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1、(10)申请公布号 CN 102492683 A (43)申请公布日 2012.06.13 CN 102492683 A *CN102492683A* (21)申请号 201110390880.4 (22)申请日 2011.12.01 C12N 11/00(2006.01) C12N 9/88(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 南宁奕德环境科技有限公司 地址 530007 广西壮族自治区南宁市总部路 3号中国-东盟科技企业总部基地二期 9 号厂房 517 号 (72)发明人 林日辉 梁跃 黄文勤 (54) 发明名称 一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法 (5。
2、7) 摘要 本发明提供了一种交联酶聚集体法 (CLEAs) 交联固定草酸脱羧酶的方法， 属于生物化工技术 领域。本发明包括 ： 重组草酸脱羧酶的诱导表达， 草酸脱羧酶的分离纯化和交联草酸脱羧酶聚集 体的制备三部分。本发明的特点在于 ： 用乙醇、 丙酮或硫酸铵对粗酶液中的草酸脱羧酶进行沉 淀分离， 使用乙醇制备草酸脱羧酶聚集体， 使用 0.01 0.15的戊二醛在添加 BSA0.1mg/L 1.5mg/L、 pH3 9、 4条件下交联反应 0.5 3.5h， 制备交联草酸脱羧酶聚集体， 交联固定化酶 的酶活力回收达 90以上。本发明实验操作简 单， 成本低廉， 获得的交联草酸脱羧酶聚集体稳定 性。
3、比游离草酸脱羧酶明显提高， 可应用于开发针 对草酸盐结石病的酶制剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法， 包括 ： 重组草酸脱羧酶的诱导表达， 草酸 脱羧酶的分离纯化， 制备交联草酸脱羧酶聚集体的步骤 ； 其特征在于 ： 使用乙醇、 丙酮或硫 酸铵对粗酶液中的草酸脱羧酶进行沉淀分离， 使用乙醇制备草酸脱羧酶聚集体悬浮液， 使 用交联酶聚集体方法 (CLEAs) 对草酸脱羧酶聚集体进行交联固。
4、定化。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 使用乙醇、 丙酮或硫酸铵对粗酶液中的草 酸脱羧酶进行沉淀分离， 乙醇浓度为 10 50、 丙酮浓度为 10 50， 硫酸铵浓度为 20 80。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 使用 10 50乙醇制备草酸脱羧酶聚集 体悬浮液。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 交联固定化反应条件为 ： 使用戊二醛浓度 0.01 0.15， pH3 9， 添加 BSA 浓度 0.1mg/L 1.5mg/L， 反应温度 4， 交联反应时 间 0.5 3.5h。 权 利 要 求 书 CN 102492683 A 2 1。
5、/5 页 3 一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物化工领域， 具体的提供了一种交联草酸脱羧酶聚集体 (oxdc-CLEAs) 的制备方法。 背景技术 0002 草酸 (HOOC-COOH) 以草酸盐的形式广泛的分布在植物、 微生物和人在内的生物体 内。人体内没有降解草酸盐的相关酶， 人们在食用某些高草酸含量的食物如菠菜， 苋菜， 草 莓， 橘子， 李子， 花生酱， 高粱和茶叶等会容易造成草酸盐在人体内积累， 从而引发如尿结 石、 肾结石、 高草酸尿、 低血钙症等多种病理状态。泌尿性系统结石病严重影响着人类的健 康， 根据地理环境的不同其发病率在 3 15， 而。
6、且还呈上升到趋势， 结石病治疗后易复 发， 治愈后复发率高达 60 80 ( 董婷婷等， 利用乳酸菌降解草酸预防结石的研究进 展， 中国微生态学杂志， 2011， 23(3) ： 266)。对部分病人的结石成分进行分析， 发现难溶的 草酸钙高达 80 (Fredric L.Coe 等， Kidney stone disease， The Journal of Clinical Investigation， 2005， 115(10) ： 2598-2608)， 可见草酸盐是导致结石症的重要原因。 目前对 高草酸盐水平引起结石症的治疗方法都不是非常理想， 主要通过限制草酸的摄入量来预防 结石， 。
7、而且许多原发性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植， 这大大增加了患者的 痛苦和经济压力， 因此需要寻求一种安全的从体内去除草酸盐的方法。通过服用某种酶制 剂降解摄入体内的草酸盐， 是缓解泌尿性系统草酸盐结石病症， 降低患者痛苦的有效方法。 0003 草酸脱羧酶 (EC 4.1.1.2) 催化转化草酸为甲酸和 CO2， 是生物体内催化降解草酸 及草酸盐的主要催化酶之一， 对底物草酸具有较强的专一性。草酸脱羧酶主要存在于木材 腐败真菌中， 如漆斑菌 (Myrothecium Verrucari)、 金针菇 (Flammulina velutipes)、 黑曲 霉 (Aspergillus ni。
8、ger)、 双孢蘑菇 (Agaricus bisporus) 等， 细菌中枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 的草酸脱羧酶研究报道较多。草酸脱羧酶在医疗， 食品， 工业生产和生物监 测等领域都有非常大的应用潜力 ( 曹茂新等， 草酸脱羧酶及其应用， 中国生物工程杂志， 2005( 增 )170-175)。针对草酸盐结晶引起的结石症， 目前已有一些使用草酸脱羧酶进行 预防与治疗的报道， 其中较有实用价值的是对草酸脱羧酶纯品进行结晶交联固定化， 制备 交联草酸脱羧酶结晶体制剂 (oxdc-CLECs)( 结晶化的草酸脱羧酶和使用方法， 中国专利 公开号 ： CN 101583375A。
9、)， 但 oxdc-CLECs 的制备必须首先经过酶蛋白的结晶操作， 所需的 酶纯化程度和结晶条件都很高， 操作困难， 费用较高。2000 年荷兰 Delft 大学的 Sheldon 小组提出了交联酶聚集体 (CLEAs) 的制备方法 (Linqiu Cao 等， Cross-Linked Enzyme Aggregates ： A Simple and Effective Method for the Immobilization of Penicillin Acylase， Org.Lett.， 2000， 2(10) ： 1361-1364)， 该方法经过聚集和交联两个过程。其中， 酶 。
10、聚集过程是非共价的结合， 没有造成酶三级结构的破坏， 再通过双功能试剂的交联制备固 定化酶聚集体， 使其保持有效结构和催化活性。此外， 酶聚集体的形成的过程中还可以去 除粗酶中大部分杂蛋白， 实现酶的初步纯化， 因此 CLEAs 实质上可将酶的纯化与固定化合 并为一个单元操作。(Burcu Selin Aytar 等， Preparation of cross-linked tyrosinase 说 明 书 CN 102492683 A 3 2/5 页 4 aggregates， Proeess Bioehemistry， 2008， 43 ： 125-131)。 与交联酶结晶体(CLECs)。
11、的制备 方法相比， 交联酶聚集体 (CLEAs) 方法具有对酶的纯化度要求不高， 操作简单， 成本低廉， 设备简单， 单位体积活性大， 固定化酶空间效率高等优点。 发明内容 0004 本发明的目的是针对目前制备交联草酸脱羧酶结晶体酶制剂存在的不足， 提供了 一种交联草酸脱羧酶聚集体 (oxdc-CLEAs) 的制备方法。该方法用乙醇、 丙酮或硫酸铵对草 酸脱羧酶进行沉淀分离， 并使用交联试剂制备交联草酸脱羧酶聚集体， 酶活力回收在 90 以上。本发明方法使用设备简单， 操作简单， 成本低廉。对比游离草酸脱羧酶， oxdc-CLEAs 的耐酸性、 耐热性、 耐胰蛋白酶的降解能力均有较大提高， 可。
12、用于制备预防和治疗草酸盐洁 净引起结石病的酶制剂。 0005 本发明的技术方案 ： 一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法。包括重组草酸脱羧 酶的诱导表达， 草酸脱羧酶的沉淀分离， 交联草酸脱羧酶聚集体的制备三部分。 工艺步骤如 下 ： 0006 (1) 重组草酸脱羧酶的诱导表达 0007 将产草酸脱羧酶基因工程菌 E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK 进行发酵培养。当 细菌生长至OD600为0.8时， 加入MnCl2及IPTG诱导草酸脱羧酶表达， 离心收集菌体， 磷酸盐 缓冲液重悬菌体后进行超声破碎细菌， 离心收集上清为粗酶液。 0008 (2) 草酸脱羧酶的沉淀分离 000。
13、9 向草酸脱羧酶粗酶液缓慢加入适当浓度的预冷硫酸铵、 乙醇或丙酮， 置于冰箱 过夜， 离心收集沉淀， 用磷酸盐缓冲液重新溶解， 获得纯化草酸脱羧酶。纯化酶液利用 SDS-PAGE 进行鉴定分析。 0010 (3) 交联草酸脱羧酶聚集体的制备 0011 取分离纯化酶液加入 10 50乙醇于 4冰箱沉淀过夜， 得到草酸脱羧酶聚集 体悬浮液。添加 BSA0.1mg/L 1.50mg/L， 加入交联剂戊二醛溶液， 在 pH3 9， 4条件下 于交联反应 0.5 3.5h。离心弃上清并用磷酸盐缓冲液反复清洗沉淀， 直至清洗液检测不 出任何活力即得到交联草酸脱羧酶聚集体， 重悬于磷酸盐缓冲液 4冰箱保存。。
14、 0012 草酸脱羧酶的活力检测 ： 反应液含 76mmol/L 草酸钾， 50mmol/L pH 4.0 柠檬酸缓 冲液， 37水浴2min， 加入草酸脱羧酶液开始反应， 10min后加入等体积的0.2mol/L磷酸氢 二钾使体系pH上升至中性终止反应。 终止反应液体系加入辅酶NAD+以及甲酸脱氢酶， 分光 光度法 340nm 检测分析甲酸脱羧酶催化反应速度， 计算甲酸的生成量。酶活力单位定义为 ： 每分钟催化转化草酸产生 1mol 甲酸的酶量。 0013 交联草酸脱羧酶聚集体活性测定方法同游离草酸脱羧酶酶活力测定方法， 反应在 120rpm 震荡条件下进行。 0014 交联固定化酶活回收率。
15、 ： 回收的交联固定化酶的酶活力与用于交联固定化的酶的 总活力之比。 0015 蛋白浓度采用考马斯亮蓝法测定， 以牛血清白蛋白作为标准。 0016 本发明的优点在于 ： 0017 采用硫酸铵或有机溶剂沉淀法沉淀分离草酸脱羧酶， 分离效率高， 操作简单， 成 说 明 书 CN 102492683 A 4 3/5 页 5 本低， 获得草酸脱羧酶纯度较高。 0018 利用交联酶聚集体法 (CLEAs) 交联固定草酸脱羧酶， 把酶的纯化和固定化合并 成一个单元操作， 不需要制备高纯度酶交联用酶， 操作简单， 节约成本。 0019 交联酶聚集体法制备得到交联草酸脱羧酶聚集体， 耐酸性， 耐热性， 耐胰蛋。
16、白酶 降解能力均有提高， 可作为酶制剂应用于防治草酸盐结晶导致的结石病。 附图说明 0020 图1不同沉淀剂沉淀分级草酸脱羧酶的SDS-PAGE， 图中泳道1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 分别为粗酶液、 25乙醇、 30乙醇、 25丙酮、 30丙酮、 蛋白质 marker、 30硫酸铵、 40硫酸铵、 60硫酸铵、 粗酶液。 0021 图 2 游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的最适 pH 0022 图 3 游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的最适反应温度 0023 图 4 游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的耐热性 0024 图 5 65游离草酸脱羧酶与交联。
17、草酸脱羧酶聚集体的热稳定性 0025 图 6 游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体对胰蛋白酶的耐受性 具体实施方式 0026 为了更好的理解本发明， 下面结合实施例子对本发明做进一步的描述。 0027 实例 1 ： 0028 (1) 重组草酸脱羧酶的诱导表达 0029 将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK接于含氨苄青霉素(0.1mg/ml)的 LB 培养基中 37， 250r/min 进行培养。细菌生长至 OD600为 0.8 时， 加人 6mmol/L 的 MnCl2， 0.4mmol/L的IPTG， 30诱导表达8h， 离心收集细菌沉淀， 按每克湿重菌体加1。
18、0mL磷酸盐缓 冲液 (50mmol/L， pH8.0) 重悬菌体， 超声破碎细菌后， 离心收集上清为粗酶液。 0030 (2) 草酸脱羧酶的沉淀分离 0031 在 10ml 的试管中加入 5ml 粗酶液， 逐滴滴加预冷无水乙醇至乙醇浓度为 10 50， 置于 4冰箱过夜， 离心收集沉淀， 用 50mmol/L pH8.0 磷酸盐缓冲液重溶， 获得纯化 草酸脱羧酶。 0032 酶活力检测及蛋白浓度分析表明， 乙醇沉淀可除去粗酶液中 66.2的蛋白， 酶活 回收达 91.2， 纯化倍数为 2.7 倍。 0033 (3) 交联草酸脱羧酶聚集体的制备 0034 - 在 10ml 离心管加入 5ml 。
19、纯化酶液， 逐滴滴加无水乙醇至乙醇浓度为 20 50， 置于 4冰箱过夜， 添加 BSA 至 0.25mg/L 1.25mg/L， 逐滴滴加戊二醛溶液至 0.01 0.15， 在 pH3 9， 4条件下交联反应 0.5 3.5h， 离心弃上清， 用 50mmol/L pH8.0 磷酸盐缓冲液洗涤至上清无酶活性， 即得交联草酸脱羧酶聚集体。 0035 测定该交联酶聚集体的活力为 780U/g， 酶活力回收为 65.7。 0036 实例 2 ： 0037 (1) 重组草酸脱羧酶的诱导表达同实例 1 0038 (2) 草酸脱羧酶的沉淀分离 说 明 书 CN 102492683 A 5 4/5 页 6。
20、 0039 在 10ml 的试管中加入 5ml 粗酶液， 逐滴滴加预冷丙酮至浓度 10 50， 置于 4冰箱过夜， 离心收集沉淀， 用50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液重溶， 获得纯化草酸脱羧酶。 0040 酶活力检测及蛋白浓度分析表明， 丙酮沉淀可除去粗酶液中 73.6的蛋白， 酶活 回收达 79.2， 纯化倍数为 2.84 倍。 0041 (3) 交联草酸脱羧酶聚集体的制备 0042 在 10ml 离心管加入 5ml 纯化酶液， 逐滴滴加无水乙醇至乙醇浓度为 20 50， 置于 4冰箱过夜， 添加 BSA 至 0.1mg/L 1.0mg/L， 逐滴滴加戊二醛溶液至 0.05 0.12。
21、， 在 pH3 9， 4条件下交联反应 0.5 3.5h， 离心弃上清， 用 50mmol/L pH8.0 磷酸 盐缓冲液洗涤至上清无酶活性， 即得交联草酸脱羧酶聚集体。 0043 测定该交联酶聚集体的活力为 650U/g， 酶活力回收为 52.8。 0044 实例 3 ： 0045 (1) 重组草酸脱羧酶的诱导表达同实例 1 0046 (2) 草酸脱羧酶的沉淀分离 0047 在 10ml 的试管中加入 5ml 粗酶液， 逐滴滴加预冷饱和硫酸铵至浓度 20 80， 置于 4冰箱过夜， 离心收集沉淀， 用 50mmol/L pH8.0 磷酸盐缓冲液重溶， 获得去纯化酸脱 羧酶。 0048 (3)。
22、 交联草酸脱羧酶聚集体的制备 0049 在 10ml 离心管加入 5ml 纯化酶液， 逐滴滴加无水乙醇至乙醇浓度为 10 50， 置于 4冰箱过夜， 添加 BSA 至 1.0mg/L 1.5mg/L， 逐滴滴加戊二醛溶液至 0.01 0.08， 在 pH3 9， 4条件下交联反应 0.5 3.5h， 离心弃上清， 用 50mmol/L pH8.0 磷酸 盐缓冲液洗涤至上清无酶活性， 即得交联草酸脱羧酶聚集体。 0050 实例 4 ： 0051 (1) 重组草酸脱羧酶的诱导表达同实例 1 0052 (2) 草酸脱羧酶的沉淀分离同实例 1 0053 (3) 交联草酸脱羧酶聚集体的制备同实例 1 0。
23、054 (4) 游离酶与交联酶聚集体的性质比较 0055 最适 pH 0056 在pH2.5至pH7.0的不同柠檬酸缓冲液反应体系中分别测定游离酶与交联酶聚集 体的酶活力， 以活性最高数据为 100酶活力， 计算相对酶活力。 0057 结果表明 ： 交联草酸脱羧酶聚集体的反应 pH 范围比草酸脱羧酶宽泛， 在 pH2.5 的 时候交联草酸脱羧酶聚集体还有 80的酶活力， 而游离草酸脱羧酶的酶活力不到 10， 说 明交联聚集后的酶对酸性环境耐受能力更强。 0058 最适反应温度 0059 反应柠檬酸缓冲液 pH4.0， 在不同温度下分别测定酶活力， 以活性最高数据为 100酶活力， 计算不同温度。
24、下的相对酶活力。 0060 结果表明 ： 游离草酸脱羧酶和交联草酸脱羧酶聚集体的最适反应温度均在 47 左右。 0061 耐热性 0062 游离酶与交联酶聚集体在不同温度下热处理 30min 后测酶活力， 观察处理后酶活 说 明 书 CN 102492683 A 6 5/5 页 7 力的变化。将游离酶和交联酶聚集体置于 65水浴， 每半小时取样检测残余酶活。 0063 结果表明 ： 游离草酸脱羧酶的变性失活温度低于 65， 交联草酸脱羧酶聚集体的 变性失活温度高于 70 ； 将游离草酸脱羧酶与交联酶聚集体分别置于 65水浴， 每隔半小 时测酶活力， 3.5h 内， 交联草酸脱羧酶聚集体酶活基本。
25、无损失， 游离草酸脱羧酶在 65下 逐渐发生变性失活， 半衰期 t1/2 为 2h。 0064 对胰蛋白酶的耐受性 0065 分别取4.5ml游离酶和交联酶聚集体， 加入2.5g/L的胰蛋白酶溶液0.5ml， 37水 浴， 定时取样检测剩余酶活力， 以原始活性数据为 100酶活力， 观察游离酶和交联酶聚集 体对抗胰蛋白酶消化的能力。 0066 结果表明 ： 交联草酸脱羧酶聚集体对胰蛋白酶消化的耐受能力显著高于游离草酸 脱羧酶， 其中， 使用胰蛋白酶处理 48h 后， 交联草酸脱羧酶残余酶活力仍大于 80， 而游离 草酸脱羧酶残余酶活力低于 50。通过制备交联酶聚集体， 可提高草酸脱羧酶抵抗胰蛋白 酶消化的能力， 适用于开发药用酶制剂。 说 明 书 CN 102492683 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102492683 A 8 2/3 页 9 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102492683 A 9 3/3 页 10 图 6 说 明 书 附 图 CN 102492683 A 10 。