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1、(10)申请公布号 CN 102787085 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102787085 A *CN102787085A* (21)申请号 201210255862.X (22)申请日 2012.07.24 CCTCC NO ： 2012237 2012.06.24 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 海南大学 地址 570228 海南省海口市海甸岛人民大道 58 号 (72)发明人 黄小龙 周双清 黄东益 胡新文 (74)专利代理。
2、机构 海口翔翔专利事务有限公司 46001 代理人 莫臻 (54) 发明名称 一株山药内生利迪链霉菌 DOR3-2 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株山药内生利迪链霉菌 DOR3-2 及其在山药炭疽病生物防治中的应用， 本发明的山药内生利迪链霉菌 DOR3-2 保藏于 中国典型培养物保藏中心， 保藏编号 ： CCTCC NO:M2012237， 是从山药植株的根分离培养得 到。本发明所提供的利迪链霉菌 (Streptomyces lydicus) DOR3-2具有广谱的抗丝状真菌活性， 对 薯蓣科薯蓣属藤本植物尤其是山药炭疽病具有良 好的防治效果， 为山药的规模化生产提供技术支 持， 。
3、为山药的生物防治提供一条有效的防治途径。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一株山药内生利迪链霉菌， 命名为利迪链霉菌 DOR3-2， 保藏于中国典型培养物保藏 中心， 保藏日期 ： 2012 年 6 月 24 日 ； 保藏编号 ： CCTCC NO:M2012237。 2. 一种权利要求 1 所述的利迪链霉菌 DOR3-2 的应用， 其特征在于 ： 其在防治山药炭疽 病中的应用。 权 利 要 求 书 。
4、CN 102787085 A 2 1/6 页 3 一株山药内生利迪链霉菌 DOR3-2 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株山药内生利迪链霉菌及其应用， 特别涉及一株用于山药炭疽病生 物防治的山药内生利迪链霉菌 DOR3-2 及其应用。 背景技术 0002 山药 （Dioscorea opposita Thunb.） 又名淮山、 薯蓣， 为薯蓣科薯蓣属藤本植物， 是我国传统的中药材。 具有治疗肾虚病症、 高血压、 糖尿病、 哮喘、 神经衰弱和腰腿痛等药理 功效。山药营养丰富， 风味独特， 口感好， 不含任何有害物， 为当今世界绿色保健食品之王， 也是我国重要的特产出口蔬菜之一。 中国热。
5、带、 亚热带地区是山药的原产地和驯化中心， 目 前在我国大部分地区都有栽培。近年来， 随着山药栽培面积的扩大 , 山药上各种病害的发 生与危害也越趋频繁和严重 , 其中以炭疽病的危害最大 , 在一些山药种植地甚至造成山 药连片落叶、 枯死， 严重地影响了山药的产量和品质。目前报道的山药炭疽菌的病原菌， 有 辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)、 胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides) 和 薯 蓣 盘 长 孢 菌 (Gloeosporium pestis)，其 中 胶 孢 炭 疽 菌 (Colletotrichum gloeosporio。
6、ides)是引起山药炭疽病的主要病原菌。 对山药炭疽病的防治主要通过化学药 剂来预防， 一旦发病后很难控制 ； 此外， 化学防治污染较为严重， 化学农药残留影响山药品 质， 生物防治技术被认为是最具发展潜力的防治方法， 是当前生产上一条有效的防治途径。 0003 植物内生菌 （endophyte） 是指整个生活周期或大部分生活周期在植物体内度过的 微生物。 许多植物体内都含有内生菌， 内生菌能增强寄主植物的抗虫性、 抗病性、 抗旱性、 以 及生长和竞争能力。因此， 内生菌已逐渐被用作植物生物保护剂。利用植物内生放线菌进 行植物病害防治的研究已经有一些成功地报道， 而尚未见利用山药内生放线菌进行。
7、防治山 药炭疽病的研究报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种山药内生利迪链霉菌及其在防治山药炭疽病中的应用。 0005 本发明所采用的技术方案 ： 0006 一株山药内生利迪链霉菌， 从山药植株的根中分离得到， 命名为利迪链霉菌 (Streptomyces lidicus )DOR3-2， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国.武汉.武 汉大学 ； 保藏日期 ： 2012 年 6 月 24 日 ； 保藏编号 ： CCTCC NO:M2012237。 0007 上述利迪链霉菌 (Streptomyces lidicus )DOR3-2 的生物学特征如下 ： 0008 1、 。
8、菌株的 16S rRNA 基因序列分析 0009 利迪链霉菌 DOR3-2 的 16S rRNA 基因序列有效片段长度为 1405bp, 提交 GenBank 数据库序列号为 JF718661。在 EzTaxon 数据库中进行有效种的序列相似性搜 索 , 发现利迪链霉菌 DOR3-2 与链霉菌属的菌株高度相关， 是链霉菌属的放线菌， 并且利迪 链霉菌 DOR3-2 与利迪链霉菌标准菌株 NRRL2433（Streptomyces lydicus NRRL2433T） 的 相似性最高， 相似性为 99.715%， 与 Streptomyces chattanoogensis DSM 40002T。
9、的相似性 说 明 书 CN 102787085 A 3 2/6 页 4 为 99.63%， Streptomyces chrestomyceticus DSM 40545T的相似性为99.2%， Streptomyces rimosus subsp. Paromomycinus DSM 41429T的相似性为 99.2%， 而与其他链霉菌属的相似 性在 97.95-99% 之间。 0010 2、 菌株的形态与培养特征 0011 利迪链霉菌 DOR3-2 的气生菌丝和基内菌丝高度分支， 营养菌丝不断裂， 孢子丝颜 色早期白色， 培养后期灰褐色， 孢子链呈螺旋状。在 ISP2、 ISP4、 ISP。
10、5 三种培养基上生长良 好， 气生菌丝均白色 ； 在 ISP3、 ISP6 培养基上生长中等， 在 ISP7 培养基上生长较差 ； 在所有 培养基上均未产色素。菌株 DOR3-2 与利迪链霉菌 NRRL2433 在培养特征上存在差异 （见表 1） 。 0012 表 1 利迪链霉菌 DOR3-2 与利迪链霉菌 NRRL2433 培养特征的比较 0013 0014 3、 菌株的生理生化特征 0015 利迪链霉菌 DOR3-2 与利迪链霉菌 NRRL2433 在生理生化特征上极为相似， 均可对 说 明 书 CN 102787085 A 4 3/6 页 5 多种碳源进行利用， 但二者也存在差别。利迪链。
11、霉菌 DOR3-2 能利用纤维素和淀粉作为碳源 生长， 但利迪链霉菌 NRRL2433 对二者均不能利用 （见表 2） 。 0016 表 2 利迪链霉菌 DOR3-2 与相似性菌株的生理生化特征比较 0017 0018 * Data fromKarwowski etal.1992. ； + 表示能生长 ； - 表示不能生长。 0019 综合上述形态培养特征、 生理生化特征及 16S rRNA 基因序列相似性的结果， 利迪 链霉菌 DOR3-2 与利迪链霉菌标准菌株 NRRL2433（Streptomyces lydicus NRRL2433T） 高 度相似又略有差别， 因此利迪链霉菌 DOR3。
12、-2 为一株新利迪链霉菌。 0020 本发明所提供的利迪链霉菌 DOR3-2 可通过如下方法从山药植株分离培养得到 ： 0021 （1） 采集健康的山药植株的根经表面消毒处理后， 切成1-2 cm小块， 将组织研成匀 浆液， 涂布于 IMA-2 培养基， 28培养 1-4 周。 0022 （2） 挑取小型菌丝紧密的放线菌特征菌落， 于 ISP2 培养基平板划线纯化分离， 置 于 28培养 1 周。 0023 （3） 将所得纯菌株与山药病原菌胶孢炭疽菌作平板对峙试验， 从中选择对病原菌 具抗性的菌株， 通过山药组培苗接种试验进一步验证其抗病活性后， 鉴定并保存菌种。 0024 本发明的利迪链霉菌。
13、(Streptomyces lydicus) DOR3-2具有广谱的抗丝状真菌活 性。 平板对峙培养试验表明该菌株对山药胶孢炭疽菌、 参薯胶孢炭疽菌、 米曲霉、 黄曲霉、 青 霉都有抗菌活性。 0025 发明人针对该利迪链霉菌 DOR3-2 发展了一套培养技术， 并能把该菌重新回接山 药组培苗， 增强了山药组培苗对胶孢炭疽病的抗性。 说 明 书 CN 102787085 A 5 4/6 页 6 0026 本发明所述的于 IMA-2 培养基成分组成通常为 ： 葡萄糖 5 g， 淀粉 5 g， 牛肉浸膏 1 g， 酵母浸膏 1 g， N-Z-Amine 2 g， NaCl 2g, CaCO3 2g。
14、, 蒸馏水 1000 mL， 琼脂 20g, pH7.2 ； 抑制剂的组成 ： 50mg/L 放线菌酮 +50mg/L 制霉菌素 +100mg/L 重铬酸钾 ； 所述的 ISP2 培养 基成分为 ： 酵母粉 4g， 麦芽浸粉 10g， 葡萄糖 4g， 蒸馏水 1000ml， 琼脂 20g， pH7.3。 0027 本发明还涉及所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) DOR3-2在防治山药炭疽 病中的应用。 0028 本发明所提供的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus) DOR3-2具有广谱的抗丝状 真菌活性， 对薯蓣科薯蓣属藤本植物尤其是山药炭疽病具有良好的。
15、防治效果， 为山药的规 模化生产提供技术支持， 为山药的生物防治提供一条有效的防治途径。 附图说明 0029 图 1 利迪链霉菌 DOR3-2 对炭疽病菌的平板对峙拮抗活性。 0030 图 2 炭疽菌在培养基表面生长旺盛。 0031 图 3 利迪链霉菌 DOR3-2 抑制炭疽菌菌丝生长。 0032 图 4 14d 后对照组培苗枯萎死亡。 0033 图 5 14d 后回接菌株 DOR3-2 的组培苗生长良好。 具体实施方式 0034 下面结合实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0035 实施例一 利迪链霉菌 DOR3-2 的。
16、分离培养方法 0036 1、 采取健康山药根样品， 自来水冲洗干净， 室温风干， 切成 1-2 cm 小块， 0.1% 的吐 温 20 淋洗几秒， 5% 的次氯酸钠消毒 10min， 2.5% 的无菌 Na2S2O3溶液洗 10 分钟， 70% 的酒精 消毒 5min， 无菌水淋洗 2 遍， 10% 的无菌 NaHCO3溶液洗 10 分钟， 风干后， 加少量无菌水和石 英沙用无菌研钵将组织研成匀浆液， 0037 2、 将匀浆液两层纱布过滤后， 稀释10， 100倍， 每稀释度取0.2 ml涂布于IMA-2 分 离培养基， 28培养 1-4 周。 0038 3、 根据分离培养基上菌株的培养特征，。
17、 挑取明显分开的放线菌单菌落， 进一步 ISP2 平板划线纯化后， 4保存或挑取菌丝或孢子于 20% 无菌甘油， -20保存。 0039 4、 将所得纯菌株与山药病原菌胶孢炭疽菌作平板对峙试验， 从中选择对病原菌具 抗性的菌株， 通过山药组培苗接种试验进一步验证其抗病活性后， 鉴定并保存菌种。 0040 实施例二 利迪链霉菌 DOR3-2 的平板对峙抗丝状病原真菌试验 0041 1、 接种利迪链霉菌 DOR3-2 于 ISP2 平板上 28恒温箱培养 1 周， 供试病原丝状真 菌接种于 PDA 培养基上 28恒温箱培养 1 周。 0042 2、 用接种环挑取直径 2 mm 的放线菌单菌落菌块接。
18、种在 PDA 培养基固体培养基的 一侧 （距平板中心点 1.5 cm） ， 置于 28恒温箱培养 3-4 d， 0043 3、 待放线菌菌落长成绿豆大小时， 在距离放线菌 3cm 的位置接种直径 6mm 的丝状 真菌菌丝块 （两接种点呈中心对称） 。以不接放线菌菌株做对照， 每个菌株 3 次重复， 28培 养 5-7 d 后观察并测量放线菌与丝状真菌菌落边缘的距离。通过抑菌带的大小评价利迪链 说 明 书 CN 102787085 A 6 5/6 页 7 霉菌 DOR3-2 的抗菌能力。 0044 4、 结果利迪链霉菌DOR3-2对本实验室保存的13种薯蓣植物炭疽病原菌分离物都 具有良好的拮抗活。
19、性 （图 1） ， 对米曲霉、 黄曲霉、 青霉等丝状真菌表现出广谱的拮抗活性， 其 抑菌带距离和抑制等级如表 3。 0045 表 3 利迪链霉菌 DOR3-2 对丝状真菌的抗菌谱 0046 0047 抑制活性等级 ： +， 20mm ； +， 11-19 mm ； +， 2-19 mm ； ， 1 mm ； -， 0 mm。 0048 实施例三 利迪链霉菌 DOR3-2 回接山药组培苗抗山药炭疽病试验 0049 1、 接种利迪链霉菌 DOR3-2 于 ISP2 平板上 28恒温箱培养 1 周， 用无菌刀将利迪 链霉菌 DOR3-2 的菌落从平板上刮下， 并用无菌水洗脱做成菌丝或孢子悬液 （3-。
20、4106cfu/ ml） 。 0050 2、 取 1-2ml 菌悬液注入到山药组培苗生长的培养基表面， 以无菌水做对照， 在光 照培养箱中培养 14d， 取出组培苗的茎叶部分， 无菌条件下切成小块， 再接种到 IMA-2 培养 基固体培养基， 培养 1-4 周， 观察放线菌是否从组织块长出， 判断放线菌回接山药组培苗是 否成功。 0051 3、 接种山药炭疽菌于PDA培养基上28恒温箱培养1周。 用无菌刀将山药炭疽菌 的菌落从平板上刮下， 并用无菌水做成菌丝或孢子悬液 （3-4106cfu/ml） ， 取1-2ml菌悬液 注入到已回接成功利迪链霉菌 DOR3-2 的山药组培苗培养基表面， 以未。
21、回接放线菌 DOR3-2 的山药组培苗为对照， 在光照培养箱中培养 14d， 调查组培苗的生长、 发病情况。 0052 4、 结果发现利迪链霉菌 DOR3-2 能成功回接山药组培苗， 从山药组培苗的茎、 叶 组织块中长出了放线菌菌落 ； 并且利迪链霉菌 DOR3-2 能够抑制山药炭疽菌菌丝在山药组 培苗培养基表面的生长， 防止山药炭疽菌感染山药组培苗 （图 3） ， 而对照培养基表面炭疽 说 明 书 CN 102787085 A 7 6/6 页 8 菌生长旺盛 （图 2） ， 并且感染了组培苗， 14 d 后组培苗枯萎死亡 （图 4） ， 已回接利迪链霉菌 DOR3-2 的山药组培苗却生长健康 （图 5） 0053 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102787085 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102787085 A 9 2/2 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102787085 A 10 。