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1、(10)申请公布号 CN 102618646 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618646 A *CN102618646A* (21)申请号 201210090061.2 (22)申请日 2012.03.30 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 南方医科大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙太南路 1023 号 (72)发明人 周万军 徐湘民 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 谭英强 (54) 发明名称 一种基因拷贝数的定量检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种基因拷贝数的定量检测方 法， 包括如。
2、下步骤 ： 分别设计目的基因和参比基 因扩增序列的引物、 荧光探针， 及目的基因扩增序 列的封闭探针 ； 样本检测 ： 以待检DNA样本作为模 板， 对目的基因和参比基因进行多重 TaqMan 荧光 定量 PCR 反应， 并以已知目的基因拷贝数的 DNA 样本为对照样本， 分别记录 Ct 值 ； 结果分析。本 发明能直接定量检测功能基因的拷贝数， 直接反 映受检基因是否有缺失、 缺失的数目、 以及多拷贝 (CNVs)， 从而实现基因缺失和基因多拷贝的同步 快速检测， 本发明方法灵敏度高， 只需普通的荧光 定量 PCR 仪就能完成基因缺失和基因多拷贝的同 步快速检测， 通过实验也证实本发明的方法。
3、准确 可靠。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 序列表 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 12 页 序列表 7 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种基因拷贝数的定量检测方法， 包括如下步骤 ： 1) 分别选取目的基因、 参比基因的扩增序列 ； 2) 分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、 荧光探针， 及目的基因扩增序列的 封闭探针， 封闭探针包括上游封闭探针和下游封闭探针 ； 3) 样本检测 ： 以待检 DNA 样本作为模板， 对目的基因和参比基因进行多重 TaqMan 荧光 定。
4、量 PCR 反应， 并以目的基因拷贝数已知的 DNA 样本为对照样本， 分别记录 Ct 值 ； 4) 结果分析 ： 计算待检样本目的基因的拷贝数相对定量值， 判断分析检测样本目的基 因的拷贝数。 2. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 封闭探针的 3 末 端经过修饰失去了延伸能力。 3. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 目的基因的引物、 封闭探针分别与目的基因的结合位点相同。 4. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 目的基因、 参比基 因的引物的 5 末端分别引入了 4 7 bp 与基因组模。
5、板非互补的碱基序列。 5. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 封闭探针比目的 基因的引物的 Tm 值高 3 5。 6. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 扩增序列为一段 GC 含量 40 60%、 长度 70 150bp 的 DNA 序列， 且与基因非扩增区无同源序列。 7. 根据权利要求 2 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 封闭探针的 3 末 端经 Spacer C3 修饰。 8. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 进行多重 TaqMan 荧光定量 PCR 反应时， 先预扩。
6、增 3 5 个循环， 再进行实时荧光定量检测。 9. 根据权利要求 8 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 预扩增的变性温 度为 94 96， 退火温度为 52 55； 实时荧光定量检测的变性温度为 90 92， 退火 温度为 60 62。 10. 根据权利要求 1 所述的基因拷贝数的定量检测方法， 其特征在于 ： 参比基因为待检 DNA 样本所属物种基因组中的一种看家基因。 权 利 要 求 书 CN 102618646 A 2 1/12 页 3 一种基因拷贝数的定量检测方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及一种基因拷贝数的定量检测方法。 背景技术 000。
7、2 近年来的研究发现， 基因拷贝数变异 (copy number variants, CNVs) 和单核苷 酸多态性 (SNPs) 一样， 是分子进化和遗传多态性的重要遗传标志， 也是某些疾病的发病分 子基础， 当前越来越多的 CNVs 被发现并提交到相应的分子生物学数据库。 0003 就分子机制而言， CNVs 的实质是一段 DNA 序列的拷贝数变化。某一个体的一套基 因组DNA中， 正常情况下某等位基因的拷贝数为2个， 如果两条染色体上的此基因均缺失则 拷贝数为 0， 如果其中 1 条染色体上缺失则拷贝数为 1， 如果其中 1 条染色体上于此基因序 列后又有 1 段此基因序列则拷贝数为 3。
8、（常称之为多拷贝） ， 如果 2 条染色体均出现此基因 的重复序列， 则拷贝数为 4 等。由于基因拷贝数的差异， 往往直接导致所编码蛋白表达量及 表达水平的变化， 从而导致一系列的生物学效应。就人类而言， CNVs 不仅可以为人类进化 研究提供信息， 且 CNVs 所导致的生物学效应， 涉及到药物敏感性、 药物治疗靶点、 疾病的发 病机制分析、 疾病诊断标志物、 疾病治疗疗效评估等众多领域， 因此， 基因 CNVs 检测有着非 常重要的实际意义。 0004 基因拷贝数变异可分为基因缺失和基因多拷贝。当前的检测技术方案主要为针 对基因缺失及多拷贝分别进行检测与分析， 也就是采用一套技术方案检测基。
9、因缺失， 采 取另一套技术方案检测基因多拷贝。目前， 检测基因缺失的主要技术是跨越断裂点 PCR （gap-PCR） 技术 ； 检测基因多拷贝的技术报道较少， 比较典型的为采用长片段 PCR 扩增检 测基因三联体 （如珠蛋白基因 1 和 / 或 2） 。最近， MLPA 技术 （多重连接探针扩增技术 Multiplex ligation-dependent Probe amplification） 的开发与应用， 虽然能同时检测基 因缺失和基因多拷贝， 但其检测成本高、 操作繁琐、 需要特殊的仪器设备等技术限制， 不适 合常规使用。因此， 开发一种准确稳定、 简单实用， 能同时检测基因缺失和基。
10、因多拷贝的常 规技术与方法， 是当前的迫切需要。 0005 生物体基因组中的看家基因 （house-keeping gene， 如哺乳动物的 肌动蛋白基 因、 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因等） ， 已证实其没有拷贝数变异， 即 1 套基因组中， 其无论在 什么情况下都是2个拷贝。 根据定量PCR的技术原理， 结合基因缺失和基因多拷贝的拷贝数 变化规律， 可以获知 ： 当HKG和受检功能基因的均为正常的2个拷贝， 且2个PCR反应的扩增 效率均为 100%， 则两者扩增达到一定产物量的循环数相等， 即 Ct 值相等， Ct 值差异为 0 ； 如 果功能基因缺失了 1 个， 则其扩增达一定产物量。
11、较 HKG 多 1 个循环， 即 Ct 值差异为 1 ； 如果 功能基因为3个拷贝， 则其扩增达一定产物量较HKG少0.27个循环， 即Ct值差异为-0.27 ； 如果功能基因完全缺失 （拷贝数为 0） ， 就不会有其扩增曲线及 Ct 值。 0006 根据上述规律， 结合目前广泛应用的多重 TaqMan 实时定量 PCR 技术， 通过体系优 化及调整， 其分析灵敏度可达到的Ct值差异为0.81.0， 故能准确检测功能基因0、 1、 2拷 贝， 但不能准确分析 Ct 值差异仅为 0.27 的 3 个拷贝， 故多重 TaqMan 实时定量 PCR 技术也 说 明 书 CN 102618646 A 。
12、3 2/12 页 4 存在一定的局限性。 因此， 如果能发明有效的技术与方法， 使功能基因缺失和多拷贝所导致 的 Ct 值差异增大， 以达到定量 PCR 技术的灵敏度有效范围， 也就能应用定量 PCR 技术实现 基因缺失和多拷贝的同时快速检测。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种基因拷贝数的定量检测方法。 0008 本发明所采取的技术方案为 ： 一种基因拷贝数的定量检测方法， 包括如下步骤 ： 1) 分别选取目的基因、 参比基因的扩增序列 ； 2) 分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、 荧光探针， 及目的基因扩增序列 的封闭探针， 封闭探针包括上游封闭探针和下游封闭探针 ； 3。
13、) 样本检测 ： 以待检 DNA 样本作为模板， 对目的基因和参比基因进行多重 TaqMan 荧 光定量 PCR 反应， 并以目的基因拷贝数已知的 DNA 样本为对照样本， 分别记录 Ct 值 ； 4) 结果分析 ： 计算待检样本目的基因的拷贝数相对定量值， 判断分析检测样本目的 基因的拷贝数。 0009 优选的， 封闭探针的 3 末端经过修饰失去了延伸能力。 0010 优选的， 目的基因的引物、 封闭探针分别与目的基因的结合位点相同。 0011 优选的， 目的基因、 参比基因的引物的 5 末端分别引入了 4 7bp 与基因组模板 非互补的碱基序列。 0012 优选的， 封闭探针比目的基因的引。
14、物的 Tm 值高 3 5。 0013 优选的， 增加封闭探针 3 末端与目的基因的结合位点， 使封闭探针比目的基因的 引物的 Tm 值高 3 5。 0014 优选的， 扩增序列为一段 GC 含量 40 60%、 长度 70 150bp 的 DNA 序列， 且与基 因非扩增区无同源序列。 0015 优选的， 封闭探针的 3 末端经 Spacer C3 修饰。 0016 优选的， 进行多重 TaqMan 荧光定量 PCR 反应时， 先预扩增 3 5 个循环， 再进行实 时荧光定量检测。 0017 优选的， 预扩增的变性温度为 94 96， 退火温度为 52 55； 实时荧光定量检 测的变性温度为 。
15、90 92， 退火温度为 60 62。 0018 优选的， 参比基因为待检 DNA 样本所属物种基因组中的一种看家基因。 0019 本发明在进行多重TaqMan荧光定量PCR反应前， 需先对多重TaqMan荧光定量PCR 反应体系进行优化， 优化的步骤如下 ： 1) 优化体系中目的基因和参比基因的引物、 荧光探针、 缓冲液、 Taq 酶、 镁离子、 dNTPs、 模板 DNA 的浓度， 使多重 TaqMan 荧光定量 PCR 体系中各单重 PCR 反应的扩增效率达 95 100%。 0020 2) 优化体系中目的基因的封闭探针浓度， 使多重TaqMan荧光定量PCR体系 的 Ct 值比未加封闭。
16、探针的 Ct 值高 1.0 1.5。 0021 由于看家基因在群体中无拷贝数变异现象， 故将看家基因作为参比基因。 0022 本发明的技术方案中的要求及方法原理如下 ： 说 明 书 CN 102618646 A 4 3/12 页 5 （1） 初始模板封闭的技术策略 ： 本发明设计的封闭探针， 能与部分初始模板的目的基因 扩增序列位点结合， 由于封闭探针的 3 末端经过修饰失去了延伸能力， 故封闭探针能将部 分初模板封闭， 使其在 PCR 反应中不能扩增。而目的基因的封闭探针、 引物与目的基因的 结合位点相同， 故封闭探针、 引物与模板竞争性结合， 封闭探针与模板结合后目的基因不扩 增， 引物与。
17、模板结合后目的基因能正常扩增， 这样就导致目的基因和内参基因不能等比例 扩增， 以至于扩大了目的基因和参比基因 Ct 值之间的比值， 扩大了受检样本初始模板拷贝 数差异。 0023 （2） 封闭探针的设计原则及通用要求 ： 本发明所采用的封闭策略， 是基于封闭探 针和引物对初始模板的竞争性结合和选择性封闭， 因此， 封闭探针和引物所结合的模板 DNA 序列基本一致， 所以引物和封闭探针的 DNA 序列也基本一致， 这是关于封闭探针设计的第 一个通用要求 ； 其次， 封闭的目的是使一部分初始模板在 PCR 反应中不能扩增， 也就是封闭 探针与模板的结合不会导致扩增反应， 因此， 封闭探针的结构也。
18、就不同于引物， 必须阻止其 在 PCR 反应中发生 3 端的延伸， 也就是于封闭探针 3 末端进行修饰， 如 Spacer C3 标记等， 以阻止其 3 端延伸， 这是关于封闭探针设计的第二个通用要求 ； 另外， 封闭探针的 Tm 值须 稍高于扩增引物 3 5， 以保证在退火过程中， 封闭探针稍先与初始模板结合以达到封闭 目的， 为满足这一要求， 可增加封闭探针 3 末端与目的基因的结合位点， 即增加封闭探针 3 末端与目的基因互补的碱基序列， 这是封闭探针设计的第三个通用要求。 0024 （3） 反应体系中封闭探针加入量的确定 ： 封闭探针量过多则使有效扩增模板太少 而影响定量 PCR 反应。
19、的敏感性与稳定性， 封闭探针量太少则不能达到定量检测的灵敏度的 Ct 值差异要求。本发明的技术方案中， 首先对多重 TaqMan 荧光定量 PCR 体系进行优化调 整， 使各 PCR 反应的扩增效率均基本达到 100%， 然后再调整所加入的封闭探针量， 采用的具 体方法是在反应体系中加入 DNA 样本量和扩增引物浓度不变的情况下， 分别加入不同浓度 的封闭探针， 定量检测结果可以观察到， 随着封闭探针浓度的增加， 目的基因定量 PCR 的 Ct 值增高， 以未加封闭探针反应体系的 Ct 值为标准， Ct 值增高 1.0 1.5 的封闭探针浓度为 合适浓度。 0025 （4） 短片段目的序列嵌套。
20、 PCR 预扩增设计 ： 为保证定量 PCR 的分析灵敏度达到 Ct 值差异 0.8 1.0， 除对体系组份的常规优化外， 本发明采用了短片段目的序列嵌套 PCR 预 扩增设计， 以确保检测体系的特异性、 敏感性、 稳定性和准确性， 其具体的技术要求是 ： PCR 扩增序列少于 150bp， 上下游引物 5 端分别引入 4 7bp 基因组模板非互补碱基， 先于高变 性温度结合低退火温度预扩增35个循环， 以合成下一步荧光定量检测的人工模板序列 ； 再于低变性温度给合高退火温度进行实时荧光定量检测。 这种设计， 采用短片段扩增， 可明 显提高 PCR 体系扩增效率和敏感性 ； 低变性温度给合高退。
21、火温度可保证定量检测的模板为 预扩增所合成的人工模板序列， 减少与待检样本基因组 DNA 其它序列的非特异性扩增而提 高体系的特异性、 稳定性和准确性。 0026 （5） 样本检测设置要求及数据分析模式 ： 根据定量 PCR 技术原理， 如果 2 个 PCR 反 应的扩增效率均为 100%， 且初始模板拷贝数相同， 则两者扩增达到一定产物量所需的循环 数相同， 即 Ct 值相同。然而， 在实际检测中， 由于仪器荧光读取性能及阈值设定的差异， 会 导致 2 个 PCR 反应的 Ct 值不相等， 但是， 在同一仪器、 同一批试剂和同一批检测反应中， 两 者之间的差异为一恒定值。 因此， 在每一批样。
22、本检测时， 以待检目的基因拷贝数已知的正常 说 明 书 CN 102618646 A 5 4/12 页 6 标本为对照样本， 取 1 2 份对照样本与待检样本同样条件下进行多重 PCR 检测， 结合文献 报道的2-Ct相对定量数据分析模式 （Kenneth J,et al. METHODS. 2001;25: 402408.） ， 以对照样本的 1 2 个 PCR 反应的 Ct 值差异 （Ct） 为标准， 将待检样本的 Ct 与其比较， 计算两 Ct 间的差异值 （Ct） ， 最后计算待检样本目的基因拷贝数相对定量值 ： 2-Ct， 该 值即为 ： 待检样本目的基因相对于内参基因拷贝数的倍数，。
23、 故可得到目的基因的拷贝数， 但 由于实际检测中因为操作过程及仪器本身的误差， 得到的数值近似等于理论值， 具体的计 算公式如下 ： 待检样本 （或对照样本） 目的基因 Ct Ct_目的基因 Ct_参比基因 待检样本目的基因 Ct Ct_待检样本 Ct_对照样本 待检样本目的基因拷贝数相对定量值 ： 2-Ct。 0027 本发明的有益效果是 ： 本发明能直接定量检测功能基因的拷贝数， 直接反映受检基因是否有缺失、 缺失的数 目、 以及多拷贝 (CNVs)， 从而实现基因缺失和基因多拷贝的同步快速检测， 本发明方法灵敏 度高， 只需普通的荧光定量 PCR 仪就能完成基因缺失和基因多拷贝的同步快速。
24、检测， 通过 实验也证实本发明的方法准确可靠。 0028 本发明采用初始模板封闭策略， 在检测体系中加入一定量目的基因封闭探针， 利 用探针、 引物与扩增模板的竞争性结合， 将一部分初始模板封闭， 使其在 PCR 反应中不能扩 增， 使功能基因缺失和多拷贝所导致的 Ct 值差异增大。 0029 本发明采用多重 TaqMan 实时荧光定量 PCR 技术， 以短片段扩增子设计方式， 经过 对核酸模板的选择性封闭及扩增子模板预扩增， 能定量检测样本中基因组目的基因拷贝 数。 附图说明 0030 图 1 是不同封闭探针浓度的小鼠 SRY 基因定量 PCR 检测 Ct 值变化图 ； 图 2 是小鼠 SR。
25、Y 基因 CNVs 封闭前后 Ct 及 2-Ct值对比分析图 ； 图 3 是不同封闭探针浓度的 1、 2 基因定量 PCR 检测 Ct 值变化图。 具体实施方式 0031 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明， 但并不局限如此。 0032 实施例 1 小鼠 SRY 质粒载体基因拷贝数的检测 本实施方案选择小鼠 SRY 基因质粒载体为检测对象， 应用本发明同时检测基因缺失和 基因多拷贝的方法， 检测 SRY 基因拷贝数， 通过对基因拷贝数结果的分析， 以观察本方法用 于检测目的基因缺失及多拷贝的可行性与有效性， 尤其是封闭探针的封闭效果观察。 0033 选择依据及代表性 ： 采用基因克隆技。
26、术， 将一段约 400bp 的小鼠 SRY 基因序列， 一段约 400bp 的小鼠看家基 因-Actin， 连接至T载体环状DNA序列中， 分别作为目的基因和参比基因的检测对象。 所 构建的 T 载体， 经转化、 增菌、 分离、 纯化后， 采用紫外分光光度法检测其浓度及纯度。由于 所采用的载体相同， 克隆的片段长度基本一致， 所以， 根据其浓度配制成目的基因与参比基 因拷贝数比例为 0:1、 0.5:1、 1:1、 1.5:1、 2:1 的基因拷贝数已知样本， 其对应的则是目的基 说 明 书 CN 102618646 A 6 5/12 页 7 因 0 拷贝 （缺失 2 个） 、 1 拷贝 （缺。
27、失 1 个） 、 2 拷贝 （正常） 、 3 拷贝 （多拷贝） 、 4 拷贝 （多拷贝） ； 然 后， 根据本发明所建立的检测方法进行目的基因拷贝数定量检测， 以验证本方法的可行性 与有效性。 0034 实验步骤 ： 1、 目的基因和参比基因扩增序列的选择 以小鼠 SRY 基因为目的基因、 小鼠 -Actin（ 肌动蛋白） 为参比基因， 按本发明的技 术策略要求， 选取扩增序列 ： SRY 基因的扩增序列见 SEQ ID NO. 1， -Actin 基因的扩增序列见 SEQ ID NO. 2。 0035 2、 引物、 荧光探针、 封闭探针设计 按本发明方法， 设计相应的引物、 荧光探针、 封闭。
28、探针， 包括特异性扩增 SRY 的上下游 引物， 上下游封闭探针和荧光探针， -Actin 基因的上下游引物和荧光探针， 各引物、 探针 序列见表 1。表中， 引物 5 末端的小写字母为与基因组模板非互补的碱基序列， 封闭探针 3 端的小写字母为增加的与基因组模板互补的碱基序列， 使 SRY 封闭探针比 SRY 引物的 Tm 值高 4。 0036 3、 双重 TaqMan 荧光定量 PCR 体系优化 经过一系列的优化、 调整及扩增效率评价， 所确定的双重 TaqMan 荧光定量 PCR 反应优 化体系如表 2 所示， 本方案用的是质粒 DNA， 所以于体系中加入鲑鱼精以构建包含多种 DNA 序。
29、列的基质环境。优化 PCR 扩增反应条件 ： 95预变性 5min， 94 30sec+58 30sec+ 52 30sec、 3 个循环， 90 20sec+60 1min、 35 个循环， 于 60退火步骤末采集荧光信 号。PCR 扩增条件中， 94为预扩增的变性温度，“58 30sec” 为封闭探针杂交封闭过程， 52为预扩增的退火温度。所使用的仪器为 Strategene MX3005p 五通道荧光定量 PCR 仪， 双重 TaqMan 荧光定量 PCR 反应体系中各单重 PCR 反应的扩增效率为 95 100%。 说 明 书 CN 102618646 A 7 6/12 页 8 003。
30、7 4、 样本检测 按 2-Ct值基因拷贝数相对定量数据分析模式要求， 及本发明的技术策略， 在每一轮 PCR检测的样本中， 以SRY与-Actin基因拷贝数比例为1:1的样本作为对照样本， 取4份 与待检样本在同样条件下进行多重PCR检测， 其中2份的数据计算对照样本， 另外的则作为 质控样本， 应用上述已优化的反应体系及反应条件进行检测， 记录检测 Ct 值。 0038 5、 结果分析 根据定量检测所获得的 Ct 值， 按下述公式进行计算 ： 待检样本 （或对照样本） 目的基因 Ct Ct_目的基因 Ct_参比基因 待检样本目的基因 Ct Ct_待检样本 Ct_对照样本 待检样本目的基因拷。
31、贝数相对定量值 ： 2-Ct。 0039 实验结果 ： 1、 不同封闭探针浓度的封闭效果 （封闭探针浓度优化） ： 本实施例中， 在反应体系中所加入基因组 DNA 样本量和扩增引物浓度不变的情况下， 分别加入不同浓度的封闭探针， 结果显示， 随着封闭探针浓度的增加， 目的基因定量 PCR 分 析的 Ct 值增高 （见表 3 和图 1） 。Ct 值增高， 则直接反映定量分析的模板数减少， 也就证实 了封闭探针封闭了一部分原始模板， 使其在 PCR 反应中不能扩增， 导致了定量分析的模板 数减少而 Ct 值增高。本实验中， 当加入 0.2 pmol/20ul 封闭探针量时， 其 Ct 值增高幅度为。
32、 1.26， 此即封闭探针合适浓度。 说 明 书 CN 102618646 A 8 7/12 页 9 0040 2、 小鼠 SRY 基因 CNVs 样本封闭前后 2-Ct值比较 ： 本实施例中， 将小鼠 -Actin 基因和 SRY 基因质粒载体， 按比例配制成 0.5:1、 1:1、 1:1.5、 1:2 的已知拷贝数比例样本 ； 然后采用本方案所建立的， 包含和未含封闭探针的检 测体系， 同时进行检测， 对比分析定量分析的 Ct 值及 2-Ct值。实验结果显示 （见表 4 和 图 2） ， 目的基因封闭后， 其定量检测 Ct 值增高， 因此与参比基因相比较的 Ct 值大 ； 基于正 常对照。
33、样本的数据分析 2-Ct值， 目的基因 1 拷贝封闭后较未封闭稍有减小 （表 4 斜体字部 分） ； 目的基因 3 拷贝和 4 拷贝封闭后较未封闭明显增高 （表 4 下划线部分） 。 0041 结果统计的数据显示， 经过封闭后， SRY 基因拷贝数为 1、 2、 3、 4 的 Ct 值分别为 3.60-4.05、 2.40-2.43、 1.49-1.56、 0.85-0.94， 不同拷贝数之间的差异值均大于 1.0， 达到 定量 PCR 的灵敏度要求。 0042 实施例 2 人类 珠蛋白基因的基因拷贝数检测 本实施方案选择人类 珠蛋白基因为检测对象， 应用所发明的同时检测基因缺失和 基因多拷贝。
34、的方法， 检测其拷贝数， 通过对基因拷贝数结果的分析， 以观察本方法用于检测 说 明 书 CN 102618646 A 9 8/12 页 10 目的基因缺失及多拷贝的可行性与有效性， 尤其是方法的准确性与稳定性。 0043 选择依据及代表性 ： 珠蛋白基因的 CNVs 在人类基因组中很常见， 有研究认为这种现象是人类进行化过 程中与疟疾的自然选择相关。 珠蛋白基因缺失和多拷贝， 均可导致所编码珠蛋白表达 降低可增高， 而导致一系列的生物学性状 ： 基因缺失导致 珠蛋白表达减少而导致 - 地 贫， 基因多拷贝导致 珠蛋白表达增加而加重 - 地贫症状。另外， 珠蛋白基因簇中， 1 和 2 这两个基。
35、因为高 GC 含量， 且高度同源， 其编码的多肽链完全相同， 基因结构中， 两者的 X、 Y、 Z 盒的 DNA 序列基本相同， 仅在第二内含子及 3 端非翻译区有些区别， 而且还 存在 2 与 1 基因在缺失情况下的形成融合基因的情况， 这种情况在哺乳动物的基因组 DNA 序列中并不少见。并且， 目前 珠蛋白基因缺失检测的常规方法为 gap-PCR 技术， 尚 存在难以克服的假阳性及假阴性技术瓶颈 ； 而对于多拷贝的检测， 则必须另外进行检测， 且 基本上只局限于 珠蛋白基因三联体的分析。根据上述以 珠蛋白基因 DNA 序列的特殊 性与代表性， 和拷贝数变化为本质的分子机制， 以及以判断功能。
36、基因拷贝数为最终目标的 分子生物学检测基本策略， 说明所选择的研究靶点具有典型的代表性， 满足所发明技术方 案的实施及验证。因此， 本实施例以人类 珠蛋白基因的 CNVs 检测为研究靶点， 应用所发 明的 “基因组拷贝数检测的荧光定量 PCR 技术方案” ， 实现同一体系同步检测 珠蛋白基 因缺失及多拷贝， 验证了此技术方案的可行性与有效性， 为此技术方案广泛用于基因组 DNA 拷贝数定量检测提供理论指导及应用参考。 0044 实验步骤 ： 1、 目的基因和参比基因扩增序列的选择 以人的 1 和 2 珠蛋白基因为目的基因、 人的 -Actin（看家基因， 肌动蛋白） 为 参比基因， 按本发明的。
37、技术策略要求， 选取扩增序列 ： 1 珠蛋白基因的扩增序列见 SEQ ID NO. 11， 2 珠蛋白基因的扩增序列见 SEQ ID NO. 12， -Actin 基因的扩增序列见 SEQ ID NO. 13。 0045 2、 引物、 荧光探针、 封闭探针设计 按本发明方法， 设计相应的引物、 荧光探针、 封闭探针， 包括特异性扩增1和2珠蛋 白基因的上、 下游引物， 上、 下游封闭探针和荧光探针， -Actin 基因的上、 下游引物和荧光 探针， 各引物、 探针序列见表 5。表中， 1 的封闭探针比引物的 Tm 值高 3 4， 2 的封 闭探针比引物的 Tm 值高 3 4。表中， 引物 5 。
38、末端的小写字母为与基因组模板非互补的 碱基序列， 封闭探针 3 端的小写字母为增加的与模板互补的碱基序列， 使 SRY 的封闭探针 比 SRY 的引物 Tm 值高 3 4。 说 明 书 CN 102618646 A 10 9/12 页 11 0046 3、 三重 TaqMan 荧光定量 PCR 体系优化调整 经 过 一 系 列 的 优 化、 调 整 及 扩 增 效 率 评 价， 所 确 定 的 三 重 TaqMan 荧 光 定 量 PCR 反 应 优 化 体 系 如 表 6 所 示 ； 优 化 PCR 扩 增 条 件 为 95 预 变 性 8min， 94 30sec+58 30sec+52 。
39、30sec、 3 个循环， 90 20sec+60 1min、 35 个循环， 于 60退 火步骤末采集荧光信号。PCR 扩增条件中， 94为预扩增的变性温度，“58 30sec” 为封闭 探针杂交封闭过程， 52为预扩增的退火温度。所使用的仪器为 Strategene MX3005p 五通 道荧光定量 PCR 仪， 三重 TaqMan 荧光定量 PCR 反应体系中各单重 PCR 反应的扩增效率均为 95 100%。 说 明 书 CN 102618646 A 11 10/12 页 12 0047 4、 样本检测 按 2-Ct值基因拷贝数相对定量数据分析模式要求， 及本发明的技术策略， 在每一轮。
40、 PCR检测的样本中， 以珠蛋白基因拷贝数已知 （一般情况下选择1和2珠蛋白基因拷 贝数均为 2 的正常标本） 的 gDNA 标本作为对照样本， 取 3 4 份与待检样本在同样条件下 进行多重 PCR 检测， 其中 2 份作为对照样本， 另外的则作为质控样本， 应用上述已优化的反 应体系及反应条件进行检测， 记录检测 Ct 值。 0048 5、 结果分析 计算公式同实施例 1。 0049 实验结果 ： 1、 不同封闭探针浓度的封闭效果 （封闭探针浓度优化） ： 本实施例中， 在反应体系中所加入基因组 DNA 样本量和扩增引物浓度不变的情况下， 分别加入不同浓度的封闭探针， 结果显示， 随着封闭。
41、探针浓度的增加， 目的基因定量 PCR 分 析的 Ct 值增高 （见表 7 和图 3） 。Ct 值增高， 则直接反映定量分析的模板数减少， 也就证实 了封闭探针封闭了一部分原始模板， 使其在 PCR 反应中不能扩增， 导致了定量分析的模板 数减少而 Ct 值增高。本实验中， 当加入封闭探针量 1 基因为 0.3 pmol/20ul、 2 基因为 0.1 pmol/20ul 时， 其 Ct 值增高幅度为 1.0 1.5， 此即封闭探针合适浓度。 说 明 书 CN 102618646 A 12 11/12 页 13 0050 2、 珠蛋白基因 CNVs 样本封闭前后 2-Ct值比较 ： 本 实 施。
42、 例 中， 收 集 了 正 常 对 照， 以 及 基 因 型 为 /、 -3.7/、 -4.2/ 、 -SEA/、 anti3.7/、 anti4.2/、 -3.7/-3.7、 -4.2/-4.2的样本各 2 例， 这些样本包含了 1 或 / 和 2 珠蛋白基因 0、 1、 2、 3 个拷贝 （见表 8 所列） 。采用本方 案所建立的包含和未含封闭探针的检测体系， 同时进行检测， 对比分析定量分析的 Ct 值 及 2-Ct值。实验结果显示 （见表 8） ， 目的基因封闭后， 其定量检测 Ct 值增高， 因此与参比 基因相比较的 Ct 值大 ； 基于正常对照样本的数据分析 2-Ct值， 目的基因。
43、 1 拷贝封闭后 较未封闭稍有减小 （表 8 加粗斜体字部分） ； 目的基因 3 拷贝封闭后较未封闭明显增高 （表 8 加粗下划线字体部分） 。 说 明 书 CN 102618646 A 13 12/12 页 14 0051 结论 ： 本实施例的实验结果证明， 本发明所述的方法可广泛用于基因组拷贝数 CNVs 定量检测。 说 明 书 CN 102618646 A 14 1/7 页 15 南方医科大学 一种基因拷贝数的定量检测方法 26 PatentIn version 3.5 1 80 DNA Mouse 1 ccactgcaga aggttgtaca gttttgttga ggcaactgc。
44、a ggctgtaaaa tgccactcct 60 ctgtgacact ttagccctcc 80 2 76 DNA Mouse 2 taaacctaga aggttgctct gacaaccaca gggcccaccc tcaccaagct aaggatgctt 60 agcttacctt gatctt 76 3 24 DNA 人工引物 3 序 列 表 CN 102618646 A 15 2/7 页 16 gatgaccact gcagaaggtt gtac 24 4 23 DNA 人工引物 4 ggtgaggagg gctaaagtgt cac 23 5 26 DNA 人工引物 5 g。
45、gtgataaac ctagaaggtt gctctg 26 6 28 DNA 人工引物 6 ggtctaagat caaggtaagc taagcatc 28 7 21 DNA 人工序列 7 ccactgcaga aggttgtaca g 21 序 列 表 CN 102618646 A 16 3/7 页 17 8 20 DNA 人工序列 8 ggagggctaa agtgtcacag 20 9 25 DNA 人工序列 9 ctgcaggctg taaaatgcca ctcct 25 10 20 DNA 人工序列 10 aaccacaggg cccaccctca 20 11 79 DNA Hu。
46、man 11 gggtgctgac ctgatgcact cctcaaagca agatcttctg ccagaccccc aggaaatgac 60 ttatcagtga tttctcagg 79 12 序 列 表 CN 102618646 A 17 4/7 页 18 73 DNA Human 12 cctgtgtaca acttcctatt ctcagtgaag tgtctcccct gcatcccttt cagccagttc 60 attcagctct gcg 73 13 77 DNA Human 13 cctactgtgc acctacttaa tacacactcc aaggccgct。
47、t tacaccagcc tcatggcctt 60 gtcacacgag ccagtgt 77 14 20 DNA 人工引物 14 gcttgggtgc tgacctgatg 20 15 27 DNA 人工引物 15 cgttccctga gaaatcactg ataagtc 27 序 列 表 CN 102618646 A 18 5/7 页 19 16 27 DNA 人工引物 16 tcgtcctgtg tacaacttcc tattctc 27 17 21 DNA 人工引物 17 gcatcgcaga gctgaatgaa c 21 18 29 DNA 人工引物 18 ggtccctact gtgcacctac ttaatacac 29 19 21 DNA 人工引物 19 gctgacactg gctcgtgtga c 。