《液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置与方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置与方法.pdf（12页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102504991 A (43)申请公布日 2012.06.20 CN 102504991 A *CN102504991A* (21)申请号 201110306663.2 (22)申请日 2011.10.11 C12M 1/00(2006.01) C12M 1/42(2006.01) C12M 1/38(2006.01) C12M 1/36(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 13/00(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院卫 生装备研究所 地址 300161 天津市河东区万东路 106 号 (72)发明人 杜耀。
2、华 吴太虎 陈锋 程智 顾彪 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 张金亭 (54) 发明名称 液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置与 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种液样中细菌的非特异性 快速富集纯化装置， 该装置包括控制系统和流路 系统 ； 流路系统包括吸附柱、 缓冲液瓶、 磁性分离 柱、 出样管、 废液瓶和连通各组件的管路 ； 吸附 柱、 三通阀 A、 蠕动微泵、 磁性分离柱、 三通阀 B、 三 通阀 C 构成一个闭合的液流循环通道 ； 三通阀 A 与缓冲液瓶相连， 三通阀 B 与出样管相连， 三通阀 C 与废液瓶相连， 加热块设置在吸附柱的。
3、底部， 温 度传感器贴于吸附柱内腔底部的壁面上， 磁性分 离柱处于电磁铁磁极的环抱中， 主控模块控制蠕 动微泵、 三通阀A、 三通阀B、 三通阀C、 加热块和电 磁铁。本发明还公开了利用上述装置对液样中细 菌进行非特异性快速富集纯化的方法。本发明实 现了液样中细菌的非特异性快速富集纯化。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 该装置包括控制系统 和流路系统 ； 所述控制系。
4、统包括蠕动微泵、 三通阀 A、 三通阀 B、 三通阀 C、 加热块、 温度传感 器、 电磁铁和主控模块 ； 所述流路系统包括吸附柱、 缓冲液瓶、 磁性分离柱、 出样管、 废液瓶 和连通各组件的管路 ； 所述吸附柱、 三通阀 A、 蠕动微泵、 磁性分离柱、 三通阀 B、 三通阀 C 由 所述管路依次首尾相连， 构成一个闭合的通道， 液流循环通道中的液体在蠕动微泵的推动 下， 依次沿吸附柱、 三通阀 A、 蠕动微泵、 磁性分离柱、 三通阀 B、 三通阀 C、 吸附柱的方向循环 流动 ； 所述三通阀A的第三个接口端与缓冲液瓶相连， 所述三通阀B的第三个接口端与出样 管相连， 所述三通阀 C 的第三个。
5、接口端与废液瓶相连， 所述加热块紧密贴合环抱在吸附柱 的底部， 所述温度传感器贴于吸附柱内腔室底部的壁面上， 所述磁性分离柱处于电磁铁磁 极的紧密贴合环抱中， 所述主控模块按照设定的时序和指令集合对所述蠕动微泵、 三通阀 A、 三通阀 B、 三通阀 C 和电磁铁进行控制， 并根据所述温度传感器反馈的温度信号和温度控 制程序对加热块进行闭环控制， 使所述吸附柱内腔室中的液体温度达到并稳定在预设吸附 温度。 2. 根据权利要求 1 所述的液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 所 述蠕动微泵每分钟的最大流量应不小于所述吸附柱内腔室的容积。 3. 根据权利要求 1 所述的液样中细菌的非。
6、特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 所 述电磁铁的磁极端面厚度覆盖所述磁性分离柱的整个内腔室。 4. 根据权利要求 1 所述的液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 所 述吸附柱、 磁性分离柱和出样管均是由惰性材料制成的， 所述吸附柱、 磁性分离柱和出样管 的内腔室壁面均经过硅烷化疏水处理。 5. 根据权利要求 1 所述的液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 所 述吸附柱的内腔室呈漏斗形， 漏斗最底端为出液口。 6. 根据权利要求 1 所述的液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 所 述纳米磁珠为表面全裸或修饰羧基基团， 直径为 50 200nm。
7、 的单分散超顺磁性颗粒。 7. 根据权利要求 1 所述的液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 其特征在于， 所 述磁性分离柱内填充有直径为2001000m的导磁珠， 所述导磁珠是由软磁材料制成的。 8.一种利用如权利要求17任意一项所述装置对液样中细菌进行非特异性快速富集 纯化的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 加样 ： 将待富集细菌的样本溶液和纳米磁珠悬液加入到吸附柱中 ； 2) 非特异性吸附 ： 加热吸附柱， 使其中溶液的温度达到预设吸附温度， 并在整个富集 纯化过程中始终维持这一温度， 在控温过程中， 开启蠕动微泵， 样本和纳米磁珠的混合液在 液流循环通道中循环流动， 经过。
8、数次循环， 混合液中的细菌被纳米磁珠吸附， 形成纳米磁 珠 - 细菌复合物 ； 3) 磁性分离 ： 电磁铁加电产生外加磁场， 降低蠕动微泵的速度， 使混合液多次缓慢通 过磁性分离柱， 液流中的纳米磁珠 - 细菌复合物和未吸附到细菌的游离纳米磁珠被吸引到 导磁珠表面或磁性分离柱内腔室的侧壁上， 排出剩余液体 ； 4) 清洗 ： 吸取适量缓冲液对吸引在磁性分离柱内的磁珠 - 细菌复合物进行清洗， 并将 清洗液排出 ； 5) 洗脱出样 ： 撤销电磁铁的外加磁场， 将缓冲液注入磁性分离柱， 导磁珠表面和磁性 权 利 要 求 书 CN 102504991 A 2 2/2 页 3 分离柱内腔室侧壁上的磁珠。
9、 - 细菌复合物被洗脱下来， 收集洗脱液， 该洗脱液即为细菌的 富集纯化液。 9. 根据权利要求 8 所述的液样中细菌的非特异性快速富集纯化方法， 其特征在于， 在 样本溶液加入吸附柱前， 进行过滤处理， 滤除粒径超过 20m 的杂质颗粒。 权 利 要 求 书 CN 102504991 A 3 1/7 页 4 液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置与方法 技术领域 0001 本发明涉及卫生安全检疫、 环境监测等相关领域的样本前处理技术， 特别是涉及 一种液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置与方法。 背景技术 0002 对特定的指示细菌尤其是致病细菌进行检测是卫生安全检疫、 环境监测等领域的 一项。
10、重要工作。 在食品卫生安全、 环境水质监控等实际应用场合， 配制或采集的原始液体样 本(主要是水溶液样本)中指示细菌的含量通常较低， 但背景杂质却很复杂， 现有的检测方 法难以直接检出， 必须要预先对其进行富集和纯化。 因此， 液样中细菌的富集纯化成为决定 检测成败的关键因素， 快速高效的富集和纯化无疑将有助于提高检测的灵敏度和可靠性。 0003 当前常用的液样中细菌的富集纯化方法有选择性过滤、 密度梯度离心、 化学沉淀 等， 市场上已有一些基于相关原理的商用产品， 例如美国 Millipore 公司的切向流系统 Labscale 和 Pellicon ； 离心系统 Centricon Plu。
11、s-70 等。这些方法和产品在实际应用时存 在诸如容易堵塞、 耗时较长、 富集效率偏低、 纯化效果不佳等种种问题， 局限性较大， 通常还 需要真空泵、 离心机等设备配合， 操作和使用都不够方便。 随着超顺磁性微珠技术的逐渐成 熟， 基于磁珠吸附与分离的磁性富集纯化方法开始得到应用。这一类方法属于生物亲和技 术， 其中利用抗原抗体特异结合的免疫磁珠法能够特异性的富集目标细菌， 浓缩比较大、 分 离纯度高、 操控性好、 易于实现自动化处理。市场上基于免疫磁珠法的自动化设备比较多， 例如美国 Dynal 公司的 BeadRetriever 等。然而， 在突发公共卫生事件、 环境污染等致病细 菌不明的。
12、情况下， 需要对样本中所含的所有细菌进行富集， 以便后续筛查检测。 但免疫磁珠 包被抗体的种类有限， 一种免疫磁珠通常只能特异吸附一种细菌， 要同时富集多种细菌就 要使用多种磁珠， 成本较高且容易造成细菌损失， 从而最终导致漏检。因此对于这些场合， 细菌的非特异富集比特异性富集更能满足需求。 0004 相关研究发现， 全裸或表面修饰特定基团(例如羧基、 氨基)的纳米级磁珠能够非 特异性的吸附液样中的细菌。吸附的原理目前尚无定论， 可能由于磁珠与细菌表面蛋白的 非特异性结合， 或由于纳米 Fe3O4颗粒带有正电， 细菌表面因含有磷壁酸而带负电， 两者通 过静电吸引作用而结合。 报道的实验结果表明。
13、， 在一定的条件下， 对于常见的数十种食源性 致病细菌和卫生指示细菌， 无论液样中细菌浓度的高低， 纳米磁珠都能实现对其的高效吸 附， 平均吸附率不低于 80， 很多种细菌甚至可达到 95以上。 发明内容 0005 本发明旨在克服现有的细菌特异性富集纯化方法在应用到目标细菌不明确， 需要 广泛筛查场合时存在的种种不足， 提供一种液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置与方 法， 该装置和方法能够高效富集样本中所含的各种细菌， 以降低漏检的风险， 提高后续检测 的灵敏度和可靠性。 0006 本发明的技术方案之一是提供一种液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 包 说 明 书 CN 102504991。
14、 A 4 2/7 页 5 括控制系统和流路系统 ； 所述控制系统包括蠕动微泵、 三通阀 A、 三通阀 B、 三通阀 C、 加热 块、 温度传感器、 电磁铁和主控模块 ； 所述流路系统包括吸附柱、 缓冲液瓶、 磁性分离柱、 出 样管、 废液瓶和和连通各组件的管路 ； 所述吸附柱、 三通阀 A、 蠕动微泵、 磁性分离柱、 三通 阀 B、 三通阀 C 由所述管路依次首尾相连， 构成一个闭合的液流循环通道， 通道中的液体在 蠕动微泵的推动下， 可依次沿吸附柱、 三通阀 A、 蠕动微泵、 磁性分离柱、 三通阀 B、 三通阀 C、 吸附柱的方向循环流动 ； 所述三通阀A的第三个接口端与缓冲液瓶相连， 所述。
15、三通阀B的第 三个接口端与出样管相连， 所述三通阀 C 的第三个接口端与废液瓶相连， 所述加热块紧密 贴合环抱吸附柱的底部， 所述温度传感器贴于吸附柱内腔室底部的壁面上， 所述磁性分离 柱处于电磁铁磁极的紧密贴合环抱中， 所述主控模块用于控制蠕动微泵、 三通阀 A、 三通阀 B、 三通阀 C、 加热块和电磁铁， 使它们按照设定的流程和时序， 以及温度传感器反馈的温度 信号分别进行相应的动作。 0007 所述蠕动微泵为工业级微型蠕动泵， 所述微型蠕动泵泵头上卡装硅胶软管， 所述 硅胶软管两端分别与循环流路中的管路相连， 所述蠕动微泵的工作流量与吸附柱内腔室的 容积相关， 在优选的技术方案中， 所。
16、述蠕动微泵每分钟的最大流量应不小于所述吸附柱内 腔室的容积。 0008 所述三通阀A、 三通阀B、 三通阀C均为电磁隔膜阀， 其三个端口在某一时刻保证只 有两个端口相互连通， 而与第三个端口隔断。 0009 所述加热块用于对所述吸附柱内腔室中的液体进行快速加热， 在优选的技术方案 中， 所述加热块为功率不低于 20W 的陶瓷加热块。 0010 所述温度传感器用于感知所述吸附柱内腔室中液体的温度， 在优选的技术方案 中， 所述温度传感器为薄片式热敏电阻， 所述热敏电阻表面覆有防水绝缘涂层， 所述热敏电 阻有效测温范围为 0 100， 在此温度范围内测量误差不超过 0.2。 0011 所述电磁铁为。
17、微型绕组式电磁铁， 在优选的技术方案中， 所述电磁铁的软磁材料 磁极呈水平双臂式环绕竖直放置的磁性分离柱， 所述磁极的端面与所述磁性分离柱的外壁 紧密贴合， 所述磁极端面的厚度可覆盖所述磁性分离柱的整个内腔室。 0012 所述主控模块为所述液样中细菌非特异性快速富集纯化装置的控制单元， 在优选 的技术方案中， 所述主控模块为单片机控制器， 可按照设定的时序和指令集合对所述蠕动 微泵、 三通阀 A、 三通阀 B、 三通阀 C 和电磁铁进行控制， 并根据所述温度传感器反馈的温度 信号和已优化的温度控制程序对加热块进行闭环控制， 从而使所述吸附柱内腔室中的液体 温度快速达到并稳定在预设的最佳吸附温度。
18、， 控温误差不超过 0.2。 0013 所述吸附柱、 磁性分离柱和出样管分别为样本与纳米磁珠 ( 裸珠或表面修饰羧基 基团 ) 悬液初步混合吸附、 磁性分离和盛装细菌非特异性富集纯化溶液的容器， 在优选的 技术方案中， 所述吸附柱、 磁性分离柱和出样管的材质均为化学特性稳定且易于加工的惰 性材料 ( 例如聚四氟乙烯 (PTFE)， 所述吸附柱、 磁性分离柱和出样管的内腔室壁面均经过 硅烷化疏水处理， 以避免液体的挂壁， 所述吸附柱和出样管的内腔室顶部均开有与外界大 气相通， 用以保持腔室内外气压平衡的通气孔， 所述通气孔的气道上装有可更换的高效空 气微粒滤芯 (HEPA) 过滤装置， HEPA。
19、 对直径 0.3m 以上的微粒过滤效率可达 99.99， 能够 有效阻挡所述吸附柱和出样管内腔室内外的气溶胶颗粒物随气流发生交换。 0014 在优选的技术方案中， 所述吸附柱的内腔室呈漏斗形， 漏斗最底端为出液口， 这种 说 明 书 CN 102504991 A 5 3/7 页 6 设计可有效防止液体流动时向管路中引入气泡以及液体中不溶物在腔室底部的淤积， 所述 吸附柱内腔室的容积不小于10ml， 高宽比约为21， 所述吸附柱内腔室的顶部开有用于插 接与自动进样装置相连管路的密封加样口， 如果采用手工加样， 加样后需用孔塞将所述加 样口堵住。 0015 在优选的技术方案中， 用于非特异性吸附样。
20、本中细菌的纳米磁珠悬液也通过所述 加样口加入到所述吸附柱内， 所述纳米磁珠为表面全裸或修饰羧基基团， 直径通常为 50 200nm 的单分散超顺磁性颗粒。 0016 在优选的技术方案中， 所述磁性分离柱外形为圆柱形， 竖直放置在所述电磁铁的 两个磁极之间， 所述磁性分离柱的内腔室为圆柱两端各接一个圆锥的纺锤形， 为保证内 腔室中轴处的磁场强度， 所述纺锤形内腔室圆柱部分的直径不宜超过 3cm， 壁厚不宜超过 3mm。 0017 在优选的技术方案中， 为了提高所述纳米磁珠吸附细菌和磁性分离的效率与速 度， 所述磁性分离柱的内腔室可填充直径为2001000m的导磁珠， 所述导磁珠为软磁材 料， 可。
21、被所述电磁铁产生的外加磁场磁化， 从而具备吸引所述纳米磁珠的能力， 当所述外加 磁场撤销后， 又能迅速退磁而不留剩磁， 因而具有空间位阻和细化磁场的双重作用。在非 特异性吸附阶段， 所述电磁铁未产生外加磁场， 所述导磁珠主要发挥空间位阻的作用， 迫使 所述样本和纳米磁珠的混合液从所述导磁珠之间的微小缝隙中曲折流过， 增加所述纳米磁 珠与细菌相遇的概率， 从而提高吸附速度和效率 ； 在磁性分离阶段， 所述电磁铁产生外加磁 场， 所述导磁珠被磁化， 将发挥空间位阻和细化磁场的双重作用， 混合液在缝隙间流过时， 液流中已吸附细菌和未吸附细菌的纳米磁珠将被就近吸引到所述导磁珠表面或所述磁性 分离柱内腔。
22、室的侧壁上， 撤销外加磁场， 所述导磁珠退磁， 所述纳米磁珠又可从所述吸引面 上轻松解离， 所述导磁珠的加入大幅度缩短了所述纳米磁珠在磁场中的平均运动距离， 因 此可加快磁性分离的速度， 又可减少因来不及吸引而随液流排出所造成的分离损失， 两个 阶段都可通过液流的多次循环来充分提高吸附率和分离率， 填充了所述导磁珠的所述磁性 分离柱内腔室的实际容积应不小于 10ml。 0018 在优选的技术方案中， 所述出样管内腔室的容积不小于 2ml， 所述出样管内腔室底 部可根据需要开通用于吸取液体的出液口。 0019 所述缓冲液瓶为盛装缓冲液的容器， 所述缓冲液主要用于磁性分离时杂质的清 洗、 磁性分离。
23、后细菌与纳米磁珠的洗脱和重悬， 在优选的技术方案中， 所述缓冲液瓶的容积 不小于 40ml， 顶部开有 1 个用于插接与三通阀 A 相连管路的密封插孔和 1 个用于平衡所述 缓冲液瓶内外气压的通气孔， 所述通气孔的气道上装有可更换的 HEPA 过滤装置， 以阻挡外 界环境的气溶胶颗粒物进入所述缓冲液瓶内部， 所述缓冲液的主要成分为生理盐水 (0.9 的 NaCl 水溶液 )。 0020 所述废液瓶为盛装废液的容器， 在优选的技术方案中， 所述废液瓶的容积不小于 80ml， 顶部开有 1 个用于插接与三通阀 C 相连管路的密封插孔和 1 个用于平衡所述废液瓶 内外气压的通气孔， 所述通气孔的气道。
24、上装有可更换的 HEPA 过滤装置， 以阻挡所述废液瓶 内的气溶胶颗粒物向外界扩散。 0021 在优选的技术方案中， 所述连通各组件的管路为内径24mm的惰性材质管路， 所 述管路内壁经过硅烷化疏水处理。 说 明 书 CN 102504991 A 6 4/7 页 7 0022 本发明的技术方案之二是提供一种利用上述装置对液样中细菌进行非特异性快 速富集纯化的方法， 该方法以吸附柱和磁性分离柱为核心， 借助蠕动微泵的动力令样本与 纳米磁珠的混合液在连接各组件的闭合流路中循环流动， 再配合三通阀与电磁铁的开闭， 自动完成非特异性富集纯化的全部流程， 具体步骤如下 ： 0023 1) 加样 ： 经由。
25、手工或自动进样装置， 将适量待富集细菌的样本溶液和纳米磁珠悬 液通过加样口依次加入到吸附柱中， 如果原始样本溶液所含杂质较多， 应先对其进行预过 滤， 滤除粒径超过 20m 的杂质颗粒之后再加入到吸附柱中 ； 0024 2) 非特异性吸附 ： 在加热块和温度传感器的闭环控制下， 吸附柱内腔室中溶液的 温度快速达到预设的最佳吸附温度， 并在整个富集纯化过程中始终维持这一温度， 在控温 过程中， 吸附柱内腔室中的溶液受热产生对流， 使得样本与纳米磁珠预混合， 纳米磁珠开始 非特异性吸附溶液中的细菌， 控制各三通阀选通适当端口， 开启蠕动微泵， 令样本和纳米磁 珠的混合液在吸附柱、 蠕动微泵、 磁性。
26、分离柱组成的闭合流路中循环流动， 当液流经过磁性 分离柱时， 液体只能从导磁珠之间的缝隙中流过， 增加纳米磁珠与细菌相遇的概率， 促使纳 米磁珠能够充分的非特异性吸附各种细菌。经过数次循环， 混合液中的绝大多数细菌已被 纳米磁珠吸附， 形成纳米磁珠 - 细菌复合物 ； 0025 3) 磁性分离 ： 开启电磁铁产生外加磁场， 填充在磁性分离柱内的导磁珠被外加磁 场迅速磁化， 降低蠕动微泵的速度， 使混合液缓慢通过磁性分离柱， 液流中的纳米磁珠 - 细 菌复合物和未吸附到细菌的游离纳米磁珠将被就近吸引到导磁珠表面或磁性分离柱内腔 室的侧壁上， 从而与其它杂质分离， 达到富集纯化的目的。液流可在流路。
27、中循环多次， 以确 保磁珠 - 细菌复合物被完全吸引。三通阀 C 选通废液瓶， 流路中剩余的液体排入废液瓶 ； 0026 4) 清洗 ： 三通阀 A 选通缓冲液瓶， 吸取适量缓冲液对吸引在磁性分离柱内的磁 珠 - 细菌复合物进行清洗， 进一步去除残留杂质， 从磁性分离柱流出的液体排入废液瓶 ； 为 保证清洗效果， 此步可重复多次 ； 0027 5) 洗脱出样 ： 撤销电磁铁的外加磁场， 导磁珠退磁， 失去对磁珠 - 细菌复合物的吸 引力， 三通阀 C 关闭废液瓶， 三通阀 B 选通出样管， 从缓冲液瓶中吸取少量缓冲液进入磁性 分离柱， 导磁珠表面和磁性分离柱内腔室侧壁上的磁珠 - 细菌复合物被。
28、洗脱下来， 随液流 进入出样管。出样管中收集的少量液体即为细菌的富集纯化液， 液样中细菌的非特异性快 速富集纯化流程至此完成。 0028 本发明具有的优点和积极效果是 ： 0029 (一)使用更灵活， 适用范围更广。 利用全裸或表面修饰羧基基团的纳米磁珠可实 现液样中细菌无遗漏的非特异性富集， 能够满足目标细菌不明确， 需要广泛筛查场合的需 要 ； 利用表面包被特定抗体的免疫纳米磁珠又可实现对液样中某种细菌的特异性富集， 能 够满足针对某种细菌进行高灵敏度检测场合的需要。 0030 (二)富集纯化效率更高。 采用循环流动的形式反复进行吸附与磁性分离， 有效地 降低了细菌损失， 提高了非特异性吸。
29、附和磁性分离的效率。 0031 (三)富集纯化速度更快。 通过在磁性分离柱中填充导磁珠， 加快了非特异性吸附 和磁性分离的速度， 使得细菌的富集纯化可在 30 分钟甚至更短的时间内完成。 0032 (四)操作简单， 自动化程度高。 提出了液样中细菌非特异性快速富集纯化的自动 化实现方案， 加样后一键启动即可自动完成全部富集纯化流程， 毋需离心的步骤， 可作为自 说 明 书 CN 102504991 A 7 5/7 页 8 动检测设备整机中的一个内嵌功能单元， 直接与检测单元级联。 0033 ( 五 ) 扩展性强， 易于实现高通量富集。富集纯化装置结构简单紧凑， 易于实现微 型化和模块化， 多个。
30、相同模块的并行集成即可实现样本的高通量富集纯化。 附图说明 0034 图 1 为本发明液样中细菌非特异性快速富集纯化装置实施例的整体结构示意图 ； 0035 图 2(a) 为本发明装置实施例中磁性分离柱和电磁铁的组合布局俯视图 ； 0036 图 2(b) 为图 2(a) 中的 A-A 剖面图。 0037 图中 ： 1、 加样口， 2、 通气孔， 3、 吸附柱， 4、 控制线， 5、 三通阀 A， 6、 蠕动微泵， 7、 主控 模块， 8、 电磁铁， 9、 磁性分离柱， 10、 三通阀 B， 11、 出样管， 12、 废液瓶， 13、 三通阀 C， 14、 缓冲 液瓶， 15、 温度传感器， 1。
31、6、 加热块， 17、 管路， 18、 电磁铁线圈， 19、 电磁铁磁极， 20、 分离柱入 口， 21、 管路接头， 22、 分离柱内腔室， 23、 导磁珠， 24、 导磁珠隔网， 25、 分离柱出口。 具体实施方式 0038 为能进一步了解本发明的发明内容、 特点及功效， 兹例举以下实施例， 并配合附图 详细说明如下 ： 0039 请参见图 1， 一种液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置， 该装置包括控制系统 和流路系统， 其中控制系统主要由蠕动微泵 6、 三通阀 A5、 三通阀 B10、 三通阀 C13、 加热块 16、 温度传感器 15、 电磁铁 8 和主控模块 7 组成 ； 流路系统。
32、主要由吸附柱 3、 缓冲液瓶 14、 磁 性分离柱 9、 出样管 11、 废液瓶 12 和连通各组件的管路 17 组成。该实施例设计单次最大样 本处理容量为 20ml。在本实施例中， 吸附柱 3、 三通阀 A5、 蠕动微泵 6、 磁性分离柱 9、 三通 阀 B10、 三通阀 C13 由管路 17 依次首尾相连， 构成一个闭合的液流循环通道， 液流循环通道 中的液体在蠕动微泵 6 的推动下， 将依次沿吸附柱 3、 三通阀 A5、 蠕动微泵 6、 磁性分离柱 9、 三通阀 B10、 三通阀 C13、 吸附柱 3 的方向循环流动。三通阀 A5 的第三个接口端与缓冲液瓶 14 相连， 三通阀 B10 。
33、的第三个接口端与出样管 11 相连， 三通阀 C13 的第三个接口端与废液 瓶 12 相连。蠕动微泵 6 的最大流量为每分钟 30ml。 0040 在本实施例中， 主控模块为采用STM32芯片组的单片机系统， 通过控制线4控制蠕 动微泵6、 三通阀A5、 三通阀B10、 三通阀C13、 加热块16和电磁铁8， 使它们按照设定的流程 和时序进行相应的动作， 并根据温度传感器 15 反馈的温度信号和已优化的温度控制程序 对加热块16进行闭环控制， 从而使吸附柱3内腔室中的液体温度快速达到并稳定在最佳吸 附温度 37， 控温误差不超过 0.2。 0041 在本实施例中， 吸附柱 3、 磁性分离柱 9。
34、 和出样管 11 的材质为聚四氟乙烯 (PTFE)， 其内腔室壁面均已经过硅烷化疏水处理。吸附柱 3 和出样管 11 的内腔室顶部均开有通气 孔 2， 通气孔 2 的气道上装有可更换的 HEPA 过滤装置。 0042 在本实施例中， 吸附柱 3 的内腔室呈漏斗形， 出液口位于漏斗的最底端。吸附柱内 腔室的容积为 30ml， 高宽比为 2 1， 其顶部与加样口 1 相连， 加样口 1 在不用时需用孔塞 堵住。原始样本溶液需要预先经过 20m 过滤， 然后再通过加样口 1 注入吸附柱 3， 而用于 吸附细菌的纳米磁珠也要通过加样口 1 加入到吸附柱 3 中。纳米磁珠则选用表面全裸或修 饰羧基， 直。
35、径约为 100nm 的单分散超顺磁性纳米磁珠。 说 明 书 CN 102504991 A 8 6/7 页 9 0043 在本实施例中， 加热块 16 选用功率为 30W 的陶瓷加热块， 该陶瓷加热块紧密贴合 环抱吸附柱 3 的底部。温度传感器 15 选用表面覆有防水绝缘涂层的薄片式热敏电阻， 贴于 吸附柱 3 内腔室底部的壁面上。该热敏电阻的有效测温范围为 0 100， 在此范围内最 大测量误差不超过 0.2。 0044 在本实施例中， 磁性分离柱9的外形为圆柱形。 电磁铁8为绕组式， 由漆包线圈18 和软磁材料磁极 19 组成。磁性分离柱 9 和电磁铁 8 的组合布局结构如图 2 示， 其中。
36、图 2(a) 为俯视图， 图 2(b) 为磁性分离柱 9 轴心处的剖面图。磁性分离柱 9 竖直放置在电磁铁的两 个水平环绕式磁极 19 之间， 电磁铁磁极 19 的端面与磁性分离柱 9 的外壁紧密贴合， 端面的 厚度覆盖整个分离柱内腔室22。 分离柱内腔室22为圆柱两端各接一个圆锥的纺锤形， 纺锤 形顶部开有入口 20， 底部开有出口 25， 分离柱入口 20 和出口 25 通过管路接头 21 和连接管 路 17 分别与蠕动微泵 6 和三通阀 B10 相连。纺锤形中部圆柱处的直径为 2cm， 壁厚为 2mm。 分离柱内腔室 22 中填充直径为 1000m 的导磁珠 23， 在导磁珠 23 的底。
37、部， 分离柱出口 25 的上方放置孔径 200m 的导磁珠隔网 24， 以防止导磁珠随液体流出磁性分离柱 9。填充导 磁珠 23 之后的分离柱内腔室 22 实际有效容积约为 10ml。 0045 在本实施例中， 出样管 11 的内腔室容积为 5ml。 0046 在本实施例中， 缓冲液瓶 14 的容积为 100ml， 内部盛装主要成分为生理盐水 (0.9的 NaCl 水溶液 ) 的缓冲液。缓冲液瓶 14 的顶部开有 1 个用于插接与三通阀 A5 相 连管路的密封插孔和 1 个通气孔 2， 通气孔 2 的气道上装有可更换的 HEPA 过滤装置。废液 瓶 12 的容积为 200ml， 顶部开有 1 。
38、个用于插接与三通阀 C13 相连管路的密封插孔和 1 个通 气孔 2， 通气孔 2 的气道上装有可更换的 HEPA 过滤装置。 0047 在本实施例中， 连通各组件的管路 17 为内径 3.2mm 的聚四氟乙烯 (PTFE) 管， 其内 壁已经过硅烷化疏水处理。 0048 利用液样中细菌的非特异性快速富集纯化装置实施例将 20ml 样本中的细菌富集 纯化至 2ml 液样的一个具体流程实例如下 ： 0049 ( 一 ) 初始状态 0050 装置初始状态 ： 吸附柱 3、 磁性分离柱 9、 出样管 11 和废液瓶 12 为空， 各条连接管 路 17 均为空， 电磁铁 8 断电。缓冲液瓶 14 已预。
39、先加注满缓冲液。三通阀 A5 选通吸附柱 3 与蠕动微泵 6， 三通阀 B10 选通磁性分离柱 9 与三通阀 C13， 三通阀 C13 选通三通阀 B10 与 吸附柱 3。 0051 ( 二 ) 加样 0052 1) 预过滤 ： 手工或利用过滤装置对原始样本溶液进行 20m 过滤， 去除较大颗粒 悬浊杂质。 0053 2) 加样 ： 由手工或自动进样装置依次通过加样口 1 向吸附柱 3 内加入 20ml 已过 滤的样本溶液和 4ml 表面全裸或修饰羧基的纳米磁珠悬液， 悬液中纳米磁珠的含量应尽量 保证其对于样本细菌而言是过量的。加样完成后用孔塞将加样口 1 堵住。 0054 ( 三 ) 非特异。
40、性吸附 0055 1)加热/保温 ： 温度传感器15感知吸附柱3中溶液的当前温度， 如果低于37， 启 动加热块 16 对吸附柱 3 进行加热， 令吸附柱 3 中的溶液温度快速达到最佳吸附温度 37， 并在整个富集纯化过程中维持这一温度， 控温误差不超过 0.2。加热过程中， 吸附柱 3 中 说 明 书 CN 102504991 A 9 7/7 页 10 的溶液受热产生对流， 使得样本与纳米磁珠预混合， 纳米磁珠开始非特异性吸附溶液中的 细菌。 0056 2) 非特异性吸附 ： 待吸附柱 3 中的溶液温度达到最佳吸附温度 37后， 开启蠕动 微泵渐至最大流量， 令样本和纳米磁珠的混合液在吸附柱。
41、3、 蠕动微泵6、 磁性分离柱9组成 的闭合流路中循环流动 10 15 分钟， 促使纳米磁珠充分的非特异性吸附溶液中的各种细 菌。此步完成后， 混合液中的绝大多数细菌已被纳米磁珠吸附， 形成纳米磁珠 - 细菌复合 物。 0057 ( 四 ) 磁性分离 0058 电磁铁 8 通电产生外加磁场， 降低蠕动微泵 6 的流量至最大流量的 50， 使混合 液缓慢通过磁性分离柱 9， 液流中的纳米磁珠 - 细菌复合物和未吸附到细菌的游离纳米磁 珠被就近吸引到导磁珠 23 表面或磁性分离柱内腔室 22 的侧壁上。维持液流循环 3 5 分 钟， 确保磁珠-细菌复合物被完全吸引。 三通阀C13选通废液瓶12， 。
42、流路中剩余的液体被蠕 动微泵 6 推入废液瓶 12。 0059 ( 五 ) 清洗 0060 待循环流路中的液体全部排空后， 三通阀 A5 选通缓冲液瓶 14， 蠕动微泵 6 吸取缓 冲液对吸引在磁性分离柱 9 内的磁珠 - 细菌复合物进行清洗， 从磁性分离柱 9 流出的液体 排入废液瓶 12 ； 清洗过程维持 2 分钟后， 三通阀 A5 与缓冲液瓶 14 断开。 0061 ( 六 ) 洗脱出样 0062 待循环流路中的液体全部排空后， 电磁铁 8 断电， 外加磁场撤销。三通阀 C13 与废 液瓶 12 断开， 三通阀 B10 选通出样管 11， 三通阀 A5 选通缓冲液瓶 14， 蠕动微泵 6。
43、 从缓冲液 瓶 14 中吸取 2ml 缓冲液进入磁性分离柱 9， 导磁珠 23 表面和磁性分离柱内腔室 22 侧壁上 的磁珠-细菌复合物被洗脱下来， 随液流进入出样管11。 出样管11中收集的洗脱液体即为 细菌的富集纯化液。 0063 ( 七 ) 流路洗涤 0064 1) 流路洗涤 ： 如果有多批样本需要富集纯化， 每批样本处理完之后要对流路进行 洗涤， 以防止样本间的交叉污染。三通阀 A5 选通缓冲液瓶 14， 蠕动微泵 6 吸取 20ml 缓冲液 进入循环流路， 三通阀 A5 与缓冲液瓶 14 断开， 选通吸附柱 3， 蠕动微泵 6 开至最大流量， 缓 冲液在循环流路中循环流动 2 分钟，。
44、 三通阀 C13 选通废液瓶 12， 缓冲液排入废液瓶 12。此 步可根据需要重复多次。 0065 2) 强力洗涤 ： 当富集纯化全部完成之后， 在装置关机前还需进行一次彻底的洗 涤。将缓冲液瓶 14 中的缓冲液换成含有去污剂、 抑菌剂和蛋白酶等成分的洗涤液， 参照流 路洗涤的程序对装置流路进行洗涤。 0066 尽管上面结合附图对本发明的优选实施例进行了描述， 但是本发明并不局限于上 述的具体实施方式， 上述的具体实施方式仅仅是示意性的， 并不是限制性的， 本领域的普通 技术人员在本发明的启示下， 在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下， 还可 以作出很多形式， 这些均属于本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102504991 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2(a) 说 明 书 附 图 CN 102504991 A 11 2/2 页 12 图 2(b) 说 明 书 附 图 CN 102504991 A 12 。