一种来源于玉米的联乙烯还原酶及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及一种来源于玉米的联乙烯还原酶及其编码基因与应用。背景技术 叶绿素是植物进行光合作用的重要色素， 它的作用是捕获光能并将光能转移到反 应中心， 故对植物的生长及其产量有很重要的作用。 根据乙烯侧链数目的不同， 叶绿素可分 为 3， 8- 联乙烯叶绿素 (DV Chls) 和 3- 乙烯叶绿素 ( 单乙烯叶绿素， MV Chls)。 在正常情况 下， 几乎所有的植物和细菌用于光合作用的叶绿素都是 MV chls， 目前只发现一类海洋生物 即 “the marine prochlorophyte Prochlorococcus marinus” 利用的是 DVChls(Chisholm SW， Frankel SL， Goericke R， Olson RJ， Palenik B， Waterbury JB， West-Johnsrud L， Zettler ER(1992)Prochlorococcus marinus nov.gen.nov.sp. ： A marine prokaryote containing divinylchlorophyll a andb.Arch.Microbiol 157 ： 297-300.)。
叶绿素生物合成的多样性主要在于它有单乙烯叶绿素 (MV Chls) 和联乙烯叶绿 素 (DV Chls) 两条平行合成的途径， DV Chls 及其中间产物通过联乙烯基还原酶 (DVR， 又叫 C-8 乙烯基还原酶 ) 催化转化成 MV Chls 及其中间产物 (Rebeiz CA， Kolossov VL， Briskin D， Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis ： chlorophyll biosynthetic heterogeneity ， multiple biosynthetic routes ， and biological spin-oVs ， in ： H.S.Nalwa(Ed.)， Handbook of Photochemistry and Photobiology， vol.4， American ScientiWc， Los Angeles ： 183-248.)。 迄今为止， 已在 5 种底物水平上检测到联乙烯还原酶 活性， 分别是联乙烯 Mg- 原卟啉 IX(DV Mg-proto)、 联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE)、 联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)、 联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和联乙烯叶 绿素 a(DV Chl a)(Kolossov VL， Bohnert HJ， Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 ： In situ screening for divinyl chlorophyll(ide)a reductase mutants by spectroXuorometry.Analytical Biochemistry 348 ： 192-197)。现已从水稻， 拟南芥、 绿 硫细菌 Chlorobium tepidum 和蓝细菌 Synechocystis sp.PCC6803 中分别克隆了相应的联 乙烯还原酶基因 DVR、 bciA 和 slr1923(Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003 ； Nagata N， Tanaka R， Satoh S， Tanaka A(2005)Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17， 233-240 ； Chew AGM， Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophyllide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria.J.Biol.Chem 28 ： 2967-2975 ； Islam MR， Aikawa S， Midorikawa T， Kashino Y， Satoh K， Koike H(2008)slr1923 of Synechocystis sp.PCC6803 Is Essential for Conversion of 3， 8-Divinyl(proto)chlorophyll(ide) to 3-Monovinyl(proto)chlorophyll(ide).Plant Physiology 148 ： 1068-1081)。 已 有
实验证明 ： 用 NADPH 作为还原剂， 重组的绿硫细菌 (Chlorobium tepidum)BciA 蛋白质将 DV Pchlide a 还原成 MV Pchlide a(Chew AGM， Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophyllide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J.Biol.Chem 28 ： 2967-2975) ； 重组的拟南芥 DVR 蛋白质将 DVChlide a 还原成 MV Chlide a， 但不能将 DV Pchlide a、 DV Chlide b、 DV Chl a 和 DV Chl b 等 4 种 DV 物质转化为相 应的 MV 物质 (Nagata N， Tanaka R， Tanaka A(2007)The Major Route for Chlorophyll Synthesis Includes[3， 8-divinyl]-chlorophyllide a Reduction in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol 48 ： 1803-1808)。 我 们 通 过 酶 学 实 验 证 实 重 组 的 水 稻 DVR 蛋白质不仅能将 DV Chlide a 还原成 MV Chlide a， 而且能还原 DV Chl a 为 MV Chl a(Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ (2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003)。 目 前， 联 乙 烯 Mg- 原 卟 啉 IX(DV Mg-proto) 和联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 这 2 种联乙烯 (DV 型 ) 物质转化为相 应单乙烯 (MV 型 ) 物质， 还没有得到利用纯化 DVR 酶蛋白所做的体外酶学实验的证实， 同 时， 还不清楚的是， 这些联乙烯中间物质是由一个具有广泛特异性的联乙烯基还原酶催化， 还是由多个联乙烯基还原酶 ( 每个酶都有特异底物 ) 催化生成相应的单乙烯物质。 发明内容
本发明的目的是提供一种具有联乙烯还原酶活性的蛋白， 该蛋白来源于玉米 (Zea mays L.)。
本发明所提供的具有联乙烯还原酶活性的蛋白， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中序列 2 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加， 且具有联乙烯还原酶活性的由 1) 衍生的蛋白质。
编码上述蛋白的基因 (ZmDVR) 也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下 1)-3) 中任一种 ：
1) 其编码序列是序列表中序列 1 的 DNA 分子 ；
2) 在严格条件下与 1) 或 2) 的 DNA 分子杂交且编码上述具有联乙烯还原酶活性蛋 白的 DNA 分子 ；
3) 与 1) 或 2) 的 DNA 分子具有 90％以上的同源性且编码上述具有联乙烯还原酶 活性蛋白的 DNA 分子。
含有上述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
所述重组表达载体具体可为在 pET-30a(+) 的多克隆位点间插入上述基因得到的 重组表达载体。在本发明的实施例中， 所述多克隆位点具体为 BamH I 和 EcoR I。
所述表达盒为由能够启动 ZmDVR 基因表达的启动子， ZmDVR 基因， 以及转录终止序 列组成。
在本发明的一个实施例中， 所述重组菌具体为携带有 ZmDVR 基因的大肠杆菌 ； 所 述大肠杆菌具体为 BL21。本发明所提供蛋白在作为联乙烯还原酶中的应用也属于本发明的保护范围。
上述具有联乙烯还原酶活性的蛋白或 ZmDVR 基因在如下 1)-5) 任一中的应用也属 于本发明的保护范围 ：
1) 转化联乙烯叶绿素 a 为单乙烯叶绿素 a ；
2) 转化联乙烯叶绿素酸酯 a 为单乙烯叶绿素酸酯 a ；
3) 转化联乙烯原叶绿素酸酯 a 为单乙烯原叶绿素酸酯 a ；
4) 转化联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯为单乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 ；
5) 转化联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ为单乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ。
实验证明 ： 本发明提供的来源于玉米的蛋白具有联乙烯还原酶活性， 能将联乙烯 叶绿素 a 转化为单乙烯叶绿素 a ； 将联乙烯叶绿素酸酯 a 转化为单乙烯叶绿素酸酯 a ； 将联 乙烯原叶绿素酸酯 a 转化为单乙烯原叶绿素酸酯 a ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯转化为 单乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ转化为单乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ。 附图说明 图 1 为以联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 作为 底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， A 和 B 的左侧图分别是反应 10min 的产物 在 440nm 和 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， 右侧图均是每个峰的吸收光谱。A 代表底物为联 乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。B 代表底物为联乙 烯叶绿素 a(DV Chl a) 的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。具体的， A1 和 A2 分别是联乙 烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和单乙烯叶绿素酸酯 a(MVChlide a)。B1 和 B2 分别是联 乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 和单乙烯叶绿素 a(MV Chl a)。A3 和 B3 分别是 DV Chlide a 与 BL21/pET-30a(+) 空载体反应后的色素 ( 阴性对照 )， 以及 DV Chla 与 BL21/pET-30a(+) 空
载体反应后的色素 ( 阴性对照 ) ； A4 和 B4 分别是 DV Chlide a 与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素， 以及 DV Chla 与 BL21/pET-30 a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液 反应后的色素。 A0( 空白对照 ) 是用茼蒿叶片制备的丙酮粉中残留的 MV-Chl a 经温育后产 生的 MV-Chlide a ； A1 和 A3 中的弱峰 ( 峰 2) 即是从丙酮粉中残留的 MV-Chl a 转化而来的 MV-Chlide a。
图 2 为以联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a) 作为底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， A 代表反应 10min 的产物在 440nm 检测到的 HPLC 色谱图， B 代表反应 2h 的产物在 440nm 检测到的 HPLC 色谱图， C 代表反应 10h 的产物在 440nm 检测到的 HPLC 色谱 图， D 代表每个峰的吸收光谱。具体的， A1、 B1、 C1 均是联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a) ； A2、 B2、 C2 均是单乙烯原叶绿素酸酯 a(MVPchlide a) ； A3、 B3、 C3 均是 DV Pchlide a 与 BL21/pET-30a(+) 空载体反应后的色素 ( 阴性对照 ) ； A4、 B4、 C4 均是 DV Pchlide a 与 BL21/ pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素。
图 3 为以联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 作为底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， A 代表反应 10min 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， B 代表反应 2h 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， C 代表反应 10h 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色 谱图， D 代表每个峰的吸收光谱。具体的， A1、 B1、 C1 均是联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) ； A2、 B2、 C2 均是 DV MPE 与 BL21/pET-30a(+) 空载体反应后的色素 ( 阴性对照 ) ； A3、B3、 C3 均是 DV MPE 与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素。
图 4 为以联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto) 作为底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， 左侧图代表反应 10h 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， 右侧图 代表每个峰的吸收光谱。具体的， A1 是联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto) ； A2 是 DV Mg-proto 与 BL21/pET-30a(+) 空 载 体 反 应 后 的 色 素 ( 阴 性 对 照 ) ； A3 是 DVMg-proto 与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素。 具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 玉米联乙烯还原酶基因的克隆及其编码蛋白的功能验证
一、 玉米联乙烯还原酶基因的克隆
设计如下引物 ：
ZmDVR-F ： 5’ -CCGGATCCATGGCGACCATCCTCCTATC-3’ ( 下划线处为 BamH Ⅰ酶切位 点)
ZmDVR-R ： 5’ -ATGGAATTCGCCTAGAAGATGGTCTGCTC-3’ ( 下划线处为 EcoR Ⅰ酶切位 点)
以玉米 (Zea mays L.) 品种 “B73” 自交系叶片提取的 DNA 为模板， 用引物 ZmDVR-F 和 ZmDVR-R 进行 PCR 扩增， 得到 1206bp 的片段， 将该片段连接在 pMD-18-T(TaKaRa) 载体上， 构建成 pMD-ZmDVR， 然后转化到大肠杆菌 JM109 菌株中， 筛选阳性克隆后测序。测序结果表 明： 扩增得到的片段具有序列表中序列 1 所示的序列， 将其命名为 ZmDVR。序列 1 所示序列 即为 ZmDVR 基因的编码序列， 它编码得到序列表中序列 2 所示氨基酸序列组成的蛋白质， 将 该蛋白质命名为 ZmDVR。
二、 玉米联乙烯还原酶基因编码蛋白的获得及其功能验证
1、 重组表达载体 pET-30a(+)-ZmDVR 的构建
将经步骤一测序鉴定过的 pMD-ZmDVR 载体用 BamH I 和 EcoR I 双酶切， 连接到经 同样酶切过的表达载体连接到经同样酶切过的表达载体 pET-30a(+)(Novagen， 产品目录号 69909-3) 上， 构成重组表达载体 pET-30a(+)-ZmDVR。
2、 诱导表达
将步骤 1 的重组表达载体 pET-30a(+)-ZmDVR 转化到大肠杆菌菌株 BL21( 同时 设置 pET-30a(+) 空载体转化到大肠杆菌菌株 BL21 的对照 )， 在 37 ℃， LB/kan 培养基上 过夜培养， 挑选单克隆于 37℃， LB/kan 培养液中振荡培养， 提取质粒 DNA(OMEGA 试剂盒 )， 用 BamH I 和 EcoR I 双酶切， 琼脂糖凝胶电泳检测 ZmDVR 基因是否插入载体 pET-30a(+) 中， 将检测含有 ZmDVR 基因的重组表达载体的克隆送上海英骏公司测序， 将筛选正确插入 pET-30a(+) 的 ZmDVR 基因的重组表达载体的克隆命名为 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR。转入 pET-30a(+) 空载体的大肠杆菌菌株 BL21 命名为 BL21/pET-30a(+)。然后参照 (Nagata N， Tanaka R， Satoh S， Tanaka A(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17 ： 233-240) 的 方 法 将 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 进行诱导表达， 具体方法如下 ： 分别挑选 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 和含 有空载体 PET-30A(+) 的 BL21( 空载体对照 CK) 单克隆于 20 ℃， LB/kan 培养液中振荡培 养一夜， 分别取 1ml 菌液于 100ml LB/kan 培养液， 30 ℃振荡培养 30min 后加入异丙基硫 代 -β- 半乳糖苷 (IPTG)， 终浓度为 0.5mM， 于 30℃诱导培养 7h， 4℃ 10000rpm 离心 10min， -1 -1 沉淀用含有 6.7μg·ml 溶菌酶和 3.3μg·ml DNaseI 的 50mM 的 Tris-HCl 的溶液悬浮， 溶解产物放入 -20℃冰箱保存。
3、 酶促反应验证蛋白功能
此步骤所用底物涉及如下五种 ： 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a)、 联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a)、 联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)、 联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 和联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto)。
这五种底物的获得途径如下 ： 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 从水稻 824ys 突变体 ( 黄晓群， 王平荣， 赵海新， 邓晓建 . 一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子 标记定位 . 中国水稻科学， 2007， 21(4) ： 355-359 ； Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003) 叶绿素中分离， 用 100％丙酮从 824ys 突变体新鲜叶片组织中浸提叶绿素， 提取 液 10000r/min(Eppendorf 5804R) 离心 15min， 上清液在氮气下吹干， 重溶于 100％丙酮。 然 后用 C18 柱 (4.6mm i.d.×150mm long ； 5μm， Agilent， U.S.A) 进行 HPLC 分离， 洗脱条件是 流动相 ： 甲醇∶乙腈∶丙酮＝ 1 ∶ 3 ∶ 1， 40℃， 流速 1.0mL/min， 上样量 5μL， 柱中洗脱的色 素用 660nm 波长监测， 在相应保留时间收集 DV-Chl a， 具体参见 Wang 等在 Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153， 994-1003 中记载的方法。
联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 是用上述分离的联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 与从茼蒿叶片制备的丙酮粉中的叶绿素酶反应所得。
其中， 丙酮粉 ( 叶绿素酶 ) 的制备方法如下 ： 按照 Ito 等 (Ito H， Takaichi S， Tsuji H， Tanaka A.Properties of synthesis of chlorophyll a from chlorophyll b in cucumber etioplasts.J Biol Chem， 1994， 269 ： 22034-22038) 的 方 法，用 茼 蒿 (Garland chrysanthemum)( 品种为 “清香茼蒿” ， 从农贸市场种子摊商购买 ) 叶片制备丙 酮粉， 具体为 ： 取 15g 新鲜茼蒿叶片， 加入 300mL 冷冻的丙酮， 放入组织捣碎机中快速捣碎， 4℃ 10000r/min 离心 10min， 弃上清液 ； 然后用丙酮冲洗沉淀， 直到叶绿素完全洗净为止 ； 最 后将沉淀置于减压真空离心机中吹干制得丙酮粉。
DV Chlide a 的 制 备 方 法 如 下 ： 按 照 Holden(Holden M.The breakdown of chlorophyll by chlorophyllase.Biochem J， 1961， 78 ： 359-364) 和 Ito 等 (Ito H， Ohtsuka T， Tanaka A.Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a via 7-hydroxymethyl chlorophyll.J Biol Chem， 1996， 271 ： 1475-1479) 的方法， 用 200μg 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a)( 上述经 HPLC 分离所得到的 DV-Chl a) 溶解于 4mL 溶液 (25mM Tris-HCl， pH 7.5 和 40 ％丙酮 ) 中， 与 200mg 丙酮粉在 28 ℃、 黑暗条件下温育 2h， 温育后按照 Ito 等 (Ito H， Tanaka Y， Tsuji H， Tanaka A.Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a byisolated cucumber etioplasts.Arch Biochem Biophys， 1993， 306 ： 148-151) 的方法纯化 DV Chlide a。
联 乙 烯 原 叶 绿 素 酸 酯 a(DV Pchlide a) 是 参 照 (Nagata N， Tanaka R， TanakaA(2007)The major route for chlorophyll synthesis includes[3 ， 8-divinyl]-chlorophyllide a reduction in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol 48 ： 1803-1808) 的方法 )， 从黑暗培养 6 天的水稻 824ys 突变体幼苗中提取所得。 具体操作为 ： 将黑暗中培养 6 天的水稻 824ys 突变体幼苗剪碎后， 与丙酮混合， 在匀浆机 中匀浆 1 分钟， 然后加入 Tris-HCL(pH 7.6) 至终浓度为 200mM， 10000rpm 离心 20min， 上 清液加入等体积的正己烷以除去叶绿素和类胡萝卜素。最后用乙醚从丙酮溶液中萃取 DV Pchlide a， 用氮气吹干， 得到所述联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)。
联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 和联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto) 是 从美国 Frontier Scientific Inc 公司购买。
用作对照的单乙烯叶绿素 a(MV Chl a) 参照上述联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 的 制备方法， 从水稻野生型品种 824B( 黄晓群， 王平荣， 赵海新， 邓晓建 . 一个新的水稻叶 绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位 . 中国水稻科学， 2007， 21(4) ： 355-359 ； Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003) 中提取。
用作对照的单乙烯叶绿素酸酯 a(MV Chlide a) 参照上述联乙烯叶绿素酸酯 a(DVChlide a) 制备方法， 用单乙烯叶绿素 a(MV Chl a) 作底物进行酶反应制备。
用作对照的单乙烯原叶绿素酸酯 a(MV Pchlide a) 是参照上述联乙烯原叶绿素酸 酯 a(DV Pchlide a) 的制备方法， 从黑暗培养 6 天的水稻野生型亲本 824B 幼苗中提取所得。
将 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表 达 的 蛋 白 (ZmDVR) 分 别 与 上 述 DV Chl a 和 DV Chlide a 这两种底物在反应缓冲液 (40mM 柠檬酸， 80mM K2HPO4， 0.5mM NADPH， 20％丙酮， pH 7.0) 中 30℃反应 10min， 由于 ZmDVR 蛋白对底物 DV Pchlide a、 DV Mg-Proto 和 DV MPE 催 化活性较慢， 因此， 对 DV Pchlide a 和 DV MPE 的反应时间设置 10min、 2h 和 10h 三个处理， 对 DV Mg-proto 的反应时间延长到 10h， 同时 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白 (ZmDVR) 与五种底物的反应， 均设置空载体对照。 然后用丙酮终止反应， 转入乙醚中， 经氮气吹干， 再 溶于丙酮， 最后用 HPLC 检测 ( 同时设置作为上述 DV Chl a、 DV Chlide a、 DV Pchlide a 三种底物的相应对照 MV Chl a、 MV Chlide a 和 MV Pchlide a)。按照 Zapata 等 (Zapata M， Rodríguez F and Garrido JL(2000)Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton ： A new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases.Mar.Ecol.Prog.Ser.195 ： 29-45) 的方法进行 HPLC 分析， 洗脱采用梯度流动相 ( 表 1)， 25℃， 流速 1.0mL/min， 上样量 5μL， 酶反应 DV Chl a 和 DV Chlide a 的产物用 C8 柱 (4.6mm i.d.×150mm long ； 3.5μm， Agilent) 检测， 柱中 洗脱的色素分别用 410nm 和 440nm 波长监测 ； 酶反应 DV Pchlide a、 DV MPE 和 DV Mg-proto 的产物用 C8 柱 (4.6mm i.d.×150mm long ； 3.5μm， Waters) 检测， 柱中洗脱的色素分别用 440nm、 410nm 和 410nm 波长监测。
表 1HPLC 分析所采用的梯度流动相8CN 102517262 A
时间 (min) 0 22 28 38 40
说明书溶液 B(％ ) 0 40 95 95 07/7 页溶液 A(％ ) 100 60 5 5 100注： 溶液 A 的配方为甲醇∶乙腈∶ 0.25M 嘧啶水溶液的体积比为 2 ∶ 1 ∶ 1 ； 溶液 B 的配方为甲醇∶乙腈∶丙酮的体积比 1 ∶ 3 ∶ 1。( 甲醇、 乙腈、 丙酮、 嘧啶均为色谱纯， 甲 醇、 乙腈和丙酮为国内生产， 嘧啶购自 Sigma 公司 )
结果显示， BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白质 (ZmDVR) 将以上 5 种底物分 别转化为相应的单乙烯物质， 即将联乙烯叶绿素 a 转化为单乙烯叶绿素 a ； 将联乙烯叶绿 素酸酯 a 转化为单乙烯叶绿素酸酯 a ； 将联乙烯原叶绿素酸酯 a 转化为单乙烯原叶绿素 酸酯 a ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯转化为单乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ转化为单乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ。而空载体对照不能转化以上物质。同时， BL21/ pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白质 (ZmDVR) 对不同底物催化活性具有很大区别， 对底物 DV Chl a 和 DV Chlide a 具有很高的催化活性 ( 图 1)， 而对底物 DV Pchlide a( 图 2)、 DV MPE( 图 3) 和 DV Mg-proto( 图 4) 催化速度较慢或很慢。
本发明涉及一种来源于玉米的联乙烯还原酶及其编码基因与应用。背景技术 叶绿素是植物进行光合作用的重要色素， 它的作用是捕获光能并将光能转移到反 应中心， 故对植物的生长及其产量有很重要的作用。 根据乙烯侧链数目的不同， 叶绿素可分 为 3， 8- 联乙烯叶绿素 (DV Chls) 和 3- 乙烯叶绿素 ( 单乙烯叶绿素， MV Chls)。 在正常情况 下， 几乎所有的植物和细菌用于光合作用的叶绿素都是 MV chls， 目前只发现一类海洋生物 即 “the marine prochlorophyte Prochlorococcus marinus” 利用的是 DVChls(Chisholm SW， Frankel SL， Goericke R， Olson RJ， Palenik B， Waterbury JB， West-Johnsrud L， Zettler ER(1992)Prochlorococcus marinus nov.gen.nov.sp. ： A marine prokaryote containing divinylchlorophyll a andb.Arch.Microbiol 157 ： 297-300.)。
叶绿素生物合成的多样性主要在于它有单乙烯叶绿素 (MV Chls) 和联乙烯叶绿 素 (DV Chls) 两条平行合成的途径， DV Chls 及其中间产物通过联乙烯基还原酶 (DVR， 又叫 C-8 乙烯基还原酶 ) 催化转化成 MV Chls 及其中间产物 (Rebeiz CA， Kolossov VL， Briskin D， Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis ： chlorophyll biosynthetic heterogeneity ， multiple biosynthetic routes ， and biological spin-oVs ， in ： H.S.Nalwa(Ed.)， Handbook of Photochemistry and Photobiology， vol.4， American ScientiWc， Los Angeles ： 183-248.)。 迄今为止， 已在 5 种底物水平上检测到联乙烯还原酶 活性， 分别是联乙烯 Mg- 原卟啉 IX(DV Mg-proto)、 联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE)、 联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)、 联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和联乙烯叶 绿素 a(DV Chl a)(Kolossov VL， Bohnert HJ， Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 ： In situ screening for divinyl chlorophyll(ide)a reductase mutants by spectroXuorometry.Analytical Biochemistry 348 ： 192-197)。现已从水稻， 拟南芥、 绿 硫细菌 Chlorobium tepidum 和蓝细菌 Synechocystis sp.PCC6803 中分别克隆了相应的联 乙烯还原酶基因 DVR、 bciA 和 slr1923(Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003 ； Nagata N， Tanaka R， Satoh S， Tanaka A(2005)Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17， 233-240 ； Chew AGM， Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophyllide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria.J.Biol.Chem 28 ： 2967-2975 ； Islam MR， Aikawa S， Midorikawa T， Kashino Y， Satoh K， Koike H(2008)slr1923 of Synechocystis sp.PCC6803 Is Essential for Conversion of 3， 8-Divinyl(proto)chlorophyll(ide) to 3-Monovinyl(proto)chlorophyll(ide).Plant Physiology 148 ： 1068-1081)。 已 有
叶绿素生物合成的多样性主要在于它有单乙烯叶绿素 (MV Chls) 和联乙烯叶绿 素 (DV Chls) 两条平行合成的途径， DV Chls 及其中间产物通过联乙烯基还原酶 (DVR， 又叫 C-8 乙烯基还原酶 ) 催化转化成 MV Chls 及其中间产物 (Rebeiz CA， Kolossov VL， Briskin D， Gawienowski M(2003)Chloroplast biogenesis ： chlorophyll biosynthetic heterogeneity ， multiple biosynthetic routes ， and biological spin-oVs ， in ： H.S.Nalwa(Ed.)， Handbook of Photochemistry and Photobiology， vol.4， American ScientiWc， Los Angeles ： 183-248.)。 迄今为止， 已在 5 种底物水平上检测到联乙烯还原酶 活性， 分别是联乙烯 Mg- 原卟啉 IX(DV Mg-proto)、 联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE)、 联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)、 联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和联乙烯叶 绿素 a(DV Chl a)(Kolossov VL， Bohnert HJ， Rebeiz CA(2006)Chloroplast biogenesis 92 ： In situ screening for divinyl chlorophyll(ide)a reductase mutants by spectroXuorometry.Analytical Biochemistry 348 ： 192-197)。现已从水稻， 拟南芥、 绿 硫细菌 Chlorobium tepidum 和蓝细菌 Synechocystis sp.PCC6803 中分别克隆了相应的联 乙烯还原酶基因 DVR、 bciA 和 slr1923(Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003 ； Nagata N， Tanaka R， Satoh S， Tanaka A(2005)Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17， 233-240 ； Chew AGM， Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophyllide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria.J.Biol.Chem 28 ： 2967-2975 ； Islam MR， Aikawa S， Midorikawa T， Kashino Y， Satoh K， Koike H(2008)slr1923 of Synechocystis sp.PCC6803 Is Essential for Conversion of 3， 8-Divinyl(proto)chlorophyll(ide) to 3-Monovinyl(proto)chlorophyll(ide).Plant Physiology 148 ： 1068-1081)。 已 有
实验证明 ： 用 NADPH 作为还原剂， 重组的绿硫细菌 (Chlorobium tepidum)BciA 蛋白质将 DV Pchlide a 还原成 MV Pchlide a(Chew AGM， Bryant DA(2007)Characterization of a Plant-like Protochlorophyllide a Divinyl Reductase in Green Sulfur Bacteria. J.Biol.Chem 28 ： 2967-2975) ； 重组的拟南芥 DVR 蛋白质将 DVChlide a 还原成 MV Chlide a， 但不能将 DV Pchlide a、 DV Chlide b、 DV Chl a 和 DV Chl b 等 4 种 DV 物质转化为相 应的 MV 物质 (Nagata N， Tanaka R， Tanaka A(2007)The Major Route for Chlorophyll Synthesis Includes[3， 8-divinyl]-chlorophyllide a Reduction in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol 48 ： 1803-1808)。 我 们 通 过 酶 学 实 验 证 实 重 组 的 水 稻 DVR 蛋白质不仅能将 DV Chlide a 还原成 MV Chlide a， 而且能还原 DV Chl a 为 MV Chl a(Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ (2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003)。 目 前， 联 乙 烯 Mg- 原 卟 啉 IX(DV Mg-proto) 和联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 这 2 种联乙烯 (DV 型 ) 物质转化为相 应单乙烯 (MV 型 ) 物质， 还没有得到利用纯化 DVR 酶蛋白所做的体外酶学实验的证实， 同 时， 还不清楚的是， 这些联乙烯中间物质是由一个具有广泛特异性的联乙烯基还原酶催化， 还是由多个联乙烯基还原酶 ( 每个酶都有特异底物 ) 催化生成相应的单乙烯物质。 发明内容
本发明的目的是提供一种具有联乙烯还原酶活性的蛋白， 该蛋白来源于玉米 (Zea mays L.)。
本发明所提供的具有联乙烯还原酶活性的蛋白， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中序列 2 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加， 且具有联乙烯还原酶活性的由 1) 衍生的蛋白质。
编码上述蛋白的基因 (ZmDVR) 也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下 1)-3) 中任一种 ：
1) 其编码序列是序列表中序列 1 的 DNA 分子 ；
2) 在严格条件下与 1) 或 2) 的 DNA 分子杂交且编码上述具有联乙烯还原酶活性蛋 白的 DNA 分子 ；
3) 与 1) 或 2) 的 DNA 分子具有 90％以上的同源性且编码上述具有联乙烯还原酶 活性蛋白的 DNA 分子。
含有上述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
所述重组表达载体具体可为在 pET-30a(+) 的多克隆位点间插入上述基因得到的 重组表达载体。在本发明的实施例中， 所述多克隆位点具体为 BamH I 和 EcoR I。
所述表达盒为由能够启动 ZmDVR 基因表达的启动子， ZmDVR 基因， 以及转录终止序 列组成。
在本发明的一个实施例中， 所述重组菌具体为携带有 ZmDVR 基因的大肠杆菌 ； 所 述大肠杆菌具体为 BL21。本发明所提供蛋白在作为联乙烯还原酶中的应用也属于本发明的保护范围。
上述具有联乙烯还原酶活性的蛋白或 ZmDVR 基因在如下 1)-5) 任一中的应用也属 于本发明的保护范围 ：
1) 转化联乙烯叶绿素 a 为单乙烯叶绿素 a ；
2) 转化联乙烯叶绿素酸酯 a 为单乙烯叶绿素酸酯 a ；
3) 转化联乙烯原叶绿素酸酯 a 为单乙烯原叶绿素酸酯 a ；
4) 转化联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯为单乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 ；
5) 转化联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ为单乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ。
实验证明 ： 本发明提供的来源于玉米的蛋白具有联乙烯还原酶活性， 能将联乙烯 叶绿素 a 转化为单乙烯叶绿素 a ； 将联乙烯叶绿素酸酯 a 转化为单乙烯叶绿素酸酯 a ； 将联 乙烯原叶绿素酸酯 a 转化为单乙烯原叶绿素酸酯 a ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯转化为 单乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ转化为单乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ。 附图说明 图 1 为以联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 作为 底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， A 和 B 的左侧图分别是反应 10min 的产物 在 440nm 和 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， 右侧图均是每个峰的吸收光谱。A 代表底物为联 乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。B 代表底物为联乙 烯叶绿素 a(DV Chl a) 的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。具体的， A1 和 A2 分别是联乙 烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 和单乙烯叶绿素酸酯 a(MVChlide a)。B1 和 B2 分别是联 乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 和单乙烯叶绿素 a(MV Chl a)。A3 和 B3 分别是 DV Chlide a 与 BL21/pET-30a(+) 空载体反应后的色素 ( 阴性对照 )， 以及 DV Chla 与 BL21/pET-30a(+) 空
载体反应后的色素 ( 阴性对照 ) ； A4 和 B4 分别是 DV Chlide a 与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素， 以及 DV Chla 与 BL21/pET-30 a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液 反应后的色素。 A0( 空白对照 ) 是用茼蒿叶片制备的丙酮粉中残留的 MV-Chl a 经温育后产 生的 MV-Chlide a ； A1 和 A3 中的弱峰 ( 峰 2) 即是从丙酮粉中残留的 MV-Chl a 转化而来的 MV-Chlide a。
图 2 为以联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a) 作为底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， A 代表反应 10min 的产物在 440nm 检测到的 HPLC 色谱图， B 代表反应 2h 的产物在 440nm 检测到的 HPLC 色谱图， C 代表反应 10h 的产物在 440nm 检测到的 HPLC 色谱 图， D 代表每个峰的吸收光谱。具体的， A1、 B1、 C1 均是联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a) ； A2、 B2、 C2 均是单乙烯原叶绿素酸酯 a(MVPchlide a) ； A3、 B3、 C3 均是 DV Pchlide a 与 BL21/pET-30a(+) 空载体反应后的色素 ( 阴性对照 ) ； A4、 B4、 C4 均是 DV Pchlide a 与 BL21/ pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素。
图 3 为以联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 作为底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， A 代表反应 10min 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， B 代表反应 2h 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， C 代表反应 10h 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色 谱图， D 代表每个峰的吸收光谱。具体的， A1、 B1、 C1 均是联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) ； A2、 B2、 C2 均是 DV MPE 与 BL21/pET-30a(+) 空载体反应后的色素 ( 阴性对照 ) ； A3、B3、 C3 均是 DV MPE 与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素。
图 4 为以联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto) 作为底物的酶学反应产物的 HPLC 检测光谱图。其中， 左侧图代表反应 10h 的产物在 410nm 检测到的 HPLC 色谱图， 右侧图 代表每个峰的吸收光谱。具体的， A1 是联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto) ； A2 是 DV Mg-proto 与 BL21/pET-30a(+) 空 载 体 反 应 后 的 色 素 ( 阴 性 对 照 ) ； A3 是 DVMg-proto 与 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 大肠杆菌裂解液反应后的色素。 具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 玉米联乙烯还原酶基因的克隆及其编码蛋白的功能验证
一、 玉米联乙烯还原酶基因的克隆
设计如下引物 ：
ZmDVR-F ： 5’ -CCGGATCCATGGCGACCATCCTCCTATC-3’ ( 下划线处为 BamH Ⅰ酶切位 点)
ZmDVR-R ： 5’ -ATGGAATTCGCCTAGAAGATGGTCTGCTC-3’ ( 下划线处为 EcoR Ⅰ酶切位 点)
以玉米 (Zea mays L.) 品种 “B73” 自交系叶片提取的 DNA 为模板， 用引物 ZmDVR-F 和 ZmDVR-R 进行 PCR 扩增， 得到 1206bp 的片段， 将该片段连接在 pMD-18-T(TaKaRa) 载体上， 构建成 pMD-ZmDVR， 然后转化到大肠杆菌 JM109 菌株中， 筛选阳性克隆后测序。测序结果表 明： 扩增得到的片段具有序列表中序列 1 所示的序列， 将其命名为 ZmDVR。序列 1 所示序列 即为 ZmDVR 基因的编码序列， 它编码得到序列表中序列 2 所示氨基酸序列组成的蛋白质， 将 该蛋白质命名为 ZmDVR。
二、 玉米联乙烯还原酶基因编码蛋白的获得及其功能验证
1、 重组表达载体 pET-30a(+)-ZmDVR 的构建
将经步骤一测序鉴定过的 pMD-ZmDVR 载体用 BamH I 和 EcoR I 双酶切， 连接到经 同样酶切过的表达载体连接到经同样酶切过的表达载体 pET-30a(+)(Novagen， 产品目录号 69909-3) 上， 构成重组表达载体 pET-30a(+)-ZmDVR。
2、 诱导表达
将步骤 1 的重组表达载体 pET-30a(+)-ZmDVR 转化到大肠杆菌菌株 BL21( 同时 设置 pET-30a(+) 空载体转化到大肠杆菌菌株 BL21 的对照 )， 在 37 ℃， LB/kan 培养基上 过夜培养， 挑选单克隆于 37℃， LB/kan 培养液中振荡培养， 提取质粒 DNA(OMEGA 试剂盒 )， 用 BamH I 和 EcoR I 双酶切， 琼脂糖凝胶电泳检测 ZmDVR 基因是否插入载体 pET-30a(+) 中， 将检测含有 ZmDVR 基因的重组表达载体的克隆送上海英骏公司测序， 将筛选正确插入 pET-30a(+) 的 ZmDVR 基因的重组表达载体的克隆命名为 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR。转入 pET-30a(+) 空载体的大肠杆菌菌株 BL21 命名为 BL21/pET-30a(+)。然后参照 (Nagata N， Tanaka R， Satoh S， Tanaka A(2005)Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for the evolution of Prochlorococcus Species.Plant Cell 17 ： 233-240) 的 方 法 将 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 进行诱导表达， 具体方法如下 ： 分别挑选 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 和含 有空载体 PET-30A(+) 的 BL21( 空载体对照 CK) 单克隆于 20 ℃， LB/kan 培养液中振荡培 养一夜， 分别取 1ml 菌液于 100ml LB/kan 培养液， 30 ℃振荡培养 30min 后加入异丙基硫 代 -β- 半乳糖苷 (IPTG)， 终浓度为 0.5mM， 于 30℃诱导培养 7h， 4℃ 10000rpm 离心 10min， -1 -1 沉淀用含有 6.7μg·ml 溶菌酶和 3.3μg·ml DNaseI 的 50mM 的 Tris-HCl 的溶液悬浮， 溶解产物放入 -20℃冰箱保存。
3、 酶促反应验证蛋白功能
此步骤所用底物涉及如下五种 ： 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a)、 联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a)、 联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)、 联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 和联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto)。
这五种底物的获得途径如下 ： 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 从水稻 824ys 突变体 ( 黄晓群， 王平荣， 赵海新， 邓晓建 . 一个新的水稻叶绿素缺失突变基因的遗传分析与分子 标记定位 . 中国水稻科学， 2007， 21(4) ： 355-359 ； Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003) 叶绿素中分离， 用 100％丙酮从 824ys 突变体新鲜叶片组织中浸提叶绿素， 提取 液 10000r/min(Eppendorf 5804R) 离心 15min， 上清液在氮气下吹干， 重溶于 100％丙酮。 然 后用 C18 柱 (4.6mm i.d.×150mm long ； 5μm， Agilent， U.S.A) 进行 HPLC 分离， 洗脱条件是 流动相 ： 甲醇∶乙腈∶丙酮＝ 1 ∶ 3 ∶ 1， 40℃， 流速 1.0mL/min， 上样量 5μL， 柱中洗脱的色 素用 660nm 波长监测， 在相应保留时间收集 DV-Chl a， 具体参见 Wang 等在 Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice. Plant Physiol 153， 994-1003 中记载的方法。
联乙烯叶绿素酸酯 a(DV Chlide a) 是用上述分离的联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 与从茼蒿叶片制备的丙酮粉中的叶绿素酶反应所得。
其中， 丙酮粉 ( 叶绿素酶 ) 的制备方法如下 ： 按照 Ito 等 (Ito H， Takaichi S， Tsuji H， Tanaka A.Properties of synthesis of chlorophyll a from chlorophyll b in cucumber etioplasts.J Biol Chem， 1994， 269 ： 22034-22038) 的 方 法，用 茼 蒿 (Garland chrysanthemum)( 品种为 “清香茼蒿” ， 从农贸市场种子摊商购买 ) 叶片制备丙 酮粉， 具体为 ： 取 15g 新鲜茼蒿叶片， 加入 300mL 冷冻的丙酮， 放入组织捣碎机中快速捣碎， 4℃ 10000r/min 离心 10min， 弃上清液 ； 然后用丙酮冲洗沉淀， 直到叶绿素完全洗净为止 ； 最 后将沉淀置于减压真空离心机中吹干制得丙酮粉。
DV Chlide a 的 制 备 方 法 如 下 ： 按 照 Holden(Holden M.The breakdown of chlorophyll by chlorophyllase.Biochem J， 1961， 78 ： 359-364) 和 Ito 等 (Ito H， Ohtsuka T， Tanaka A.Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a via 7-hydroxymethyl chlorophyll.J Biol Chem， 1996， 271 ： 1475-1479) 的方法， 用 200μg 联乙烯叶绿素 a(DV Chl a)( 上述经 HPLC 分离所得到的 DV-Chl a) 溶解于 4mL 溶液 (25mM Tris-HCl， pH 7.5 和 40 ％丙酮 ) 中， 与 200mg 丙酮粉在 28 ℃、 黑暗条件下温育 2h， 温育后按照 Ito 等 (Ito H， Tanaka Y， Tsuji H， Tanaka A.Conversion of chlorophyll b to chlorophyll a byisolated cucumber etioplasts.Arch Biochem Biophys， 1993， 306 ： 148-151) 的方法纯化 DV Chlide a。
联 乙 烯 原 叶 绿 素 酸 酯 a(DV Pchlide a) 是 参 照 (Nagata N， Tanaka R， TanakaA(2007)The major route for chlorophyll synthesis includes[3 ， 8-divinyl]-chlorophyllide a reduction in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol 48 ： 1803-1808) 的方法 )， 从黑暗培养 6 天的水稻 824ys 突变体幼苗中提取所得。 具体操作为 ： 将黑暗中培养 6 天的水稻 824ys 突变体幼苗剪碎后， 与丙酮混合， 在匀浆机 中匀浆 1 分钟， 然后加入 Tris-HCL(pH 7.6) 至终浓度为 200mM， 10000rpm 离心 20min， 上 清液加入等体积的正己烷以除去叶绿素和类胡萝卜素。最后用乙醚从丙酮溶液中萃取 DV Pchlide a， 用氮气吹干， 得到所述联乙烯原叶绿素酸酯 a(DV Pchlide a)。
联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 和联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ (DV Mg-proto) 是 从美国 Frontier Scientific Inc 公司购买。
用作对照的单乙烯叶绿素 a(MV Chl a) 参照上述联乙烯叶绿素 a(DV Chl a) 的 制备方法， 从水稻野生型品种 824B( 黄晓群， 王平荣， 赵海新， 邓晓建 . 一个新的水稻叶 绿素缺失突变基因的遗传分析与分子标记定位 . 中国水稻科学， 2007， 21(4) ： 355-359 ； Wang PR， Gao JX， Wan CM， Zhang FT， Xu ZJ， Huang XQ， Sun XQ， Deng XJ(2010)Divinyl chlorophyll(ide)a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide)a by a divinyl reductase in rice.Plant Physiol 153， 994-1003) 中提取。
用作对照的单乙烯叶绿素酸酯 a(MV Chlide a) 参照上述联乙烯叶绿素酸酯 a(DVChlide a) 制备方法， 用单乙烯叶绿素 a(MV Chl a) 作底物进行酶反应制备。
用作对照的单乙烯原叶绿素酸酯 a(MV Pchlide a) 是参照上述联乙烯原叶绿素酸 酯 a(DV Pchlide a) 的制备方法， 从黑暗培养 6 天的水稻野生型亲本 824B 幼苗中提取所得。
将 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表 达 的 蛋 白 (ZmDVR) 分 别 与 上 述 DV Chl a 和 DV Chlide a 这两种底物在反应缓冲液 (40mM 柠檬酸， 80mM K2HPO4， 0.5mM NADPH， 20％丙酮， pH 7.0) 中 30℃反应 10min， 由于 ZmDVR 蛋白对底物 DV Pchlide a、 DV Mg-Proto 和 DV MPE 催 化活性较慢， 因此， 对 DV Pchlide a 和 DV MPE 的反应时间设置 10min、 2h 和 10h 三个处理， 对 DV Mg-proto 的反应时间延长到 10h， 同时 BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白 (ZmDVR) 与五种底物的反应， 均设置空载体对照。 然后用丙酮终止反应， 转入乙醚中， 经氮气吹干， 再 溶于丙酮， 最后用 HPLC 检测 ( 同时设置作为上述 DV Chl a、 DV Chlide a、 DV Pchlide a 三种底物的相应对照 MV Chl a、 MV Chlide a 和 MV Pchlide a)。按照 Zapata 等 (Zapata M， Rodríguez F and Garrido JL(2000)Separation of chlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton ： A new HPLC method using a reversed phase C8 column and pyridine containing mobile phases.Mar.Ecol.Prog.Ser.195 ： 29-45) 的方法进行 HPLC 分析， 洗脱采用梯度流动相 ( 表 1)， 25℃， 流速 1.0mL/min， 上样量 5μL， 酶反应 DV Chl a 和 DV Chlide a 的产物用 C8 柱 (4.6mm i.d.×150mm long ； 3.5μm， Agilent) 检测， 柱中 洗脱的色素分别用 410nm 和 440nm 波长监测 ； 酶反应 DV Pchlide a、 DV MPE 和 DV Mg-proto 的产物用 C8 柱 (4.6mm i.d.×150mm long ； 3.5μm， Waters) 检测， 柱中洗脱的色素分别用 440nm、 410nm 和 410nm 波长监测。
表 1HPLC 分析所采用的梯度流动相8CN 102517262 A
时间 (min) 0 22 28 38 40
说明书溶液 B(％ ) 0 40 95 95 07/7 页溶液 A(％ ) 100 60 5 5 100注： 溶液 A 的配方为甲醇∶乙腈∶ 0.25M 嘧啶水溶液的体积比为 2 ∶ 1 ∶ 1 ； 溶液 B 的配方为甲醇∶乙腈∶丙酮的体积比 1 ∶ 3 ∶ 1。( 甲醇、 乙腈、 丙酮、 嘧啶均为色谱纯， 甲 醇、 乙腈和丙酮为国内生产， 嘧啶购自 Sigma 公司 )
结果显示， BL21/pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白质 (ZmDVR) 将以上 5 种底物分 别转化为相应的单乙烯物质， 即将联乙烯叶绿素 a 转化为单乙烯叶绿素 a ； 将联乙烯叶绿 素酸酯 a 转化为单乙烯叶绿素酸酯 a ； 将联乙烯原叶绿素酸酯 a 转化为单乙烯原叶绿素 酸酯 a ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯转化为单乙烯 Mg- 原卟啉 IX 单甲酯 ； 将联乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ转化为单乙烯 Mg- 原卟啉Ⅸ。而空载体对照不能转化以上物质。同时， BL21/ pET-30a(+)-ZmDVR 表达的蛋白质 (ZmDVR) 对不同底物催化活性具有很大区别， 对底物 DV Chl a 和 DV Chlide a 具有很高的催化活性 ( 图 1)， 而对底物 DV Pchlide a( 图 2)、 DV MPE( 图 3) 和 DV Mg-proto( 图 4) 催化速度较慢或很慢。
这表明克隆的 ZmDVR 基因编码有功能的联乙烯还原酶， 本发明首次利用纯化的联 乙烯还原酶进行体外酶学实验证实联乙烯 Mg- 原卟啉 IX(DV Mg-proto) 和联乙烯 Mg- 原卟 啉 IX 单甲酯 (DV MPE) 这两种联乙烯 (DV 型 ) 物质可被转化为相应单乙烯 (MV 型 ) 物质。 同时， 本发明也首次证实上述五种底物 ( 叶绿素生物合成的联乙烯中间物质 ) 均可被玉米 联乙烯还原酶 ZmDVR 转化为相应的单乙烯物质， 说明叶绿素生物合成途径中的联乙烯还原 酶 ZmDVR 是由一个基因编码的、 具有广谱底物特异性的联乙烯还原酶， 从而进一步阐明了 叶绿素生物合成途径。9CN 102517262 A
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