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用于转基因玉米 Mon810 检测的标准质粒分子及其构建方 法
    技术领域 本发明涉及一种用于转基因玉米 Mon810 检测的标准质粒分子及其构建方法， 属 于生物检测技术领域。
     背景技术 基因工程技术的出现和应用为农业、 医学等领域开辟了一个全新的发展时代。自 1983 年首例转基因烟草作物问世以来 , 基因工程技术发展日新月异 , 转基因作物新品种 不断涌现， 在短短 20 多年时间内得到了飞跃发展， 据国际农业生物技术应用署 (ISAAA) 的 最新资料表明， 自 1996 年到 2010 年， 全球的转基因作物种植总面积增加了 87 倍， 达到了 1.48 亿公顷。与此同时 , 大量的遗传改良农产品涌入我国市场， 我国农业转基因生物安全 管理办公室已经为棉花、 玉米、 大豆、 油菜四种作物颁发了安全进口证书。转基因玉米有 11 个品系允许进口用于加工原料， 其中包括转基因玉米 Mon810。随着遗传改良作物的广泛 种植， 转基因作物的生态风险 , 可能带来的环境问题、 转基因产品作为食品、 饲料对人类及 动物的可能带来健康问题、 国际贸易问题、 知识产权问题等生物安全性问题已引起世界性 的广泛关注 , 国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规， 加强遗传改良作物的规范管 理， 并对遗传改良作物及其产品实施标识制度。
     为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度， 建立高效、 快速、 特异的检测 技术十分必要， 它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。基于核酸的聚 合酶链反应 （PCR） 检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点， 已成为目前最重要、 应用最 广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。PCR 检测方法建立的主要依据是特异性的扩增遗 传改良植物的外源基因片段。在转基因植物中， 稳定表达的外源 DNA 插入片段一般包括启 动子、 目的基因和终止子三类元件。针对扩增的外源 DNA 片段差异， PCR 检测策略可以分为 四种， 即通用元件筛选 PCR 检测、 基因特异性 PCR 检测、 构建特异性 PCR 检测和品系特异性 PCR 检测。 筛选 PCR 检测主要是以转基因植物的通用元件和标记基因作为特异性扩增片段， 由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因植物的研究与生产中， 从而大大降 低了筛选 PCR 检测的特异性， 但可用于转基因植物检测的初步筛选， 检测到这些通用元件 也预示着检测样品中存在有转基因成分。基因特异性 PCR 检测以插入外源基因的特异性 DNA 片段作为目的检测片段， 相比筛选 PCR 特异性增强。但是， 由于相同的外源基因可能在 相同或不同的植物中表达形成新的具有相似农艺性状的品系或新的转基因植物， 因此基因 特异性 PCR 检测方法不能异性的区分具有相似农艺性状的转基因植物及其品系。构建特异 性 PCR 检测是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区 DNA 序列实现的。这种方法具有 相对较高的特异性， 在转基因植物及其产品检测中使用较多。但是由于相同的转基因外源 表达载体在基因转化过程中， 可能以一个、 两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同 的植物基因组中， 形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系， 因此构建特异性 PCR 检测 不能区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。品系特异性 PCR 检测是通过检
     测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每个遗传改良作物品系， 都具有 特异性的外源插入载体与植物基因组的连接区序列， 并且连接区序列是单拷贝的， 因此品 系特异性检测方法具有较筛选、 基因特异性和构建特异性 PCR 检测方法更高的特异性和准 确性， 能够特异性的检测专一的遗传改良作物品系。虽然， 四种 PCR 检测策略特异性有所差 异， 但各有所长， 目前所建立并应用于转基因作物检测的 PCR 方法主要围绕这四种策略。
     在实际检测中， 标准物质十分重要。然而， 由于专利权和现有技术的限制， 遗传改 良作物标准物质的获得相对较难。目前， 用于转基因检测的阳性标准物质主要是用纯合的 转基因植物材料配置的， 到目前为止仅得到了十几种遗传改良作物的标准物质在市场上销 售。但这类来源于农产品的标准物质， 其必须有专门的研究机构来制备， 贮存和测定过程 受很多因素影响， 很难维持恒定的量， 而且， 这些标准物质的转基因含量范围一般是从 0.1% 到 5%， 而实际检测的样品中的转基因含量可能会超出这个范围。标准物质的缺乏已成为检 测方法建立和应用的瓶颈， 阻碍了转基因产品标识制度的顺利实施。
     标准分子的概念由日本科学家 Kuribara 等于 2002 年提出， 它是指一种含有转基 因检测目的外源基因和内标准基因的特异性片段的线性化重组质粒分子。 经验证质粒标准 分子在遗传改良作物鉴定检测中是很好的标准物质替代物。质粒分子的优点主要是可以 通过微生物进行大量培养， 纯度较高 ； 且操作容易， 稳定性高， 同一个标准分子可以同时包 含多个外源目的基因和内标准基因， 经济高效。近年来， 越来越受到各国转基因检测专家 和学者们的重视， 并逐渐取代传统阳性标准品用于转基因品系及其加工产品的定量 PCR 检 测。现在文献报道的用于检测转基因玉米的质粒标准分子中， 涉及转基因玉米 Mon810 的有 pMu15、 pMD-ZM、 p3SNTM-9 和 ERM-AD413 等， 但是它们有的只能用于检测构建特异与筛选特 异性， 有的只能用于检测品系特异性， 不能满足一种标准物质对筛选特异性检测、 基因特异 性检测、 构建特异性检测和品系特异性检测的要求。 发明内容
     为了解决上述问题， 本发明提供了一种用于转基因玉米 Mon810 检测的标准质粒 分子及其构建方法， 具体涉及转基因玉米 Mon810 筛选特异性检测、 基因特异性检测、 构建 特异性检测和品系特异性检测用标准质粒分子及其构建方法， 使其可以代替转基因玉米 Mon810 的阳性标准物质用于遗传改良玉米的定性、 定量 PCR 检测。
     根据转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列、 构建特异性序列和内标准基因序列， 首先利用重叠 PCR 反应的原理设计特异 PCR 引物， 经过 PCR 扩增获得转基因玉米 Mon810 的 品系特异性序列和构建特异性序列的重组 DNA 片段， 利用分子克隆技术将重组 DNA 片段克 隆到 pMD18-T 载体中。然后， 利用设计的特异性引物扩增玉米内标准基因 zSSIIb 的一段序 列， 按照设计的限制性内切酶酶切位点连接到 pMD18-T 质粒中重组 DNA 片段的上游， 获得标 准质粒分子， 命名为 pMHZ。本发明构建的标准质粒分子 pMHZ 可代替转基因玉米 Mon810 原 有的阳性标准物质， 用于定性和定量 PCR 检测， 彻底解决转基因玉米 Mon810 检测中标准物 质缺乏的难题。同时， 该质粒含有 CaMV35S 和 CryIA（b）序列， 可以用于其他含有 CaMV35S 启动子和 CryIA（b）的转基因品系的定性和定量检测。
     本发明所述标准质粒分子 pMHZ， 同时含有转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列、 构建特异性序列和内标准基因的一段序列， 用以代替转基因玉米 Mon810 的阳性标准物质，可用于转基因玉米 Mon810 定性和定量 PCR 检测。
     本发明所述标准质粒分子 pMHZ 构建方法， 包括如下步骤 ： ① 利用 GenBank 等数据库进行生物信息学分析， 获得转基因玉米 Mon810 的品系特异 性序列、 构建特异性序列和玉米内标准基因 zSSIIb 特异性序列。
     所述的转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列， 指的是转基因玉米 Mon810 外源插 入载体与玉米基因组邻接区的一段 DNA 序列， 其序列如 Seq ID No:1 所示。
     所述的构建特异性序列， 指的是外源插入载体的 Hsp70 和 cryIA（b）两个元件的 连接区的一段 DNA 序列， 其序列如 Seq ID No:2 所示。
     所述的玉米内标准基因 zSSIIb ， 指的是编码玉米淀粉合酶异构体 zSTS Ⅱ -2 的基 因， 其在玉米基因组中高度保守， 具有种间特异性、 种内非特异性和单拷贝数的特点 ； 玉米 内标准基因 zSSIIb GenBank 中登录号为 AF019297。所述的玉米内标准基因 zSSIIb 特异 性序列， 指的是玉米内标准基因 zSSIIb 的 296nt-536nt， 其序列如 Seq ID No:3 所示。
     ② 设计 PCR 特异引物。
     所述的 PCR 特异性引物， 指的是与玉米遗传改良品系 Mon810 的品系特异性序列、 构建特异性序列和玉米内标准基因 zSSIIb 基因序列完全相同或互补的寡聚核苷酸链， 分 别为 ： MT-F, 其序列如 Seq ID No:4 所示， MT-R, 其序列如 Seq ID No:5 所示， 用于扩增 Mon810 玉米的品系特异性序列 ； HC-F, 其序列如 Seq ID No:6 所示， HC-R, 其序列如 Seq ID No:7 所示， 用于扩增 Mon810 玉米的构建特异性序列 ； ZB-F, 其序列如 Seq ID No:8 所示， ZB-R, 其序列如 Seq ID No:9 所示， 用于扩增玉米的内标准基因 zSSIIb 基因的特异性 序列。
     ③特异性扩增转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列、 构建特异性序列和玉米内 标准基因 zSSIIb 的特异性序列。
     所述的特异性扩增， 指的是利用设计的 PCR 引物分别扩增转基因玉米 Mon810 的品 系特异性序列 （Seq ID No:1） 、 构建特异性序列 （Seq ID No:2） 和内标准基因 zSSIIb 的特 异性序列 （Seq ID No:3） 。
     ③ 转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列和构建特异性序列的拼接。
     所述的拼接， 指的是利用重叠 PCR 技术将转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列和 构建特异性序列连接融合成一个重组的 DNA 片段， 其序列如 Seq ID No:10 所示。
     ④ 重组 DNA 片段及玉米内标准基因 zSSIIb 的特异性片段克隆进入 pMD18-T 载 体 首先将上述得到的重组 DNA 片段用酶切位点 Bam H I 和 Hin d III 连接到质粒载体 pMD18-T（TAKARA 公司） 中； 然后将 PCR 特异性扩增的玉米内标准基因 zSSIIb 的 DNA 片段 （Seq ID No:11） 用酶切位点 Bam H I 和 Eco R I 连接到 pMD18-T 质粒中重组 DNA 片段的上 游， 因此获得将转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列、 构建特异序列以及玉米内标准基因 zSSIIb 的特异性序列融合在 pMD18-T 上的标准质粒分子 pMHZ， 其序列如 Seq ID No:12 所 示。⑤ 标准质粒分子 pMHZ 的定性和定量 PCR 检测方法验证。
     所述的定性 PCR 检测方法验证， 是指利用标准质粒分子 pMHZ 构建的品系特异性片 段只能在转基因玉米 Mon810 基因组 DNA 中扩展获得， 而不能在其他玉米品系， 和其他遗传 改良作物基因组中扩增得到。
     所述的定量 PCR 检测方法验证， 是指检测标准质粒分子 pMHZ 在进行定量 PCR 分 析时的特异性、 灵敏度、 重复性和重演性等特性， 以鉴定该标准分子替代转基因玉米 Mon810 阳性标准物质的能力， 以及实际应用于定量 PCR 检测转基因玉米 Mon810 的测定有效性。
     本发明的有益效果在于， 利用重叠 PCR 和分子亚克隆的方法首次构建了含有玉米 内标准基因 zSSIIb 特异性序列和转基因玉米 Mon810 的品系特异性序列和构建特异性序列 的标准质粒分子 pMHZ。 本发明中制备的标准质粒分子 pMHZ 可以代替转基因玉米 Mon810 的 阳性标准物质， 很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题。标准质粒分子 pMHZ 对实际样品分析的结果比较准确， 检测结果的偏差在 ISO 遗传改良食品检测标准允许 的 0-0.25 范围内。因此， 本发明中构建的标准质粒分子完全适用于对转基因玉米 Mon810 样品及其加工产品中的遗传改良成分进行定量分析。 附图说明 图 1 标准质粒分子 pMHZ 的示意图 ； 图中 pMD-18T 表示构建标准质粒分子的载体 ； Eco R I 表示该位点含有限制性内切酶 Eco R I 的酶切位点 ； Bam H I 表示该位点含有限制性内切酶Bam H Ⅰ的酶切位点 ； Hin d III 表 示该位点含有限制性内切酶 Hin d III 的酶切位点， “zSSIIb” 表示玉米内标准基因 zSSIIb 的一段特异性序列 ； “品系特异性序列” 表示转基因玉米 Mon810 外源插入载体与玉米基因 组邻接区的一段 DNA 序列 ； “构建特异性序列” 表示外源插入载体的 Hsp70 和 cryIA（b）两 个元件的连接区的一段 DNA 序列。
     具体实施方式
     下面以实施例为例对本发明作详细的说明 ： 本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施， 给出了详细的实施方式和过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
     实施例 1 ： 标准分子的构建 1、 构建标准质粒分子 pMHZ 的 PCR 引物序列设计 根据 GenBank 中公布的转基因玉米 Mon810 外源插入载体与玉米基因组邻接区的基因 序列 （登录号 AF434709 ） ， 外源载体主要元件的序列信息 （登录号 AY326434 ） 以及玉米内 标基因 zSSIIb 的序列信息 （登录号 AF019297） ， 利用软件 Primer 5.0 设计三对特异性引物 （如表 1） ， 分别为 : MT-F, 其序列如 Seq ID No:4 所示， 序列 3-8 碱基对处为 Bam H Ⅰ的酶切位点， MT-R, 其序列如 Seq ID No:5 所示 ； MT-F 位于玉米基因组上， MT-R 位于转基因玉米 Mon810 的外源插入载体的 CaMV35S 启动子序列上， 用于扩增 Mon810 玉米的品系特异性序 列； HC-F, 其序列如 Seq ID No:6 所示， HC-R, 其序列如 Seq ID No:7 所示， 序列 3-8 碱基对处为 Hin d III 的酶切位点 ； HC-F位于 Hsp70 序列上， HC-R 位于 cryIA(b) 序列上， 用于扩增 Mon810 玉米的外源插入载体的 Hsp70 和 cryIA（b）两个元件的连接区的构建特异性序列 ； ZB-F, 其序列如 Seq ID No:8 所示， 序列 3-8 碱基对处为 Eco R Ⅰ的酶切位点， ZB-R, 其序列如 Seq ID No:9 所示， 序列 3-8 碱基对处为 Bam H Ⅰ的酶切位点 , 用于扩 增玉米的内标准基因 zSSIIb 基因的特异性序列。
     2、 转基因玉米 Mon810 内源标准基因序列、 品系特异性序列和构建特异性序列的 扩增 以转基因玉米 Mon810 基因组 DNA 为模板， 利用以下设计的三对引物分别对玉米内标准 基因 zSSIIb 的特异性序列 （位于玉米内标准基因 zSSIIb 296nt-536nt） 、 品系特异性序 列和构建特异性序列进行 PCR 扩增。扩增条件均为 ： PCR 反应体积为 50μl, 包括以下成分 ： 10×PCR 缓冲液 5μl dNTPs 4μl 上游引物 （20μM) 1μl 下游引物 （20μM) 1μl 模板 5μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl ddH2O 33.5μl PCR 反应条件为 ： 94℃ 5 分钟 ； 然后进入以下循环 94℃ 50 秒， 55℃ 50 秒 ,72℃ 60 秒， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 5 分钟。
     经过 PCR 扩增后得到了长 257bp 的玉米内标准基因片段 （其序列如 Seq ID No:10 所示） 、 长 392bp 的品系特异性序列片段 （其序列如 Seq ID No:13 所示） 和长 440bp 的外源 插入载体的构建特异性序列片段 （其序列如 Seq ID No:14 所示） ， 将上述 PCR 扩增得到的品 系特异性序列片段和构建特异性序列片段产物分别记为 PMT 和 PHC。对扩增得到的条带进 行回收纯化， 通过测序分析表明获得的序列与目的扩增片段序列一致。
     表 1. 构建标准质粒分子 pMHZ 的 PCR 引物序列3、 利用重叠 PCR 方法对品系特异性序列片段和构建特异性序列片段进行连接 用上述 PCR 得到的品系特异性序列产物 PMT 和构建特异序列产物 PHC 为模板， 以 MT-F(Seq ID No:3 ) 和 HC-R(Seq ID No:6) 作为重叠 PCR 的引物对， 进行 PCR 扩增， 实现 品系特异性序列和构建特异序列的重组拼接。重叠 PCR 分两步扩增 ： 第一步 ： 扩增的条件为 ： PCR 反应体积为 50μl, 包括以下成分 ： 10×PCR 缓冲液 5μl dNTPs 4μl PMT 5μl PHC 5μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl ddH2O 30.5μl PCR 反应条件为 ： 94℃ 4 分钟 ； 然后进入以下循环 94℃ 1 分钟， 60℃ 4 分钟， 共7个 循环。
     第二步 ： 扩增条件为 ： PCR 反应体积为 100μl, 包括以下成分 ： 10×PCR 缓冲液 5μl dNTPs 4μl MT-F（20μM) 1μl HC-R（20μM) 1μl 上步 PCR 反应产物 50μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl ddH2O 38.5μl PCR 反应条件为 ： 94℃ 4 分钟 ； 然后进入以下循环 94℃ 1 分钟， 55℃ 2 分钟 72℃ 2分钟， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 5 分钟。
     经过重叠 PCR 扩增得到了 814bp 的品系特异性序列和构建特异序列的重组片段 （Seq ID No:10） 。
     4、 重组 DNA 片段及玉米内标准基因 zSSIIb 的特异性片段克隆进入 pMD18-T 载体 首先用限制性内切酶 Bam H I 和 Hin d III 将上述得到的重组 DNA 片段 （Seq ID No:10） 和 pMD18-T 载体分别进行双酶切。然后用 T4 连接酶将二者连接。连接产物转化 DH5α 细 胞， 并在含氨苄青霉素的 LB 固体平板上培养， 筛选阳性克隆 ； 使用 Axygen 质粒抽提试剂盒 抽提获得含重组 DNA 片段的 pMD18-T 重组质粒。
     接着用限制性内切酶 Bam H I 和 Eco R Ⅰ将 PCR 特异性扩增的玉米内标准基因 zSSIIb 的 DNA 片段 （Seq ID No: 11） 和含有重组 DNA 片段的 pMD18-T 重组质粒分别进行双 酶切。 然后用 T4 连接酶将二者连接。 连接产物转化 DH5α 细胞， 并在含氨苄青霉素的 LB 固体 平板上培养， 筛选阳性克隆 ； 使用 Axygen 质粒抽提试剂盒抽提获得将转基因玉米 Mon810 的 品系特异性序列、 构建特异序列以及玉米内标准基因 zSSIIb 的特异性序列融合在 pMD18-T 上的标准质粒分子 pMHZ， 其序列如 Seq ID No:12 所示。 上述所述的酶切及连接等各种生物 技术， 均采用现有地相应技术。
     本发明构建的标准质粒分子 pMHZ 的简要图谱如附图 1 所示。图中 pMD-18T 表示 构建标准质粒分子的载体 ； Eco R I 表示该位点含有限制性内切酶 Eco RI 的酶切位点 ； Bam H I 表示该位点含有限制性内切酶Bam H Ⅰ的酶切位点 ； Hin d III 表示该位点含有限制性内切 酶 Hin d III 的酶切位点， “zSSIIb” 表示玉米内源标准基因 zSSIIb 的一段特异性序列 ； “品 系特异性序列” 表示转基因玉米 Mon810 外源插入载体与玉米基因组邻接区的一段 DNA 序 列； “构建特异性序列” 表示外源插入载体的 HSP70 和 cryIA（b） 两个元件的连接区的 DNA 序列。
     实施例 2 ： 构建的质粒标准分子在实际检测中的应用 一、 实验材料 转基因玉米 Mon810。
     常规玉米品种。
     其他遗传改良植物 ： 大豆 GTS 40-3-2、 圣棉 1 号、 玉米 BT11、 玉米 Mon863、 水稻 SK-2。
     二、 实验方法与过程 1、 基因组 DNA 提取与检测 1） 植物基因组 DNA 提取 a、 取适量玉米样品， 加入研钵中， 在液氮存在下研磨成粉末， 称取约 200mg 磨碎的样品 转入 2ml 离心管中 ； b、 加 入 1mL 65 ℃ 预 热 的 提 取 液 （20mM EDTA,2% CTAB, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4mol/L NaCl, 1% PVP） ， 轻轻混匀后， 65℃水浴保温 30min， 期间间或振荡混匀 ； c、 在管中加入等体积酚 / 氯仿溶液 (24:1)， 上下颠倒充分混匀， 常温静置抽提 10min ； d、 12000rpm 离心 10min， 吸取上清液到一新离心管中 ； e、 加入两倍上清液体积的 -20℃预冷的乙醇， 混匀， -20℃放置 30 分钟后， 12000rpm 离 心 10 分钟， 去上清液， 保留沉淀 ；f、 用 500μl 70% 的乙醇溶液清洗沉淀两次 ； 沉淀于室温下晾干， 后溶于 100μl 无菌 ddH2O。
     2） 质粒基因组 DNA 提取 a、 将 37℃过夜的 1-2ml 菌培养物于 6000rpm 离心 1 分钟， 彻底弃上清液 ； b、 加入菌液 250μl 含有 RNase A 的 Buffer A1 溶液， 将菌体重新充分悬浮细胞， ； c、 加入 250μl Buffer B1， 轻轻地反转 10 次以混合混匀， 然后静止 5min 至溶液粘稠而 澄清 ； d、 加入 350μl Buffer N1， 立即上下颠倒数次， 使之充分混匀 ； e、 室温 13000rpm 离心 10 分钟 , 将上清转移到套放于 2ml 收集管内的 DNA 吸附柱中， 于室温 13000rpm 离心１min ； f、 取出 DNA 吸附柱， 倒掉收集管中废液， 将 DNA 吸附柱重新放回收集管中， 加入 500μl Buffer KB, ， 于室温 13000rpm 离心１min ； 倒掉收集管中废液， 将 DNA 吸附柱重新放回收集 管中 ； g、 向 DNA 吸附柱中加入 500μl DNA Wash Buffer， 室温 13000rpm 离心１min， ； 倒掉收 集管中废液， 将 DNA 吸附柱重新放回收集管中 ; h、 打开管盖室温放置 5 分钟使残余的乙醇挥发， 后在 DNA 吸附柱膜中央加入 50μl Elution Buffer， 室温放置 2 分钟 ； i、 将 DNA 吸附柱放入干净 1.5ml 离心管中， ； k、 于室温 13000rpm 离心 1 分钟洗脱膜上的 DNA。
     3） DNA 检测 取 5μl 提取的 DNA 样品， 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测， 根据其亮度和扩散程度判断 DNA 的质量。
     利用微量核酸和蛋白分析仪测定所提 DNA 的浓度与纯度。
     2、 转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 引物的特异性分析 优化确定转基因玉米 Mon810 品系特异性 PCR 检测体系及反应条件， 并分别以其他遗传 改良植物为检测模板定性扩增转基因玉米 Mon810 品系特异性的目的片段， 确定针对转基 因玉米 Mon810 设计的定量 PCR 引物特异性。
     3、 标准质粒分子 pMHZ 用于定量 PCR 检测的检测极限 （LOD） 和定量极限 （LOQ） 优 化 确 定 转 基 因 玉 米 Mon810 品 系 特 异 性 定 量 PCR 检 测 体 系 及 反 应 条 件， 分别以 9 8 不 同 浓 度 的 标 准 质 粒 分 子 pMHZ 基 因 组 DNA 样 品 （如 2×10 copics/μl、 2×10 copics/ 7 6 5 4 μl、 2×10 copics/ μ l 、 2×10 copics/ μ l 、 2×10 copics/ μ l 、 2×10 copics/ μ l 、 3 2 1 0 2×10 copics/μl、 2×10 copics/μl、 2×10 copics/μl 和 2×10 copics/μl）作为标准 品测试建立的定量 PCR 检测方法的 LOD 和 LOQ。每个反应重复三次， 根据定量 PCR 扩增的标 准曲线与扩增荧光信号间的线性关系， 确定利用构建的标准质粒分子 pMHZ 代替阳性标准 物质时， 转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 检测方法的 LOD 和 LOQ。
     4、 标准质粒分子 pMHZ 定量 PCR 检测体系的重复性和重演性 优化确定转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 检测体系反应条件， 分别以不同浓度 6 5 标准质粒分子 pMHZ 基因组 DNA 样品 （2×10 copics/μl、 2×10 copics/μl、 2×104copics/μl、 2×103copics/μl、 2×102copics/μl 和 2×101copics/μl）进行重复性和复现性测 试， 每个反应重复三次。根据定量 PCR 扩增的标准曲线， 确定根据标准质粒分子 pMHZ 建立 的转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 反应的可重复性和重演性。
     5、 标准质粒分子 pMHZ 定量 PCR 检测校正系数测定 在利用标准质粒分子 pMHZ 进行定量分析时， 必须考虑标准质粒分子 pMHZ DNA 和玉米 基因组 DNA 在 PCR 反应中的效率差异， 这一差异可以通过校正系数 （Calibration Factor， Cf） 进行校正。Cf 值的测定方法是用标准质粒分子 pMHZ 建立定量 PCR 检测体系， 对纯合的 转基因玉米 Mon810 标准标准阳性材料进行定量分析， 通过比较定量分析的结果计算标准 质粒分子 pMHZ 的校正 Cf。Cf 值可通过公式 1 计算得到。在获得 Cf 值后， 通过公式 2 可以 分析获得待测遗传改良样品中遗传改良成分的含量。
     公式 1 ： Cf ＝纯合的遗传改良植物外源检测目的基因拷贝数 / 纯合的遗传改良植 物内源基因拷贝数 公式 2 ： 遗传改良成分含量 % ＝ （样品外源检测目的基因拷贝数 ×100） /（样品内源基 因拷贝数 ×Cf） 6、 应用标准质粒分子对实际转基因玉米 Mon810 样品的定量分析 根据测定的标准质粒分子 pMHZ 的校正系数和绘制的转基因玉米 Mon810 品系特异性定 量 PCR 标准曲线， 分别对 4 个转基因玉米 Mon810 混合样品 （遗传改良成分含量分别为 0.5%、 1.0%、 2.0% 和 5.0%） 进行分析。 三、 实验结果 1、 转基因玉米 Mon810 品系特异性 PCR 检测体系及反应条件 经过优化， 转基因玉米 Mon810 的品系特异性 PCR 检测体系和 PCR 扩增条件分别见表 2 和表 3。
     表 2. 转基因玉米 Mon810 的品系特异性 PCR 检测体系反应试剂 10×PCR 缓冲液 dNTPs 上游引物 下游引物 Taq 酶 DNA 模板 ddH2O 体积 （μl） 5 4 1 1 0.5 1 补足 50μl 终浓度 1×（50mMKCl,10mMTris-HCl,pH8.3,1.5mMMgCl2） 200μM 400μM 400μM 2.5 单位 / 反应 　表 3.转基因玉米 Mon810 的品系特异性定性 PCR 扩增条件2、 转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 引物的特异性分析 根据表 4 中的引物序列， 对转基因玉米 Mon810 及其它遗传改良作物如 GTS 40-3-2 大 豆、 BT11 玉米、 Mon863 玉米等的基因组样品进行定性 PCR 扩增。结果表明， 只有在转基因玉 米 Mon810 中， 扩增得到了大小为 173bp 的目的片段条带， 而在其它遗传改良作物中没有检 测到该条带。因此， 本发明设计的 Mon810 玉米品系的定量 PCR 引物具有高度特异性。
     表 4. 转基因玉米 Mon810 的品系特异性定量 PCR 引物及探针序列3. 转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 检测体系的优化和建立 根据定量 PCR 反应体系的优化方法， 寻找最适宜的转基因玉米 Mon810 的品系特异性定 量 PCR 引物和探针的浓度， 保证定量 PCR 的反应效率达到 90% 以上。经过优化， 当引物和探 针的浓度为 400nM 和 300nM 时， PCR 扩增曲线的效率最高， 荧光信号最强。因此该浓度用于 建立转基因玉米的定量 PCR 反应体系， 其它成分量详见表 5， PCR 扩增条件见表 6。
     表 5. 转基因玉米 Mon810 的品系特异性定量 PCR 检测体系13CN 102492777 A说反应试剂 2×PremixExTaq 上游引物 下游引物 探针 DNA 模板 ddH2O明书体积 （μl） 12.5 1 1 1 1 补足 25μl11/12 页表 6. 转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 检测扩增条件4、 标准质粒分子 pMHZ 进行定量 PCR 检测的检测极限 （LOD） 和定量极限 （LOQ） 利用优化好的转基因玉米 Mon810 特异性定量 PCR 反应体系， 分别以不同浓度的标 9 8 准 质 粒 分 子 pMHZ 基 因 组 样 品 （如 5×10 copics/μl、 5×10 copics/μl、 5×107copics/ μl、 5×10 6 copics/ μ l 、 5×10 5 copics/ μ l 、 5×10 4 copics/ μ l 、 5×10 3 copics/ μ l 、 5×102copics/μl、 5×101copics/μl 和 5×100copics/μl） 作为标准样品测试本发明建立 的定量 PCR 检测体系的 LOD 和 LOQ。经过 3 次重复实验确定该体系的 LOD 为 5 个拷贝， LOQ 为 50 个拷贝。说明构建的 pMHZ 标准质粒分子可以代替转基因玉米 Mon810 阳性标准品定 量检测转基因玉米 Mon810 及其加工产品遗传改良成分含量。
     以 浓 度 为 5×10 9copics/ μ l 、 5×10 8copics/ μ l 、 5×10 7copics/ μ l 、 5×10 6 copics/ μ l 、 5×10 5 copics/ μ l 、 5×10 4 copics/ μ l 、 5×10 3 copics/ μ l 、 5×102copics/μl、 5×101copics/μl 和 5×100copics/μl 的 pMHZ 玉米标准质粒分子基因 组 DNA 样品为标准品绘制转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 标准曲线。根据定量标 准曲线及该体系的 LOD 和 LOQ 结果可以认为， 本发明通过构建的标准质粒分子建立的转基 因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 检测系统具有很高的准确性和灵敏度， 完全可以用于转 基因玉米 Mon810 及其加工产品的实际检测。 5、 利用标准质粒分子 pMHZ 建立定量 PCR 检测体系的重复性和重演性测定 在优化的转基因玉米特异性定量 PCR 反应条件下 （表 2 和表 3） ， 分别以不同浓度标 9 8 准质粒分子 pMHZ 基因组 DNA 样品 （5×10 copics/μl、 5×10 copics/μl、 5×107copics/ μl、 5×10 6 copics/ μ l 、 5×10 5 copics/ μ l 、 5×10 4 copics/ μ l 、 5×10 3 copics/ μ l 、 5×102copics/μl 和 5×101copics/μl） 进行重复性和可复现性的测试， 3 个平行反应间和 3 次不同重复实验间获得的 Ct 值标准偏差基本上都小于 0.2， 说明根据构建的 pMHZ 标准质 粒分子建立的转基因玉米 Mon810 品系特异性定量 PCR 反应的充分性和重演性好， 可用于实 际转基因玉米 Mon810 样品的定量分析。
     6、 利用标准质粒分子 pMHZ 建立定量 PCR 检测体系校正系数确定 利用玉米标准质粒分子 pMHZ 建立代替转基因玉米 Mon810 阳性标准品用于定量 PCR
     检测时， 通过标准质粒分子建立了定量 PCR 检测方法， 对纯合的转基因玉米 Mon810 标准阳 性材料进行定量分析， 通过比较定量分析的结果计算标准质粒分子 pMHZ 的校正系数， 为 1.22， 见表 7。
     表 7. 标准质粒分子 pMHZ 用于定量 PCR 分析的校正系数测定7、 应用 pMHZ 标准质粒分子对实际转基因玉米 Mon810 样品的定量分析 根据测定的标准质粒分子 pMHZ 的校正系数和绘制的转基因玉米 Mon810 品系特异性定 量 PCR 标准曲线， 分别对 4 个转基因玉米 Mon810 混合样品 （遗传改良成分含量分别为 0.5%、 1.0%、 2.0% 和 5.0%） 进行了分析， 定量分析结果显示 4 个转基因玉米 Mon810 混合样品的遗 传改良成分含量分别为 0.513%、 1.115%、 2.046% 和 5.021%， 与真实值的偏差分别为 2.6%、 11.5%、 2.3% 和 4.2%， 定量结果的标准偏差 (SD) 小于 0.2， 相对标准偏差小于 16%（具体数 据见表 8） 。因此， 利用标准质粒分子 pMHZ 对实际样品分析的结果比较准确， 检测结果的偏 差在 ISO 转基因食品检测标准允许的 0-0.25 范围内， 表明本发明构建的转基因玉米 Mon810 标准质粒分子 pMHZ 完全可以代替该品系的阳性标准品， 适用于转基因玉米 Mon810 样品的 品系特异性定量 PCR 分析和检测。
     表 8. 转基因玉米 Mon810 样品的定量分析结果