一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102559588 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102559588 A *CN102559588A* (21)申请号 201110410788.X (22)申请日 2011.12.09 C12N 5/077(2010.01) C12N 5/0797(2010.01) (71)申请人 姜晓丹 地址 510282 广东省广州市海珠区工业大道 中 253 号珠江医院神经外科研究所 申请人 李鹏 (72)发明人 姜晓丹 李鹏 (74)专利代理机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 代理人 宣国华 (54) 发明名称 一种模拟体内环境诱导脂肪基。

2、质细胞为神经 干细胞的方法 (57) 摘要 一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经 干细胞的方法， (1) 选取离体鼠类脑组织中海马、 大脑皮层或小脑部位， 获得其可溶性物质 ； (2) 选 取离体鼠类皮下脂肪组织， 获得脂肪基质细胞 ； (3) 取脂肪基质细胞进行预处理后获得的重悬后 脂肪基质细胞， 加入培养基和鼠类脑组织中海马 可溶性物质、 大脑皮层或小脑可溶性物质， 将细胞 悬液培养后， 通过鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层 或小脑可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细 胞。该方法采用鼠类脑组织的海马、 大脑皮层和 小脑部位等外环境所含可溶性物质作为生理诱导 剂， 诱导鼠类皮下组织中的脂肪基。

3、质细胞为神经 干细胞， 实现在生理条件下促使和加快种子细胞 的形成。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 13 页 1/1 页 2 1. 一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其特征是含以下步骤 ： (1) 选取离体鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层或小脑部位， 置于 DMEM F12 培养基中， 经 摇床震荡和离心处理后， 取上清液， 过滤后灭菌获得鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层或小脑 可溶性物质， 保存备用 ； (2) 选取离体鼠类皮。

4、下脂肪组织， 采用 I 型胶原酶消化后， 使用胎牛血清或新牛血清终 止消化， 过滤， 取滤液， 离心后弃去上清液， 在下层物质中加入培养基重悬细胞， 接种， 在培 养基和体积百分含量为 10的胎牛血清或新牛血清中培养后， 细胞扩增至第二代， 经流式 鉴定确认为脂肪基质细胞 ； (3) 取步骤 (2) 中获得的脂肪基质细胞进行预处理后获得的重悬后脂肪基质细胞， 取 出重悬后脂肪基质细胞， 加入培养基和步骤 (1) 中制备的鼠类脑组织中海马、 大脑皮层或 小脑可溶性物质， 将细胞悬液培养后， 通过鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层或小脑可溶性物 质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞。 2. 根据权利要求 1。

5、 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其 特征是 ： 步骤 (1) 中摇床震荡时的温度为 4， 震荡时间为 1-3h。 3. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方 法， 其特征是 ： 步骤 (1) 中离心时的温度为 4， 离心机的转速为 18000g， 离心时间为 20-40min。 4. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其 特征是 ： 步骤 (2) 中 I 型胶原酶的体积百分含量为 0.5-1.5， 消化时间为 20-40min ； 所述 培养基为 DMEM、 DMEM/ 高糖、 DMEM/ 。

6、低糖或 DMEM F12。 5. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其 特征是 ： 步骤 (2) 中离心时的转速为 1000-1200r/min， 离心时间为 1-10min。 6. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其 特征是 ： 步骤 (3) 中所述培养基为 DMEM、 DMEM/ 高糖、 DMEM/ 低糖、 DMEM F12 或神经干细胞 培养基。 7. 根据权利要求 6 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其 特征是步骤 (3) 中脂肪基质细胞进行预处理的具体过程为 ： 取步骤 (。

7、2) 中培养的脂肪基质 细胞， 经胰酶消化后， 收集细胞， 离心， 弃去上清液， 下层物质采用培养基重悬细胞， 得重悬 后脂肪基质细胞， 其中所述胰酶的体积百分含量为 0.125-0.25。 8. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其 特征是 ： 步骤 (3) 中获得的重悬后脂肪基质细胞的浓度为 1.0-3.0106个细胞 /mL。 9. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其特征是 ： 步骤 (3) 中重悬后脂肪基质细胞与培养基的体积比为 1 1-4， 重悬后脂肪基 质细胞与步骤 (1) 中制备的鼠类脑组织中的。

8、海马、 大脑皮层或小脑可溶性物质的体积比为 1 1-4。 10. 根据权利要求 1 中所述的模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法， 其特征是步骤 (3) 中将细胞悬液培养时的条件为 ： 在 37， 体积百分含量为 5 CO2培养箱 中培养。 权 利 要 求 书 CN 102559588 A 2 1/10 页 3 一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方法 技术领域 0001 本发明属于生物制品技术领域， 具体涉及一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为 神经干细胞的方法。 背景技术 0002 近年来， 神经干细胞作为移植治疗神经退行性疾病的种子细胞， 在基础研究与临 床试验中引起了。

9、众多学者的关注。神经干细胞的诱导一直是神经医学领域中一个难点。主 要原因在于 ： 诱导环境中因子种类选择、 因子浓度的确定以及神经干细胞状态长期维持 ； 使用外来因子诱导而成的神经干细胞移植治疗的争论。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种模拟体内环境诱导脂肪基质细胞为神经干细胞的方 法， 该方法采用鼠类脑组织不同的部位如海马、 大脑皮层和小脑部位等外环境所含可溶性 物质作为生理诱导剂， 诱导鼠类皮下组织中的脂肪基质细胞为神经干细胞从而实现在生理 条件下促使和加速种子细胞的形成。 0004 本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的 ： 一种模拟体内环境诱导脂肪基 质细胞为神经干细胞的。

10、方法， 含以下步骤 ： 0005 (1) 选取离体鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层或小脑部位， 置于 DMEM F12 培养基 中， 经摇床震荡和离心处理后， 取上清液， 过滤后灭菌获得鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层 或小脑可溶性物质， 保存备用 ； 0006 (2) 选取离体鼠类皮下脂肪组织， 采用 I 型胶原酶消化后， 使用胎牛血清或新牛血 清终止消化， 过滤， 取滤液， 离心后弃去上清液， 在下层物质中加入培养基重悬细胞， 接种， 在培养基和体积百分含量为 10的胎牛血清或新牛血清中培养后， 细胞扩增至第二代， 经 流式鉴定确认为脂肪基质细胞 ； 0007 (3) 取步骤 (2) 中获得的。

11、脂肪基质细胞进行预处理后获得的重悬后脂肪基质细 胞， 取出重悬后脂肪基质细胞， 加入培养基和步骤 (1) 中制备的鼠类脑组织中海马、 大脑皮 层或小脑可溶性物质， 将细胞悬液培养后， 通过鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层或小脑可溶 性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞。 0008 在上述步骤中 ： 0009 步骤 (1) 中摇床震荡时的温度为 4， 震荡时间为 1-3h。 0010 步骤 (1) 中离心时的温度为 4， 离心机的转速为 18000g， 离心时间为 20-40min。 0011 步骤(2)中I型胶原酶的体积百分含量为0.5-1.5， 消化时间为20-40min ； 所述 培养基为 D。

12、MEM、 DMEM/ 高糖、 DMEM/ 低糖或 DMEM F12， 其中 DMEM 为 Dulbecco sModified Eagle Medium 培养基的缩写， 下同。 0012 步骤 (2) 中离心时的转速为 1000-1200r/min， 离心时间为 1-10min。 说 明 书 CN 102559588 A 3 2/10 页 4 0013 步骤 (3) 中所述培养基为 DMEM、 DMEM/ 高糖、 DMEM/ 低糖、 DMEM F12 或神经干细胞 培养基， 关于神经干细胞培养基， 可参阅本申请人早期的申请号为 02134314.4 的专利。 0014 步骤 (3) 中脂肪基质。

13、细胞进行预处理的具体过程为 ： 取步骤 (2) 中培养的脂肪基 质细胞， 经胰酶消化后， 收集细胞， 离心， 弃去上清液， 下层物质采用培养基重悬细胞， 得重 悬后脂肪基质细胞， 其中所述胰酶的体积百分含量为 0.125-0.25。 0015 步骤 (3) 中获得的重悬后脂肪基质细胞的浓度为 1.0-3.0106个细胞 /mL。 0016 步骤 (3) 中重悬后脂肪基质细胞与培养基的体积比为 1 1-4， 重悬后脂肪基质 细胞与步骤 (1) 中制备的鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层或小脑可溶性物质的体积比为 1 1-4。 0017 步骤 (3) 中将细胞悬液培养时的条件为 ： 在 37， 体积百。

14、分含量为 5 CO2培养箱 中培养。 0018 与现有技术相比， 本发明具有如下优点 ： 本发明中的方法与目前使用的其他因子 诱导方法相比， 本发明方法为神经干细胞的诱导提供了一个生理环境， 避免了当前一些 “诱 导间充质干细胞所成球为肿瘤化” 的观点 ； 而且比起目前常用方法， 大大的缩短了诱导为神 经干细胞的时间。 附图说明 0019 图 1 是实施例 1-3 中采用的离体鼠类脑组织 ； 0020 图 2 是是实施例 1-3 中采用的离体鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层和小脑部位 ； 0021 图 3 是是实施例 1-3 中获得的离体鼠类脑组织中的海马、 大脑皮层和小脑三个部 位的可溶性物质。

15、 ； 0022 图 4 是是实施例 1-3 中采用的离体鼠类脂肪基质细胞第 2 天倒置相差显微镜观察 200 图示 ； 0023 图 5 是是实施例 1-3 中采用的离体鼠类脂肪基质细胞第 2 天倒置相差显微镜观察 400 图示 ； 0024 图 6 是是实施例 1-3 中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定中的阴性对照 ； 0025 图 7 是是实施例 1-3 中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定结果 CD29 为阳性 ； 0026 图 8 是是实施例 1-3 中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定结果 CD44 为阳性 ； 0027 图 9 是是实施例 1-3 中离体鼠类脂肪基质细胞流式鉴定结果 CD90 为阳。

16、性 ； 0028 图 10 是实施例 1 中脂肪基质细胞于含海马可溶性物质的 DMEM F12 培养基中诱导 1d 倒置相差显微镜观察， 100 ； 0029 图 11 是实施例 1 中脂肪基质细胞于含海马可溶性物质的 DMEM F12 培养基中诱导 1d 倒置相差显微镜观察， 200 ； 0030 图 12 是实施例 2 中脂肪基质细胞于含大脑皮层可溶性物质的 DMEM F12 培养基中 诱导 1d 倒置相差显微镜观察， 100 ； 0031 图 13 是实施例 2 中脂肪基质细胞于含大脑皮层可溶性物质的 DMEM F12 培养基中 诱导 1d 倒置相差显微镜观察， 200 ； 0032 图。

17、 14 是实施例 3 中脂肪基质细胞于含小脑可溶性物质的 DMEM F12 培养基中诱导 1d 倒置相差显微镜观察， 100 ； 说 明 书 CN 102559588 A 4 3/10 页 5 0033 图 15 是实施例 3 中脂肪基质细胞于含小脑可溶性物质的 DMEM F12 培养基中诱导 1d 倒置相差显微镜观察， 200 ； 0034 图 16 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞于 20ng/mLEGF、 bFGF 和 B-27 中诱导 5d 倒 置相差显微镜观察， 100( 对照 )， 其中 P2 是细胞第二代 (passage 2) 的简写 ； 0035 图 17 是实施例 。

18、1-3 中 P2 脂肪基质细胞于 20ng/mLEGF、 bFGF 和 B-27 中诱导 5d 倒 置相差显微镜观察 200( 对照 ) ； 0036 图 18 是实施例 1 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d nestin 表达免疫荧 光鉴定阳性， 200 ； 0037 图19是实施例1中中P2脂肪基质细胞于含海马因子中诱导1d DAPI染核， 200 ； 0038 图 20 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导 1d nestin 表达免 疫荧光鉴定阳性， 200 ； 0039 图 21 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导 1d D。

19、API 染核， 200 ； 0040 图 22 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d nestin 表达免疫荧 光鉴定阳性， 200 ； 0041 图 23 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d DAPI 染核， 200 ； 0042 图 24 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d nestin 表达免疫荧光鉴定阴性对 照， 200 ； 0043 图 25 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d DAPI 染核阴性对照， 200 ； 0044 图 26 是实施例 1 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d CD1。

20、33 表达免疫荧 光鉴定阳性， 200 ； 0045 图 27 是实施例 1 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d DAPI 染核， 200 ； 0046 图 28 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导 1d CD133 表达免 疫荧光鉴定阳性， 200 ； 0047 图 29 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导 1d DAPI 染核， 200 ； 0048 图 30 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d CD133 表达免疫荧 光鉴定阳性， 200 ； 0049 图 31 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含。

21、小脑因子中诱导 1d DAPI 染核， 200 ； 0050 图 32 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d CD133 表达免疫荧光鉴定阴性对 照， 200 ； 0051 图 33 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d DAPI 染核阴性对照， 200 ； 0052 图 34 是实施例 1 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d nestin 表达共聚焦 显微镜鉴定阳性， 800 ； 0053 图 35 是实施例 1 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d DAPI 染核， 800 ； 0054 图 36 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大。

22、脑皮层因子中诱导 1d nestin 表达共 聚焦显微镜鉴定阳性， 800 ； 0055 图 37 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导 1d DAPI 染核， 800 ； 说 明 书 CN 102559588 A 5 4/10 页 6 0056 图 38 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d nestin 表达共聚焦 显微镜鉴定阳性， 800 ； 0057 图 39 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d DAPI 染核， 800 ； 0058 图 40 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d nestin 表达。

23、共聚焦显微镜鉴定阴 性对照， 800 ； 0059 图 41 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d DAPI 染核阴性对照， 800 ； 0060 图 42 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d CD133 表达共聚 焦显微镜鉴定阳性， 800 ； 0061 图 43 是实施例 1 中 P2 脂肪基质细胞于含海马因子中诱导 1d DAPI 染核， 800 ； 0062 图 44 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞于含大脑皮层因子中诱导 1d CD133 表达共 聚焦显微镜鉴定阳性， 800 ； 0063 图 45 是实施例 2 中 P2 脂肪基质细胞。

24、于含大脑皮层因子中诱导 1d DAPI 染核， 800 ； 0064 图 46 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d CD133 表达共聚焦 显微镜鉴定阳性， 800 ； 0065 图 47 是实施例 3 中 P2 脂肪基质细胞于含小脑因子中诱导 1d DAPI 染核， 800 ； 0066 图 48 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d CD133 表达共聚焦显微镜鉴定阴 性对照， 800 ； 0067 图 49 是实施例 1-3 中 P2 脂肪基质细胞诱导 1d DAPI 染核阴性对照， 800 ； 0068 图 50 是实施例 1-3 中采用 wes。

25、tern blot 法检测脂肪基质细胞 nestin 蛋白表达 情况和P2脂肪基质细胞于含海马、 大脑皮层和小脑因子中诱导1dnestin蛋白表达情况， 其 中 1 条带为 P2 脂肪基质细胞 nestin 蛋白表达情况， 2， 3， 4 条带分别为 P2 脂肪基质细胞于 含海马、 脑皮层和小脑因子中诱导 1d nestin 蛋白表达情况 ； 0069 图 51 是实施例 1-3 中采用 western blot 法检测脂肪基质细胞 CD133 蛋白表达情 况和P2脂肪基质细胞于含海马、 大脑皮层和小脑因子中诱导1d CD133蛋白表达情况， 其中 1 条带为 P2 脂肪基质细胞 CD133 。

26、蛋白表达情况， 2， 3， 4 条带分别为 P2 脂肪基质细胞于含海 马、 脑皮层和小脑因子中诱导 1d CD133 蛋白表达情况 ； 0070 图 52 是实施例 1-3 中 1、 2、 3、 4 条带为内参 GAPDH 表达情况， western blot 法检 测。 具体实施方式 0071 实施例 1 0072 ( 一 ) 大鼠海马可溶性物质的提取步骤 ： 0073 (1) 将离体鼠类脑组织中的海马部位， 置于装有 2mL 冷的 DMEM F12 培养基的离心 管中， 如图 1、 2 和 3 中所示 ； 其中 DMEM F12 购自 hyclone 公司， 下同 ； 0074 (2) 将。

27、装有海马部位的离心管置于 4的摇床震荡 2 小时 ； 0075 (3) 在 4下高速离心 30 分钟， 离心机转速为 18000g(rcf) ； 0076 (4) 取离心管上清液， 过滤灭菌 ( 图 3)， 分装， 做好标记， -80超低温保存， 备用。 0077 ( 二 ) 脂肪间基质细胞的取材、 培养 ： 说 明 书 CN 102559588 A 6 5/10 页 7 0078 (1) 将鼠类离体脂肪组织少许置于体积百分含量为 1的 2mL I 型胶原酶消化 30 分钟 ； 0079 (2) 使用胎牛血清或新牛血清终止消化， 400 目滤网过滤， 取滤液， 1000r/min 离心 5 分。

28、钟 ； 0080 (3) 弃离心后上清液， 加入 DMEM F12 培养基 2mL 重悬细胞， 接种到培养瓶里， 以 DMEM F12+ 体积百分含量为 10的胎牛血清为培养基， 此处 DMEM F12 培养基还可以采用 DMEM、 DMEM/ 高糖、 DMEM/ 低糖、 DMEM F12 或神经干细胞培养基等替代， 在 37、 体积百分含 量为 5 CO2培养箱中培养 ； 0081 (4) 细胞扩增至第二代 ( 图 4、 5)， 采用显微镜， 在 200X 和 400X 下可以发现细胞呈 梭形生长， 进行流式鉴定和诱导。 0082 ( 三 ) 脂肪间基质细胞的流式鉴定 ： 0083 (1) 。

29、采用体积百分含量为 0.25的胰酶消化 2 瓶长满的脂肪基质细胞， PBS 清洗 3 次 ； 0084 (2) 分别使用 100L PBS 将细胞重悬成 4 管 (1 管为阴性对照 )， 其余 3 管一次加 入流式抗体 CD29， CD44 和 CD90， 室温孵育 5 分钟 ； 0085 (3) 将细胞收集后， 重悬， 加入抗体， 即可上机， 流式细胞仪检测结果如图 6、 7、 8 和 9 中所示， 使用流式细胞仪对细胞表面 CD29， CD44 和 CD90 表达的鉴定呈阳性， 说明分离获 得的是脂肪基质细胞 ； 0086 ( 四 ) 使用大鼠海马可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞 ：。

30、 0087 (1) 取 5 瓶长满的脂肪基质细胞， 使用体积百分含量为 0.25胰酶消化， 收集细 胞， 1000r/min 离心 5 分钟 ； 0088 (2)弃上清液， 使用3mLDMEM F12培养基重悬细胞， 取1mL细胞悬液(约为1.0106 个细胞 )， 获得脂肪基质细胞， 加入 3mLDMEM F12 培养基和 1mL 大鼠海马可溶性物质 ； 0089 (3) 将离心管中 5mL 细胞悬液接种于 25cm2培养瓶中， 在 37 5 CO2培养箱中培 养 ； 0090 (4) 观察并拍照 ( 图 10-17)， 从图 10-11、 16-17 中的 P2 脂肪基质细胞于含海马可 溶。

31、性物质中诱导1d倒置相差显微镜观察100X、 200X可以看出细胞生长呈球形， 即通过鼠类 脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即神经球 )， 同时将 P2 脂肪基质细胞于 20ng/mLEGF、 bFGF 和 B-27 中诱导 5d 倒置相差显微镜观察， 在其 100X( 对 照 ) 和 200X( 对照 ) 可以看出该细胞生长呈球形， 也获得了神经干细胞。 0091 ( 五 ) 神经干细胞鉴定 ： 0092 由于 nestin 蛋白和 CD133 蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白， 实验中常用此 蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光 ( 图 18-19、 26。

32、-27、 24-25)、 激光共聚焦 ( 图 34-35、 42-43、 40-41)、 western blot 来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达 ( 图 50-52)。 使用以上 3 种方法来对神经干细胞的鉴定。 0093 其中免疫荧光包括如下步骤 ： 0094 (1) 收集神经干细胞于离心管中， 用磷酸缓冲液 (PBS) 清洗 2 遍 ； 0095 (2)4多聚甲醛固定 20 分钟， PBS 清洗 3 次 ； 0096 (3)1 Triton 破膜 10 分钟 ； 说 明 书 CN 102559588 A 7 6/10 页 8 0097 (4)PBS 清洗 3 次 ；。

33、 0098 (5) 山羊封闭血清 37 度封闭 30 分钟 ； 0099 (6) 一抗 ( 抗 -nestin 和抗 -CD133 抗体， 稀释比例为 1 200) 孵育， 过夜后， 37 复温 1 小时 ； 0100 (7)PBS 清洗 3 次 ； 0101 (8) 二抗 ( 羊抗兔， 稀释比例为 1 200)37孵育 1 小时 ； 0102 (9)PBS 清洗 3 次 ； 0103 (10) 加入 DAPI， 涂片于荧光显微镜观察， 拍照。 0104 其中激光共聚焦显微镜观察简要步骤 ： 0105 (1) 收集神经干细胞于离心管中， 用磷酸缓冲液 (PBS) 清洗 2 遍 ； 0106 (。

34、2)4多聚甲醛固定 20 分钟， PBS 清洗 3 次 ； 0107 (3)1 Triton 破膜 10 分钟 ； 0108 (4)PBS 清洗 3 次 ； 0109 (5) 山羊封闭血清 37 度封闭 30 分钟 ； 0110 (6) 一抗 ( 抗 -nestin 和抗 -CD133 抗体， 稀释比例为 1 200) 孵育， 过夜后， 37 复温 1 小时 ； 0111 (7)PBS 清洗 3 次 ； 0112 (8) 二抗 ( 羊抗兔， 稀释比例为 1 200)37孵育 1 小时 ； 0113 (9)PBS 清洗 3 次 ； 0114 (10) 加入 DAPI， 涂片于激光共聚焦显微镜观察。

35、， 拍照。 0115 其中 Western blot 包括以下步骤 ： 0116 (1) 分离胶和积层胶， 制胶板 ； 0117 (2) 蛋白变性 ： 准备蛋白样本 ( 收集到的神经干细胞的蛋白， 其中含有 nestin 蛋 白和 CD133 蛋白 )， 加入等体积的 2 上样 Buffer 稀释， 置于沸水中煮 10min( 预染 marker 煮 5min) ； 0118 (3) 加样 ： 每孔加入 20 40L 样品 0119 (4) 电泳 ： 置于电泳槽中电泳 45min， 恒定电流 90mA(2 块板 )， 如为 1 块板则电流 为 50mA ； 0120 (5) 取出胶板， 用切割。

36、刀修好胶 ； 0121 (6) 将胶置于转膜液中浸泡 ； 0122 (7) 按顺序放好下列物质 ： 黑面海绵滤纸胶 NC 膜滤纸 ( 用吸管赶去气 泡 ) 海绵 ； 0123 (8) 置于转膜槽中于， 黑面对黑面， 加上冰块， 加入转膜液 ； 0124 (9) 装好电极， 于恒定电压 100V 下， 90min ； 0125 (10) 丽春红染膜 ； 0126 (11) 用 TBST 洗去丽春红 ； 0127 (12) 封闭 ： 加入 5脱脂奶粉 +TBST， 常温摇床摇 1h ； 0128 (13) 回收封闭液， 加入一抗 ( 抗 -nestin 抗体和抗 -CD133 抗体， 用 5 BS。

37、A+TBS 稀释， 稀释倍数为 1 200) ； 说 明 书 CN 102559588 A 8 7/10 页 9 0129 (14) 置于 4摇床摇过夜 ； 0130 (15) 回收一抗， TBST 洗膜， 10min， 共 3 次 ； 0131 (16) 加入二抗 ( 二抗为辣根过氧化酶羊抗兔， 用 5脱脂奶粉 +TBS 稀释， 稀释倍 数为 1 1000)， 常温摇床摇 1h ； 0132 (17) 回收二抗， TBST 洗膜， 10min， 共 3 次 ； 0133 (18) 将膜置于发光液中浸泡约 1min ； 0134 (19) 将膜铺于曝光盒中， 于暗室中曝光， 洗胶片。 0135。

38、 目前普遍认为nestin蛋白和CD133是神经干细胞高亲和表达的蛋白， 免疫荧光和 激光共聚焦显微镜是利用抗原抗体结合的原理来鉴定的， western blot 方法是先将神经干 细胞里 nestin 蛋白和 CD133 蛋白提取出来， 然后电泳， 利用抗原抗体特异结合的原理来检 测。Western blot 中的条带就是蛋白质显示出来的。 0136 免疫荧光来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达见图 18、 19、 26 和 27， 图片中的 结果表明， 通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即 神经球 )。 0137 激光共聚焦来鉴定 nes。

39、tin 蛋白和 CD133 蛋白的表达， 如图 34、 35、 42 和 43 的结果 表明， 通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即神经 球 )。 0138 Western blot 来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达， 如图 50-52 所示， 图片 中的结果表明， 通过鼠类脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即神经球 )， 其中 nestin 蛋白有 3 个亚型， 有 3 个分子量， Nestin 蛋白的分子量依次是 110、 177 和 270KD， CD133 的分子量是 120KD。 0139 实施例 2。

40、 0140 ( 一 ) 大鼠大脑皮层可溶性物质的提取步骤 ： 0141 (1) 将离体鼠类脑组织中的大脑皮层部位， 置于装有 2mL 冷的 DMEM F12 培养基的 离心管中， 如图 1、 2 和 3 中所示 ； 0142 (2) 将装有大脑皮层部位离心管置于 4的摇床震荡 2 小时 ； 0143 (3) 在 4下高速离心 20 分钟， 离心机转速为 18000g(rcf) ； 0144 (4)取离心管上清液， 分别过滤灭菌(图3)， 并分装， 做好标记， -80超低温保存， 备用。 0145 ( 二 ) 脂肪间基质细胞的取材、 培养 ： 0146 (1) 将鼠类离体脂肪组织少许置于体积百分。

41、含量为 1的 2mL I 型胶原酶消化 30 分钟 ； 0147 (2) 使用胎牛血清终止消化， 400 目滤网过滤， 取滤液， 1000r/min 离心 5 分钟 ； 0148 (3) 弃离心后上清液， 加入 DMEM F12 培养基 2mL 重悬细胞， 接种到培养瓶里， 以 DMEM F12+ 体积百分含量为 10的胎牛血清为培养基， 在 37、 体积百分含量为 5 CO2培 养箱中培养。 0149 (4) 细胞扩增至第二代 ( 图 4、 5)， 采用显微镜， 在 200X 和 400X 下可以发现细胞呈 梭形生长。进行流式鉴定和诱导。 0150 ( 三 ) 脂肪间基质细胞的流式鉴定 ： 。

42、说 明 书 CN 102559588 A 9 8/10 页 10 0151 (1) 采用体积百分含量为 0.25的胰酶消化 2 瓶长满的脂肪基质细胞， PBS 清洗 3 次 ； 0152 (2) 分别使用 100L PBS 将细胞重悬成 4 管 (1 管为阴性对照 )， 其余 3 管一次加 入流式抗体 CD29， CD44 和 CD90， 室温孵育 5 分钟 ； 0153 (3) 将细胞收集后， 重悬， 加入抗体， 即可上机， 流式细胞仪检测结果如图 6、 7、 8 和 9 中所示， 使用流式细胞仪对细胞表面 CD29， CD44 和 CD90 表达的鉴定呈阳性， 说明分离获 得的是脂肪基质细。

43、胞。 0154 ( 四 ) 使用大鼠大脑皮层可溶性物质诱导脂肪基质细胞成神经干细胞 ： 0155 (1) 取 5 瓶长满的脂肪基质细胞， 使用体积百分含量为 0.25胰酶消化， 收集细 胞， 1000r/min 离心 5 分钟 ； 0156 (2)弃上清液， 使用3mLDMEM F12培养基重悬细胞， 然后分到离心管中， 每管1mL细 胞悬液 ( 约为 1.0106个细胞 )， 获得脂肪基质细胞， 在离心管中加 3mL DMEM F12 培养基 和 1mL 大鼠大脑皮层可溶性物质 ； 0157 (3) 将离心管中 5mL 细胞悬液接种于 25cm2培养瓶中， 在 37 5 CO2培养箱中培 养。

44、 ； 0158 (4) 观察并拍照 ( 图 10-17)， 从图 10-11、 16-17 中的 P2 脂肪基质细胞于含海马可 溶性物质中诱导1d倒置相差显微镜观察100X、 200X可以看出细胞生长呈球形， 即通过鼠类 脑组织中的海马可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即神经球 )， 同时将 P2 脂肪基质细胞于 20ng/mLEGF、 bFGF 和 B-27 中诱导 5d 倒置相差显微镜观察， 在其 100X( 对 照 ) 和 200X( 对照 ) 可以看出该细胞生长呈球形， 也获得了神经干细胞。 0159 ( 五 ) 神经干细胞鉴定 ： 0160 由于 nestin 蛋白和 。

45、CD133 蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白， 实验中常用此 蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光 ( 图 22-23、 24-25、 28-29)、 激光共聚焦 ( 图 36-37、 40-41、 44-45、 48-49)、 westernblot 来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达 ( 图 50-52)。使用以上 3 种方法来对神经干细胞的鉴定。 0161 由于 nestin 蛋白和 CD133 蛋白均为神经干细胞高亲和表达蛋白， 实验中常用此 蛋白来鉴定神经干细胞。本实验通过免疫荧光 ( 图 18-19、 26-27、 24-25)、 激光共聚焦 ( 图 34-3。

46、5、 42-43、 40-41)、 western blot 来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达 ( 图 50-52)。 使用以上 3 种方法来对神经干细胞的鉴定。 0162 目前普遍认为nestin蛋白和CD133是神经干细胞高亲和表达的蛋白， 免疫荧光和 激光共聚焦显微镜是利用抗原抗体结合的原理来鉴定的， western blot 方法是先将神经干 细胞里 nestin 蛋白和 CD133 蛋白提取出来， 然后电泳， 利用抗原抗体特异结合的原理来检 测。Western blot 中的条带就是蛋白质显示出来的。检测方法同实施例 1 中所述。 0163 免疫荧光来鉴定 nes。

47、tin 蛋白和 CD133 蛋白的表达见图 20、 21、 28 和 29， 图片中的 结果表明， 通过鼠类脑组织中的大脑皮层可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即神经球 )。 0164 激光共聚焦来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达， 如图 36、 37、 44 和 45 中的 结果表明， 通过鼠类脑组织中的大脑皮层可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细胞 ( 即神经球 )。 说 明 书 CN 102559588 A 10 9/10 页 11 0165 Western blot 来鉴定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表达， 如图 50-52 所示， 图。

48、片中 的结果表明， 通过鼠类脑组织中的大脑皮层可溶性物质诱导脂肪细胞基质获得了神经干细 胞 ( 即神经球 )， 其中 nestin 蛋白有 3 个亚型， 有 3 个分子量， Nestin 蛋白的分子量依次是 110、 177 和 270KD， CD133 的分子量是 120KD。 0166 综上所述， 脂肪基质细胞在大鼠皮层可溶性物质中诱导后， 为表达 nestin 和 CD133 阳性的神经干细胞。 0167 实施例 3 0168 ( 一 ) 大鼠小脑可溶性物质的提取步骤 ： 0169 (1) 将离体鼠类脑组织中的小脑部位， 置于装有 2mL 冷的 DMEM F12 培养基的离心 管中， 如图 1、 2 和 3 中所示 ； 0170 (2) 将装有小脑的离心管置于 4的摇床震荡 2 小时 ； 0171 (3) 在 4下高速离心 30 分钟， 离心机转速为 18000g(rcf) ； 0172 (4)取离心管上清液， 分别过滤灭菌(。