 ： N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸的合成 I。 0028 L- 天冬氨酸 （0.1mol） 与氰酸钾 (0.10mol) 溶于水中， 用 0.5molL-1氢氧化钾溶 液调节 pH=10.0， 75搅拌反应 2h， 调节 pH=12， 产生白色沉淀， 即产物 N- 氨甲酰 -L- 天 冬氨酸。产率 89.5%， m.p.169171。
15、， 1H NMR(DMSO-d6， 500MHz) ： 12.34(s， 2H， COOH)， 5.79(s， 1H， -NH)， 5.45(s， 2H， NH2)， 4.67(m， 1H， -CH)， 2.662.91(m， 2H， CH2) ； MS m/ z:175.1(M-1)-。 0029 实施例 2 ： N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸的合成 II。 0030 L- 天冬氨酸钠盐 （0.1mol） 与氰酸钠 (0.14mol) 溶于水中， 用 0.1molL-1氢氧化 钠溶液调节pH=8.5， 80搅拌反应2h， 调节pH=12， 产生白色沉淀， 即产物N-氨甲酰-L-天 冬氨酸。产。
16、率 82.7%（mp ： 168-170） 。 0031 实施例 3 ： 发酵产酶 I。 0032 将大肠杆菌 K-12（Escherichia coli K-12， 中国工业微生物菌种保藏管理中心， 编号 CICC20091) 接在新鲜斜面培养基 （斜面培养基 （g/L） ： 蛋白胨 10， 牛肉膏 3， NaCl 5， 琼脂 20） 上， 活化培养 24 小时， 接入种子培养基 （种子培养基 （g/L） ： 葡萄糖 15， 蛋白胨 20， K2HPO42， MgSO40.25） 在 33、 220r/min 振荡培养 20 小时。培养结束接入发酵培养基 （葡萄 糖2%、 蛋白胨1%、 酵母。
17、膏1%、 氯化钠0.3%、 磷酸二氢钾0.2%、 硫酸镁0.025%、 氯化钴0.005%， pH 7.0） ， 于 33、 200r/min， 发酵培养 24 小时。发酵结束后， 8000r/min 离心 25 分钟， 收集 湿菌体。 0033 实施例 4 ： 重组菌的获得。 0034 采 用 苯 酚 - 氯 仿 法 提 取 大 肠 杆 菌 K-12 的 总 DNA。 在 NCBI（National Center for Biotechnology Information） Genbank 数 据 库 中 搜 索 DHOase 基 因 的 相关信息， 根据大肠杆菌的二氢乳清酸酶基因保守序列设。
18、计保守引物， 正向引物为 ： （diho180-sens） CCCTGCTGGTGCACGGNGARGTNAC ，反 向 引 物 为 ：（diho300-anti ） CGGTGTAGCAGCCGGCRCANCCRCA， PCR 反应采用 TaKaRa 公司的 DNA 聚合酶进行扩增。PCR 扩 增条件为 ： 95 5min【95 30s (45、 50、 55 )30s 72 1min】 *30cycles72 10min 4 20h， 构建 PCR 产物 DHO 与 pMD18-T Vector 酶连的重组质粒 T-DHO， 连接体系参照产品 说明手册。连接产物转化大肠杆菌 DH5， 挑取。
19、氨苄抗性筛选平板上长出的单菌落， 接入含 100g/mL 氨苄青霉素的 5mL LB 液体培养基中， 37， 200rpm 摇床培养 10h12h 后进行质 粒提取， 小量质粒提取采用上海申能博彩公司的试剂盒， 电泳筛选阳性克隆。 0035 为了方便重组菌蛋白纯化， 构建重组表达载体所用的引物序列须把基因的终止密 码子去掉， 设计引物序列如下 ： 0036 DHOase-sense:5-TAAGAAGGAGATATACATATGAACTCTATTACCCTGCTCCAGC-3 0037 DHOase2-anti:5-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCACTTTTCTCCATTGC。
20、AGCGTT-3 0038 以已鉴定为阳性克隆的质粒为模板， 采用 TaKaRa LA 高保真 Taq 酶进行 PCR 扩增， PCR 扩增条件为 ： 95 5min(95 30s 65 30s 72 25s)*10cycles(95 30s 55 30s 说 明 书 CN 102787147 A 5 4/4 页 6 72 25s)*20cycles 72 10min 4 20h 0039 扩 增 产 物 采 用 CloneEZTMPCR Cloning Kit 进 行 目 的 基 因 与 表 达 载 体 pET-22b(+) 的重组克隆， 转化至表达宿主 E.coli Rosetta(DE3。
21、) 菌株获得带有重组质粒 pET-22b-DHO-his 的重组菌株。实施例 4 ： 发酵产酶 II。 0040 将带有重组质粒 pET22b-DHO-his 转化宿主菌 E.coli Rosetta(DE3)， 挑取单菌落 于 100g/mL 氨苄青霉素和 34g/mL 氯霉素的筛选培养液， 37振荡培养过夜。以 2% 的 接种量接种到新鲜 LB 培养液中 （含 100g/mL 氨苄青霉素和 34g/mL 氯霉素） ， 37培养 至OD600约为0.6时， 加入IPTG至终浓度0.4mmol/L， 诱导表达10h。 发酵结束后， 8000r/min 离心 25 分钟， 收集湿菌体。 0041。
22、 实施例 5 ： 酶提取。 0042 将实施例 4 中获得的重组菌株菌体， 用 pH 8.0 的 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲液洗涤 除杂后， 用上述缓冲液将其配制成质量分数 20% 的菌悬液。将上述配制好的菌悬液在 400W 功率的超声破碎仪下进行细胞破碎， 每次超声时间 3s， 间隔时间 5s， 共 10min， 每 30ml 菌悬 液超声 4 次。超声结束后， 10000rpm， 离心 10min 后收集上清液， 上样于预先用 0.2mol/L Tris-HCl 缓冲液平衡的 Ni2+-NTA Agarose 亲和柱。用大约 10 倍的缓冲液洗涤后， 再用洗 脱缓冲液 (20。
23、0mmol/L Tris-HCI， 5mol/L 咪唑， pH 8.0) 洗脱二氢乳清酸酶蛋白。 0043 实施例 6 ： 二氢乳清酸酶催化 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸制备 L- 二氢乳清酸。 0044 取实施例 1 或 2 得到的 N- 氨甲酰 -L- 天冬氨酸 5g（28.4mmol） 溶于 100mL 水中， 用 0.1molL-1稀盐酸调节 pH=3.0， 加入实施例 5 得到的酶溶液 （酶活 5.0IU） ， 混合均匀置 于水浴摇床反应 15min， 反应温度为 37。反应结束后， 用紫外分光光度计在 230nm 处测定 吸光值， L- 二氢乳清酸的转化率为 92%。 0045 。
24、实施例 7 ： L- 二氢乳清酸的提取和纯化。 0046 由实例 6 得到的 L- 二氢乳清酸的转化液， 加三氯乙酸 5mL， 8000rpm 离心除去酶蛋 白。透过液加入活性炭 （L- 二氢乳清酸质量比 2%） ， 70保温脱色 10min， 过滤， 滤液减压浓 缩至干， 加入无水乙醇， 过滤沉淀为 L- 二氢乳清酸。重结晶后得 L- 二氢乳清酸 3.28g。比 旋光度为 20D=+32.23 (c=2.0， 1% 碳酸氢钠溶液 )， m.p.254-255， 1H NMR(DMSO-d6， 500MHz) ： 12.57(s， 1H， COOH)， 10.13(s， 1H， 3-NH)， 。
25、7.79(s， 1H， 1-NH)， 4.08(m， 1H， -CH)， 2.562.89(m， 2H， CH2) ； MS m/z:157.1(M-1)-。 说 明 书 CN 102787147 A 6 1/2 页 7 序列表 南京工业大学 一种酶法制备 L- 二氢乳清酸的方法 4 PatentIn version 3.3 1 25 DNA 人工序列 misc_feature (17)(17) n is a, c, g, or t misc_feature (23)(23) n is a, c, g, or t 1 ccctgctggt gcacggngar gtnac 25 2 25 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102787147 A 7 2/2 页 8 misc_feature (20)(20) n is a, c, g, or t 2 cggtgtagca gccggcrcan ccrca 25 3 43 DNA 人工序列 3 taagaaggag atatacatat gaactctatt accctgctcc agc 43 4 45 DNA 人工序列 4 tggtggtgct cgagtgcggc cgccactttt ctccattgca gcgtt 45 序 列 表 CN 102787147 A 8 。