一种报春苣苔PRIMULINATABACUMHANCE组织培养繁殖及野外栽培方法.pdf

一种报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，本发明以野外采集的报春苣苔植株叶片作为外植体，通过诱导培养步骤、丛芽繁殖步骤、生根培养步骤、移栽步骤和野外移栽步骤等培养阶段，调配和优选诱导、繁殖、生根、移栽等各培养阶段的培养基配方，使报春苣苔能够实现其有效繁殖的目的。结合生态恢复原理将试管苗在发现报春苣苔的当地种植，实现报春苣苔在原生地的种植成活和生态恢复。

权利要求书
1.  一种报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，其特征在于以野外采集的报春苣苔植株叶片作为外植体，按以下步骤进行培养繁殖和栽培：
(1)诱导培养步骤：将报春苣苔植株叶片外植体接插到诱导培养基培养，诱导报春苣苔叶片外植体体细胞胚胎发生或/和不定芽的形成，在20～30℃下，于黑暗培养或每天于1～20μmolm-2 s-1弱光照射12～14小时，培养50～70天，在外植体能够诱导形成体细胞胚或不定芽后，继续培养20-30天，所述的诱导培养基以MS基本培养基，附加钙220～440mg L-1，蔗糖20～30 g L-1，pH值6.5～7.5为基础，另配加有NAA 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.5～1.0mgL-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.2～1.0mg L-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.5～1.0mg L-1；
(2)丛芽繁殖步骤：将体细胞胚或不定芽转入到繁殖培养基上培养，条件为在20～30℃下，每天光照20～50μmol m-2 s-114小时，一个月至一个半月继代一次，所述的繁殖培养基以MS基本培养基，附加钙220～440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.5为基础，另配加有BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.1～0.5mg L-1；
(3)生根阶段：将丛芽分切转入到生根培养基上光照培养诱导生根，成为试管苗，条件为20～30℃，每天光照20～50μmol m-2 s-114小时，生根培养基以MS基本培养基，附加钙220～440mg L-1，蔗糖20g L-1，pH值6.5～7.5为基础，另配加有IBA 0.2～1.0mg L-1和/或0.2％活性碳，试管苗在该培养基上培养1个月后进行移栽；
(4)移栽阶段：将长根的试管苗移栽到移植到沙盆的基质中，放置于湿润、遮荫的环境下培养，沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝(1～2)∶(2～4)∶(1～2)的比例配置；
(5)野外移栽阶段：将经上述沙盆中壮苗后的试管苗种植于石灰岩洞口环境，与伴生种苔藓一同种植。

2.  根据权利要求1所述的报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，其特征在于所述的诱导培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.0为基础，另配加有NAA 0.5mg L-1+TDZ 1.0mg L-1，或BAP 0.5mg L-1+TDZ0.2mg L-1，或BAP 1.0mg L-1+NAA 0.5mg L-1。

3.  根据权利要求1所述的报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，其特征在于所述的繁殖培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.0为基础，另配加有BAP 1.0mg L-1+NAA 0.1mg L-1。

4.  根据权利要求1所述的报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，其特征在于所述的生根培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.0为基础，另配加有IBA 1.0mg L-1和/或0.2％活性碳。

5.  根据权利要求1所述的报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，其特征在于在移栽阶段，试管苗所移栽的沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝1∶2∶1的比例配置。

说明书一种报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法
技术领域
本发明涉及一种对珍稀濒危植物报春苣苔(Primulina tabacum Hance)的离体保存和繁育的生物技术，具体地说，涉及一种对报春苣苔(Primulina tabacum Hance)的组织培养繁殖及野外栽培方法。
背景技术
报春苣苔(Primulina tabacum Hance)为苦苣苔科多年生小型草本植物，自1881年美国人亨利在粤北连州连江流域的石壁上发现了报春苣苔这一珍稀植物后，它又神秘消失了120年。直到几年前，国内有关媒体报道了在连州又发现了报春苣苔这一国家第一批一级濒危保护植物。它的发现对研究岭南古气候、土壤和动植物演变无疑具有重大的学术价值。运用植物组织培养技术开展植物的保护和繁殖在很多植物种上已获得成功。根据不同类型的植物在离体培养所需要的培养条件及方法等方面存在很大的不同，而报春苣苔作为中国第一批重点一级保护的珍稀濒危保护植物，由于该物种生存环境要求特殊、地理分布狭小、种群数量很少。目前运用植物生物技术繁殖和栽培报春苣苔，保护和利用这种珍稀濒危植物，国内外均未见报道。
发明内容
为保护报春苣苔(Primulina tabacum Hance)这种珍稀濒危植物，申请人开展了该植物组织培养的研究工作，成功地诱导了体细胞胚胎发生和不定芽的形成，以此建立了有效的繁殖体系和植株再生体系，并结合恢复生态原理实现了报春苣苔在原生地的种植存活，从而提出了本发明。
本发明的目的是提出一种报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法。
本发明所提出的报春苣苔(Primulina tabacum Hance)组织培养繁殖及野外栽培方法，其技术方案如下：以野外采集的报春苣苔植株叶片作为外植体，按以下步骤进行培养繁殖和栽培：
(1)诱导培养步骤：将报春苣苔植株叶片外植体接插到诱导培养基培养，诱导报春苣苔叶片外植体体细胞胚胎发生或/和不定芽的形成，在20～30℃下，于黑暗培养或每天于1～20μmolm-2s-1弱光照射12～14小时，培养50～70天，在外植体能够诱导形成体细胞胚或不定芽后，继续培养20-30天，所述的诱导培养基以MS基本培养基，附加钙220～440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.5为基础，另配加有NAA 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.5～1.0mgL-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.2～1.0mg L-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.5～1.0mg L-1。其中NAA 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.5～1.0mg L-1可诱导体细胞胚胎发生；BAP0.5～1.0mg L-1+NAA 0.5～1.0mg L-1可诱导不定芽的形成；BAP 0.5～1.0mg L-1+TDZ0.2～1.0mg L-1则可同时诱导体细胞胚和不定芽的形成。平均每个外植体能够诱导80～90个左右的体细胞胚或不定芽。
(2)丛芽繁殖步骤：将体细胞胚或不定芽转入到繁殖培养基上培养，条件为在20～30℃下，每天光照20～50μmol m-2s-114小时，一个月至一个半月继代一次，繁殖频率可达5～8，所述的繁殖培养基以MS基本培养基，附加钙220～440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.5为基础，另配加有BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.1～0.5mg L-1；
(3)生根培养步骤：将丛芽分切转入到生根培养基上光照培养诱导生根，成为试管苗，条件为20～30℃，每天光照20～50μmol m-2s-114小时，生根培养基以MS基本培养基，附加钙220～440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.5为基础，另配加有IBA 0.2～1.0mgL-1或/和0.2％活性碳，试管苗在该培养基上培养1个月后进行移栽；
(4)移栽步骤：将长根的试管苗移栽到移植到沙盆的基质中，放置于湿润、遮荫的环境下培养，沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝(1～2)∶(2～4)∶(1～2)的比例配置；
(5)野外移栽步骤：将经上述沙盆中壮苗后的试管苗种植于石灰岩洞口环境，与伴生种苔藓一同种植。
在上述的诱导培养步骤中，所述的诱导培养基的优选配方为：以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.0为基础，另配加有NAA 0.5mg L-1+TDZ 1.0mg L-1，或BAP 0.5mg L-1+TDZ 0.2mg L-1，或BAP 1.0mg L-1+NAA 0.5mg L-1；。
在上述的丛芽繁殖步骤中，所述的繁殖培养基的优选配方为：以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.0为基础，另配加有BAP 1.0mg L-1+NAA 0.1mg L-1。
在上述的生根培养步骤中，所述的生根培养基的优先配方为：以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.0为基础，另配加有IBA 1.0mg L-1或/和0.2％活性碳。
在上述的移栽步骤中，试管苗所移栽的沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝1∶2∶1的比例配置为佳。
本发明通过提供一系列合适的配方和培养条件，包括从诱导、繁殖、生根、移栽等系列基本过程的配方，使报春苣苔能够实现其有效繁殖的目的。结合生态恢复原理将试管苗在发现报春苣苔的当地种植，实现报春苣苔在原生地的种植成活和生态恢复。
a)诱导培养阶段：通过调节生长调节剂配方，可有目的地诱导报春苣苔叶片外植体体细胞胚胎发生或不定芽的形成；
b)丛芽繁殖阶段：将体细胞胚或不定芽转入到繁殖培养基上能够建立丛芽繁殖体系，筛选最适培养基，以获得较高的增殖频率；
c)生根阶段：将丛芽分切转入到所筛选的最适生根培养基上光照培养诱导生根，试管苗在该培养基上培养1个月内均能够生根；
d)移栽阶段：将长根的试管苗移栽到室外，利用石灰石、蛭石以及沙石的基质并附加置于湿润、遮荫的环境下培养，产生适应报春苣苔喜欢高钙和高pH值的生长环境，保证了试管苗有较高的移栽成活率，其移栽成活率达到85～90％；
e)野外移栽试验：利用恢复生态学物种回归原理，再造恢复生境，提高成活率；通过该项目的运用，总成活率高达80％以上，能够使这一国家一级濒危植物得以保存和发展，利于石灰岩地区洞口的植被恢复，为今后更进一步利用该物种奠定良好的基础。
具体实施方式
实施例一
以从连州地下河景区采集的报春苣苔叶片作为外植体，进行报春苣苔(Primulina tabacumHance)组织培养繁殖及野外栽培，具体步骤如下：
(1)诱导培养步骤：将报春苣苔植株叶片外植体接插到诱导培养基培养，诱导报春苣苔叶片外植体体细胞胚胎发生和不定芽的形成，诱导培养基以MS基本培养基，附加钙440mgL-1，蔗糖30g L-1，pH值7.0为基础，另配加有BAP 0.5mg L-1+TDZ 0.2mg L-1，培养条件：20～30℃，每天于10μmol m-2s-1弱光照射14小时，培养60天，在外植体能够诱导形成体细胞胚和不定芽后，继续培养30天。平均每个外植体能够诱导80～90个左右的体细胞胚或不定芽。
(2)丛芽繁殖步骤：将体细胞胚或不定芽转入到繁殖培养基上培养，条件为在20～30℃下，每天光照30μmol m-2s-114小时，一个月继代一次，所述的繁殖培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖30g L-1，pH值6.5为基础，另配加有BAP 1.0mg L-1+NAA 0.1mgL-1；
(3)生根培养步骤：将丛芽分切转入到生根培养基上光照培养诱导生根，成为试管苗，条件为20～30℃，每天光照50μmol m-2s-114小时，生根培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20g L-1，pH值6.5为基础，另配加有IBA 1.0mg L-1和0.2％活性碳。试管苗在该培养基上培养1个月后进行移栽；
(4)移栽步骤：将长根的试管苗移栽到移植到沙盆的基质中，放置于湿润、遮荫的环境下培养，沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝1∶2∶1的比例配置；
(5)野外移栽步骤：将经上述沙盆中壮苗后的试管苗种植于石灰岩洞口环境，与伴生种苔藓一同种植。
实施例二
以从连州地下河景区采集的报春苣苔叶片作为外植体，进行报春苣苔(Primulina tabacumHance)组织培养繁殖及野外栽培，具体步骤如下：
(1)诱导培养步骤：将报春苣苔植株叶片外植体接插到诱导培养基培养，诱导报春苣苔叶片外植体体细胞胚胎发生，诱导培养基以MS基本培养基，附加钙400mg L-1，蔗糖30g L-1，pH值6.5为基础，另配加有NAA 0.5mg L-1+TDZ 1.0mg L-1，培养条件：20～30℃，每天于5μmol m-2s-1弱光照射14小时，培养60天，在外植体能够诱导形成体细胞胚后，继续培养30天。
(2)丛芽繁殖步骤：将体细胞胚转入到繁殖培养基上培养，条件为在20～30℃下，每天光照20μmol m-2s-114小时，一个月继代一次，所述的繁殖培养基以MS基本培养基，附加钙400mg L-1，蔗糖30g L-1，pH值7.0为基础，另配加有BAP 1.0mg L-1+NAA 0.1mg L-1；
(3)生根培养步骤：将丛芽分切转入到生根培养基上光照培养诱导生根，成为试管苗，条件为20～30℃，每天光照50μmol m-2s-114小时，生根培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖20g L-1，pH值7.0为基础，另配加有IBA 1.0mg L-1。试管苗在该培养基上培养1个月后进行移栽；
(4)移栽步骤：将长根的试管苗移栽到移植到沙盆的基质中，放置于湿润、遮荫的环境下培养，沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝1∶2∶1的比例配置；
(5)野外移栽步骤：将经上述沙盆中壮苗后的试管苗种植于石灰岩洞口环境，与伴生种苔藓一同种植。
实施例三
以从连州地下河景区采集的报春苣苔叶片作为外植体，进行报春苣苔(Primulina tabacumHance)组织培养繁殖及野外栽培，具体步骤如下：
(1)诱导培养步骤：将报春苣苔植株叶片外植体接插到诱导培养基培养，诱导培养基以MS基本培养基，附加钙300mg L-1，蔗糖30g L-1，pH值7.0为基础，另配加有BAP 1.0mgL-1+NAA0.5mg L-1，培养条件：20～30℃，每天于10μmol m-2s-1弱光照射14小时，诱导报春苣苔叶片外植体不定芽的形成，培养60天，在外植体能够诱导形成不定芽后，继续培养30天。
(2)丛芽繁殖步骤：将不定芽转入到繁殖培养基上培养，条件为在20～30℃下，每天光照30μmol m-2s-114小时，一个月继代一次，所述的繁殖培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖30g L-1，pH值7.0为基础，另配加有BAP 1.0mg L-1+NAA 0.1mg L-1；
(3)生根培养步骤：将丛芽分切转入到生根培养基上光照培养诱导生根，成为试管苗，条件为20～30℃，每天光照50μmol m-2s-114小时，生根培养基以MS基本培养基，附加钙440mg L-1，蔗糖30g L-1，pH值7.0为基础，另配加有0.2％活性碳。试管苗在该培养基上培养1个月后进行移栽；
(4)移栽步骤：将长根的试管苗移栽到移植到沙盆的基质中，放置于湿润、遮荫的环境下培养，沙盆中的基质按石灰石∶蛭石∶沙石＝1∶3∶1的比例配置；
(5)野外移栽步骤：将经上述沙盆中壮苗后的试管苗种植于石灰岩洞口环境，与伴生种苔藓一同种植。