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1、(10)申请公布号 CN 102485912 A (43)申请公布日 2012.06.06 CN 102485912 A *CN102485912A* (21)申请号 201010567951.9 (22)申请日 2010.12.01 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国疾病预防控制中心病毒病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路 155 号病 毒病预防控制所 (72)发明人 马学军 芦春斌 杨梦婕 罗乐 聂凯 王淼 郑建新 (54) 发明名称 GeXP 多重 PCR 技术用于人乳。
2、头瘤病毒 HPV 检 测和分型的研究 (57) 摘要 GeXP 多重 PCR 技术用于人乳头瘤病毒 HPV 检 测和分型的研究， 本发明属于生物技术应用领域， 涉及各级疾病预防控制机构， 医院等用于对宫颈 分泌物等标本的多种人乳头瘤病毒 HPV 亚型 ( 包 括 HPV6， HPV11， HPV31， HPV33 和 HPV52) 感染的 同时检测和分型。具体通过计算机软件分析人乳 头瘤病毒 HPV 各亚型基因的保守序列， 分别设计 出针对各亚型的型特异性引物， 进行单管多重 (6 重 )PCR( 包括内参基因 Rnasep-DNA)， 整个反应 不到 2 个小时。本发明既克服了常规单管多重荧。
3、 光定性 PCR 检测不能分型的缺点， 也克服了常规 芯片检测方法的操作繁琐， 时间较长， 成本较高等 缺点， 为 HPV 的分型技术提供了新的思路， 其高特 异、 高灵敏、 快速的特点为实现 HPV 亚型感染的快 速准确筛查鉴别提供了有力的技术支撑， 对研究 患者 HPV 感染型别分布特点和提高由 HPV 各亚型 引起的癌症病变的防治水平具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 1/1 页 2 1. 一种用于同时检测人乳头瘤病毒 H。
4、PV6， HPV11， HPV31， HPV33 和 HPV52 的多重 PCR 技 术， 其中包括 ： 用于人乳头瘤病毒 HPV6， HPV11， HPV31， HPV33 和 HPV52 检测的型特异性引物 和通用引物。 2.权力要求1所述的多重PCR技术的引物和通用引物包括表1所列的基因序列及其每 种序列的互补序列或变体。 3. 权力要求 1 所述的多重 PCR 检测技术包括人乳头瘤病毒 HPV6， HPV11， HPV31， HPV33 和 HPV52 及其变异株。 4. 权力要求 3 所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构， 医院用于人乳头 瘤病毒 HPV6， HPV11， 。
5、HPV31， HPV33 和 HPV52 同时检测和分型。 5. 权力要求 1 所述的同时检测人乳头瘤病毒 HPV6， HPV11， HPV31， HPV33 和 HPV52 的多 重 PCR 技术的反应程序和检测程序。 权 利 要 求 书 CN 102485912 A 2 1/3 页 3 GeXP 多重 PCR 技术用于人乳头瘤病毒 HPV 检测和分型的研 究 发明领域 0001 本发明属于生物技术应用领域， 涉及各级疾病预防控制机构， 哨点医院等用于 对宫颈分泌物等标本的多种人乳头瘤病毒 HPV 亚型 ( 包括 HPV6， HPV11， HPV31， HPV33 和 HPV52)感染的同时。
6、检测和分型。 具体通过计算机软件分析人乳头瘤病毒HPV各亚型基因的 保守序列， 分别设计出针对各亚型的型特异性引物， 进行单管多重 (6 重 )PCR( 包括内参基 因Rnasep-DNA)， 整个反应不到2个小时。 本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测 不能分型的缺点， 也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐， 时间较长， 成本较高等缺点， 为 HPV 的分型技术提供了新的思路， 其高特异、 高灵敏、 快速的特点为实现 HPV 亚型感染的快 速准确筛查鉴别提供了有力的技术支撑， 对研究患者 HPV 感染型别分布特点和提高由 HPV 各亚型引起的癌症病变的防治水平具有重要意义。 0002 。
7、发明背景 0003 宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤， 发病率在女性恶性肿瘤中居第二 位， 在一些发展中国家和地区仍居第一位。 据全球范围统计， 在所有妇科恶性肿瘤中宫颈癌 占 10， 每年有 471,000 例新发病例以及 215,000 例死亡病例。人乳头瘤病毒 (HPV) 与宫 颈癌密切相关， 它是一种双链环状 DNA 病毒， 由早期基因、 晚期基因 ( 晚期基因 L1 和 L2 分 别编码主要衣壳蛋白与次要衣壳蛋白 ) 和一个不翻译的上游调节区三部分组成， 研究发现 99以上的宫颈癌有 HPV 感染， HPV 是宫颈癌的主要致病因子。依据与宫颈癌的关系， 将 HPV 分为高危型和。
8、低危型， 高危型包括 ： HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 66、 69 等 型 ； 低危型包括 ： 6、 11、 43、 44 等型。HPV 高危亚型中， 中国南方地区 52、 58 亚型的感染率较 北方高， 在台湾除HPV16、 18外， 31、 33、 35的感染率较高， 说明在中国人中16、 18、 31、 33、 52、 58 为最常见亚型， 但由于中国地域宽广， 人口众多， 故这方面的资料较为缺乏， 有待进一步 研究。 低危亚型中， HPV6， 11为常见感染亚型， 可致巨大湿疣、 尖锐湿疣、 呼吸道乳头瘤、 结膜 乳头瘤。
9、等疾病。要进一步研究不同亚型 HPV 在不同种族人群中的致病性、 治疗和预后情况， 了解 HPV 临床感染类型的变化趋势以及降低宫颈癌的发生和死亡， 就需要建立一种适合于 临床应用的、 能够对所有已知高危类型和常见低危类型 HPV 同时进行筛查和分型检测的新 方法。故本研究初步选取中国人常见的 HPV31， 33， 52 三种高危型和 HPV6， 11 两种低危型作 为研究对象。 0004 目前， HPV 分型方法有很多， 常见的有细胞学检测方法和分子生物学技术方法， 如 薄层液基细胞学技术和涂片自动检测技术、 杂交捕获试验(HC)、 原位杂交技术(ISH)和PCR 方法等。其中， PCR 技。
10、术较为成熟， 具有快速、 简便、 灵敏等特点。由于单重 PCR 通量不高的 的局限性， 本研究采用一种新型的基于 GeXP 的多重 PCR 技术， 它采用通用引物引发靶基因 扩增， 能有效解决多重 PCR 过程中的扩增偏爱性， 采用毛细管电泳及荧光标记扩增产物提 高的检测灵敏度和分辨率， 根据扩增产物片段长度判断结果， 有助于提高检测特异性。 在我 们的前期工作中， 运用基于GeXP的多重PCR技术成功检测了新甲型流感病毒和季节性流感 病毒。本研究首先用单重 PCR 技术检测 HPV6， 11， 31， 33 和 52 单重感染的 HPV 临床样本， 以 说 明 书 CN 102485912 。
11、A 3 2/3 页 4 验证GeXP引物的特异性， 在此基础上建立了一种新型多重GeXP-PCR技术检测， 以同时检测 和鉴定生殖道感染中中国人常见的 HPV6， 11， 31， 33 和 52 等亚型。 发明内容 0005 1. 以 GenBank 公布的引物序列为参考， 从 NCBI 上下载已知序列使用 CLUSTAL X 软件进行序列比对， 选取对于针对各个靶基因高度保守而对于其它型别高度特异的基因区 段， 由 eXpress Profiler Software 设计六重引物， 如表 1 ： 0006 表 1 GeXP 检测人乳头瘤病毒 (HPV) 的核苷酸引物序列表 0007 0008。
12、 注 ： 下划线表示的是上、 下游通用引物序列 0009 2. 建立了如下的检测过程， 详见如下 ： 0010 (1) 合成引物 ： 由上海英骏公司合成并纯化。 0011 (2)将待测标本按Qiagen公司的DNA Mini Kit试剂盒步骤处理， 获得样本的DNA。 0012 (3)6 重 PCR 反应。 具体实施方式 0013 实施方案 1 ： Gexp 多重 PCR 的反应体系和条件 0014 采用 25l PCR 反应体系， 其中含 ： Ex Taq12.5l， 上、 下游嵌合引物混合物 (1mol/L)1.25l， 上、 下游通用序列引物 (10mol/L)1.25l， DNA 模板。
13、 1l， 灭菌双蒸 水补足至25l。 PCR扩增条件为 ： 94， 10min ； (95， 30s ； 56， 30s ； 72， 30s)5循环 ； (95， 30s ； 68， 30s ； 72， 30s)15 循环 ； (95， 30s ； 48， 30s ； 72， 30s)20 循环 ； 72， 5min。 0015 实施方案 2 ： Gexp 多重 PCR 的特异性 0016 以已知五个亚型的混合 DNA 作为模板， 用六对引物 ( 含内参基因 RNasep-DNA) 混 合液做多重 PCR 扩增。结果表明 5 种 HPV 亚型病毒的基因可被同时检出， 验证了多重检测 说 明 书。
14、 CN 102485912 A 4 3/3 页 5 体系中型特异引物的特异性。 0017 实施方案 3 ： Gexp 多重 PCR 的灵敏度 0018 HPV6， 11， 31， 33， 52 五个克隆质粒经定量后， 进行 10 倍连续稀释， 人为混合五个亚 型质粒 DNA， 得浓度分别为 106copies/l， 105copies/l， 104copies/l， 103copies/l， 102copies/l， 101copies/l 的混合液作待检样品， 进行 GeXP 多重 PCR 方法的灵敏度分 析， Gexp 多重 PCR 检测的体系同实施方案 1。结果表明， 在 103拷贝 /。
15、L 水平可以同时特 异的检测出 5 种 HPV 亚型病毒的模拟混合样本。每个浓度均在非同日重复三次， 获得的结 果相同。 0019 实施方案 4 ： 临床样本分析和验证 0020 GeXP 多重 PCR 检测 30 份临床标本的结果表明 ： HPV6 单重感染 5 份， HPV11 单重感 染 4 份， HPV31 单重感染 2 份， HPV33 单重感染 5 份， HPV52 单重感染 6 份， HPV6/52 双重感 染 2 份， HPV6/11/33 多重感染 1 份。结果由人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒 ( 广东 潮州凯普生物化学有限公司 ) 验证， 完全一致。GeXP 多重 PCR 检测体系同实施方案 1。 说 明 书 CN 102485912 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 102485912 A 6 。