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1、(10)申请公布号 CN 102409076 A (43)申请公布日 2012.04.11 CN 102409076 A *CN102409076A* (21)申请号 201110429073.9 (22)申请日 2011.12.16 C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (71)申请人 江门市凯林贸易有限公司 地址 529000 广东省江门市蓬江区胜利北东 风工业区二号楼三楼 (72)发明人 王立超 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 张海文 (54) 发明名称 一种快速检测支原体的固体培养基及其制备 方法 (57。
2、) 摘要 本发明公开了一种快速检测支原体的固体培 养基及其制备方法。使用本发明的固体培养基能 够准确地检测解脲脲原体和人型支原体的存在， 并通过菌落计数定量推断支原体的含量， 大大提 高了准确度和可靠性。 同时， 使用本发明的培养基 检测支原体仅需 18h 即可判读结果， 实现了支原 体检测的快速化， 对解脲脲原体和人型支原体引 起的泌尿生殖道感染进行最终确诊。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 CN 102409080 A1/1 页 2 1. 一种快速检测支原体的固体培养基， 其特征在于 ： 。
3、其配方如下 ： 2. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测支原体的固体培养基， 其特征在于 ： 所述蛋白 胨为大豆蛋白胨和酪蛋白胨。 3. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测支原体的固体培养基， 其特征在于 ： 所述抗生 素为两性霉素 B、 多粘菌素 B 和青霉素钠的混合抗生素。 4. 根据权利要求 1 所述的一种快速检测支原体的固体培养基， 其特征在于 ： 所述培养 基还添加有磷酸二氢钾。 5. 根据权利要求 2 所述的一种快速检测支原体的固体培养基， 其特征在于 ： 所述磷酸 二氢钾的添加量为 2g 6g/L 蒸馏水。 6. 一种制备权利要求 1 快速检测支原体的固体培养基的方法， 包括。
4、以下步骤 ： (1) 将琼脂粉溶解于蒸馏水中， 经高压灭菌后置于温水中， 备用 ； (2)将蛋白胨和葡萄糖加入水中， 加热溶解后， 冷却至室温， 加入HEPES缓冲剂、 L-半胱 氨酸、 精氨酸、 脲和 RPMI1640 细胞培养基， 混匀， 待溶解后， 过滤杂质 ； (3) 将上述溶液的 PH 值调至 6.00.2， 过滤除菌， 备用 ； (4) 将马血清加入上述已除菌的溶液中， 混匀， 放入温水中复温 ； (5) 将上述溶液与已灭菌的琼脂混合， 加入硫酸锰和抗生素， 摇匀， 倾注于无菌平皿中， 待其凝固。 权 利 要 求 书 CN 102409076 A CN 102409080 A1/8。
5、 页 3 一种快速检测支原体的固体培养基及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种支原体培养基及其制备方法， 特别是一种快速检测支原体的固体 培养基及其制备方法。 背景技术 0002 解脲脲原体(UU)和人型支原体(MH)引起的泌尿生殖道感染占泌尿生殖道感染的 1/3 以上， 解脲脲原体和人型支原体的检测在临床上具有重要的意义。 0003 检测解脲脲原体和人型支原体的方法有特异性抗体检测法、 PCR 法、 Southern Blot 法和分离培养法等。免疫学检测方法容易出现交叉反应， PCR 法容易出现假阴性和假 阳性， 而 Southern Blot 法对实验技术要求较高， 不适合在医。
6、院内使用。临床上常用的检测 方法是分离培养法。国内有关泌尿生殖道支原体培养的实际应用和研究显示， 支原体的鉴 定主要采用液体培养法。虽然液体培养法使用方便、 快捷、 容易判断， 但是这种方法只能从 液体颜色的改变来推断支原体是否存在， 假阳性率高， 准确性不高。 而固体培养法则可以通 过显微镜观察到人型支原体和解脲脲原体的菌落， 从而确证支原体的存在， 较好地解决临 床标本假阳性率高的问题。但是固体培养法判读结果的时间较长， 因而需要时间较长才能 对 UU 和 MH 引起的泌尿道生殖道感染进行确诊， 不利于疾病的诊断和治疗。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种快速检测支原体的固体培养。
7、基及其制备方法。 0005 本发明所采用的技术方案是 ： 0006 一种快速检测支原体的固体培养基， 其配方如下 ： 0007 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A2/8 页 4 0008 优选地， 上述培养基中的蛋白胨为大豆蛋白胨和酪蛋白胨。 0009 优选地， 上述培养基中的抗生素为两性霉素 B、 多粘菌素 B 和青霉素钠的混合抗生 素。 0010 优选地， 上述培养基还添加有磷酸二氢钾。 0011 优选地， 上述培养基中磷酸二氢钾的添加量为 2g 6g/L 蒸馏水。 0012 一种制备上述快速检测支原体的固体培养基的方法， 包括以下步骤 ： 0013 (。
8、1) 将琼脂粉溶解于蒸馏水中， 经高压灭菌后置于温水中， 备用 ； 0014 (2) 将特殊胨和葡萄糖加入水中， 加热溶解后， 冷却至室温， 加入 HEPES 缓冲剂、 L- 半胱氨酸、 精氨酸、 脲和 RPMI1640 细胞培养基， 混匀， 待溶解后， 过滤杂质 ； 0015 (3) 将上述溶液的 PH 值调至 6.00.2， 过滤除菌， 备用 ； 0016 (4) 将马血清加入上述已除菌的溶液中， 混匀， 放入温水中复温 ； 0017 (5) 将上述溶液与已灭菌的琼脂混合， 加入硫酸锰和抗生素， 摇匀， 倾注于无菌平 皿中， 待其凝固。 0018 本发明的有益效果是 ： 0019 使用本发。
9、明的固体培养基可选择性地培养解脲脲原体和人型支原体， 通过菌落的 形成确证支原体的存在， 并能从菌落形态判断支原体的类型， 因此， 相对于液体培养基常出 现假阳性的情况， 本发明的固体培养基在诊断泌尿生殖道感染方面的准确性大大提高。使 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A3/8 页 5 用本发明的固体培养基还可以通过菌落计数直接推断出标本中支原体的真实含量， 从定量 的角度准确判断出标本是处于带菌状态还是已经达到了致病浓度， 而使用液体培养基只能 定性地判断支原体的存在， 因而本发明检测结果的准确性进一步得到提高。 除此以外， 在支 原体菌落形成时间上， 目前。
10、固体培养基的结果判读时间为 24 小时， 而使用本发明的支原体 培养基判读结果只需要 18 小时， 大大缩短了检测时间， 实现了解脲脲原体和人型支原体的 快速检测， 并且所形成的菌落比在市售培养基上形成的菌落要大得多， 为医生制订合理的 治疗方案提供了快速可靠的检验结果。 附图说明 0020 图 1 是解脲脲原体在本发明固体培养基培养上形成的菌落 ( 放大 400 倍 ) ； 0021 图 2 是人型支原体在本发明固体培养基上形成的菌落 ( 放大 400 倍 ) ； 0022 图 3 是解脲脲原体和人型支原体在本发明固体培养基上形成的菌落 ( 放大 400 倍 ) ； 0023 图 4 是实施。
11、例 5 中解脲脲原体在市售培养基上形成的菌落 ( 放大 400 倍 )。 具体实施方式 0024 本发明提供了一种支原体培养基及其制备方法， 该培养基能够快速、 准确地检测 出解脲脲原体和人型支原体。 0025 一种快速检测支原体的固体培养基， 其配方如下 ： 0026 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A4/8 页 6 0027 优选地， 该培养基中的蛋白胨为大豆蛋白胨和酪蛋白胨。 0028 优选地， 该培养基中的抗生素为两性霉素 B、 多粘菌素 B 和青霉素钠的混合抗生 素。 0029 优选地， 该培养基还添加有磷酸二氢钾。 0030 优选地， 该培养基中。
12、磷酸二氢钾的添加量为 2g 6g/L 蒸馏水。 0031 国内常用的检测支原体的方法为液体培养， 只能从液体颜色的改变来推断支原体 存在与否， 假阳性率高， 准确性不高。 本发明支原体固体培养基能选择性地培养解脲脲原体 和人型支原体， 用于诊断泌尿生殖道感染， 准确性高。 通过显微镜可以观察到固体培养基上 解脲脲原体的棕黑色海胆状菌落 ( 如图 1 所示 ) 和人型支原体的煎蛋状菌落 ( 如图 2 所 示 )， 从而确证支原体的存在。另外， 该培养基含有丰富的营养物质、 混合抗生素和显色剂。 解脲脲原体会令培养基内的硫酸锰氧化， 从而使其菌落颜色变成咖啡至黑色 ； 而人型支原 体则不会使硫酸锰。
13、氧化， 因而其菌落不显色。通过菌落形态和颜色的不同 ( 如图 3 所示 )， 可以准确清晰地鉴别支原体类型。同时， 通过菌落计数可以推断出标本中支原体的真实含 量(CFU)， 准确判断标本是带菌状态还是已达到了致病浓度。 该培养基解决了临床标本假阳 性率高的问题， 也从以前的定性检测升级成为定量检测。同时， 检测时间也大大缩短， 一般 来说， 使用固体培养基的判读时间为 24 小时， 而使用本发明的支原体培养基判读结果只需 要 18 小时。因此， 本发明的固体培养基具有快速检测和结果准确可靠的特点。 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A5/8 页 7 0032。
14、 一种制备上述快速检测支原体的固体培养基的方法， 包括以下步骤 ： 0033 (1) 将琼脂粉溶解于蒸馏水中， 经高压灭菌后置于温水中， 备用 ； 0034 (2) 将蛋白胨和葡萄糖加入营养液中， 加热溶解后， 冷却至室温， 加入 HEPES 缓冲 剂、 L- 半胱氨酸、 精氨酸、 脲和 RPMI1640 细胞培养基， 混匀， 待溶解后， 过滤杂质 ； 0035 (3) 将上述溶液的 PH 值调至 6.00.2， 过滤除菌， 备用 ； 0036 (4) 将马血清加入上述已除菌的溶液中， 混匀， 放入温水中复温 ； 0037 (5) 将上述溶液与已灭菌的琼脂混合， 加入硫酸锰和抗生素， 摇匀， 。
15、倾注于无菌平 皿中， 待其凝固。 0038 以下结合实施例进一步说明本发明 ： 0039 实施例 1 0040 一种快速检测支原体的固体培养基， 其组分如下 ： 0041 0042 0043 实施例 2 0044 一种快速检测支原体的固体培养基， 其组分如下 ： 0045 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A6/8 页 8 0046 实施例 3 0047 一种快速检测支原体的固体培养基， 其组分如下 ： 0048 0049 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A7/8 页 9 0050 实施例 4 0051 一种制备实施例 1 。
16、的固体培养基的方法， 包括以下步骤 ： 0052 (1) 将琼脂粉溶解于蒸馏水中， 经高压蒸汽 121灭菌 15min， 降温后保持在 50 的温水中， 备用 ； 0053 (2) 将蛋白胨、 葡萄糖和磷酸二氢钾加入水中， 加热溶解后， 冷却至室温， 加入 HEPES 缓冲剂、 L- 半胱氨酸、 精氨酸、 脲和 RPMI1640 细胞培养基， 混匀， 待溶解后， 用滤纸过 滤杂质 ； 0054 (3) 将上述溶液的 PH 值调至 6.0， 经 0.22m 过滤除菌， 备用 ； 0055 (4) 在无菌操作条件下将血清加入上述已除菌的溶液中， 混匀， 放入 50的温水 中复温 ； 0056 (5。
17、) 待溶液复温至 50后， 将所述溶液与已灭菌的琼脂在无菌条件下混合在一 起， 加入硫酸锰和混合抗生素， 摇匀， 倾注于无菌平皿中， 待其凝固 ； 0057 (6) 凝固后放置 4冷藏保存备用。 0058 实施例 5 0059 将相同浓度的阳性标本接种在实施例 4 中制得的固体培养基和市售培养基上进 行培养和观察， 结果如下表所示 ： 0060 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A8/8 页 10 0061 从表中可见， 使用实施例 4 中制得的培养基能使结果判读时间缩短 6h， 快速检测 解脲脲原体和人型支原体。另外， 由于培养基内增加了碳源， 解脲脲原体在生长时分解碳 源， 使得解脲脲原体的菌落尺寸大大增加， 更有利于解脲脲原体的观察。 说 明 书 CN 102409076 A CN 102409080 A1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102409076 A CN 102409080 A2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102409076 A 。