用于向神经元细胞基因送递的方法 【技术领域】
本发明涉及一种向神经元细胞基因送递的方法。
背景技术
近来认为杆状病毒苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒(Autographacalifornica multiple nuclear polyhedrosis virus)作为哺乳动物细胞表达载体的应用是作为新一代基因治疗载体的具有很大前途的新兴策略(Ghosh等，2002；Kost和Condreay，2002)。杆状病毒在增殖和非增殖、休眠哺乳动物细胞表现广泛的向性，在脊椎动物细胞不复制和很少产生至不产生显微镜下可观察到的细胞毒性。已在神经系统研究了杆状病毒介导的基因转染。最初报道描述了由含有CMV启动子的杆状病毒载体的神经细胞的体外和体内的有效转染(Sarkis等，2000)。在人胚脑的原代细胞培养中，可以感染神经上皮、成神经细胞和神经胶质细胞。用成年裸鼠的体内研究表明在注射杆状病毒载体的脑中，转导主要是仅仅几个神经元的星形胶质细胞。在目的是检查脑中杆状病毒介导的基因表达的细胞型特异性的另一研究中(Lehtolainen等，2002)，确定脉络丛的立方形上皮细胞为大鼠脑中病毒的主要靶细胞，虽然在上皮细胞中检测到适度的基因表达，但是在包括神经元和星形胶质细胞的其它类型的脑细胞中发现非常有限的表达或不表达。
神经系统的主要功能细胞是神经元，这类细胞在接受、传导和传递信号中执行系统的基本任务。这些细胞的治疗保护是神经系统疾病的分子治疗的主要目标。实例包括保护帕金森病(Parkinson’s disease)中的多巴胺能黑质纹状体神经元(Duvoisin，1992)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)中的基底前脑胆碱能神经元(Gomez-Isla等，1996)和肌萎缩性侧索硬化中的脊柱运动神经元。我们以前已开发了一种带有强神经元特异性启动子CMV E/PDGF以驱动转基因表达的重组杆状病毒载体(在共同未决的美国申请号10/407,009中描述的CMVIE/PDGF)。注射到脑中后，该杆状病毒载体可以转导神经元并在注射部位附近的神经元中介导转基因表达。相对高水平的持续性转基因表达持续至少4周，比仅含有CMV启动子的杆状病毒载体持续3天长得多。
某些神经系统疾病中受影响的神经元的广泛的解剖学分布和其它神经系统疾病中相对达不到的神经元位置阻碍了这些疾病的有效的基因治疗。一些病毒载体通过利用轴突运输(axonal transport)的自然过程能克服这些问题。该过程始于胞外物质的内吞作用。在轴突的内吞作用的情况下，轴突末端用作吸收所述物质的进入口。然后吞入的物质在轴质中运输到细胞体。能以这种方式吸收并运输的病毒包括腺病毒(BilangBleuel等，1997；Hermens等，1997；Choi-Lundberg等，1998；Soudais等，2001；Peltekian等，2002)、腺伴随病毒(AAV，Kaspar等，2002)和疱疹病毒(HSV，Breakefield和DeLuca，1991；Jin等，1996)。腺病毒和HSV比杆状病毒引起更强的免疫和炎症反应。脑中单次脑内注射腺病毒或HSV引起剂量依赖性炎症反应，导致脱髓鞘(McMenamin等，1998；Lawrence等，1999)。能整合到靶细胞染色体的AAV载体的特征为不能持续地诱导免疫反应。然而，由于病毒载体的小插入大小和难于制备以某种方式阻碍了其作为基因送递载体的应用(Joose和Chirmule，2003)。
【发明内容】
在一个技术方案中，本发明提供了一种向对象中的神经元细胞送递杆状病毒载体的方法，所述方法包括：识别中枢神经系统中的靶神经元细胞，识别远离所述靶神经元细胞的中枢神经系统中的位点，以及向所述位点施用所述载体，其中，所述载体通过轴突运输送递到神经元细胞。
在另一技术方案中，本发明提供了一种用于治疗对象中神经系统疾病的方法，所述方法包括：识别受到所述病症影响的靶神经元细胞，识别远离靶神经细胞的中枢神经系统中的位点，以及向所述位点施用包括与启动子可操作连接的治疗基因的杆状病毒载体，其中，所述杆状病毒载体通过轴突运输送递到靶神经元细胞。
在又另一技术方案中，本发明提供了一种用于示踪神经元途径的方法，所述方法包括向对象的中枢神经系统中的位点施用采用的用于检测的杆状病毒并检测该病毒的运输途径。
结合附图，按照本发明特定实施方案的描述，本发明的其它技术方案和特征对本领域技术人员将变得清楚明了。
【附图说明】
图1为显示纹状体内注射后显示大鼠脑中Cy3标记的杆状病毒载体吸收和运输的纹状体、黑质和大脑皮质的共焦图像。对于纹状体和黑质的图像，比例尺表示50μm和对于大脑皮质，比例尺表示100μm；
图2为纹状体内注射后杆状病毒DNA的PCR分析图。泳道1，100bp梯；泳道2和泳道4，没有注射和用1x PBS模拟注射作为阴性对照；泳道3，纯化的病毒作为阳性对照；泳道5、6和7，分别从大脑皮质、黑质和纹状体收集的组织样品；
图3显示纹状体内注射仅具有CMV启动子或具有CMV增强子/PDGF(CMV E/PDGF)启动子的杆状病毒载体的萤光素酶报道基因活性的定量测定结果；
图4显示注射具有CMV E/PDGF的杆状病毒载体后纹状体中萤光素酶表达的共焦图像。将样品对显示神经元的神经元特异的核内蛋白(NeuN)和显示萤光素酶阳性细胞的萤光素酶(Luc)双重免疫染色；
图5描述纹状体内注射具有CMV E/PDGF的杆状病毒载体后远侧区中萤光素酶表达的共焦图像。A-C：将样品对显示转染细胞的荧光素酶和显示SN中多巴胺能神经元的酪氨酸羟化酶(TH)双重免疫染色；D-L：对萤光素酶蛋白和对神经元特异的核内蛋白(NeuN)双重免疫染色以显示大脑皮质中的转染的神经元；D-F，对大脑皮质的低倍放大图像；G-I，显示大脑皮质中转染的锥体神经元的高倍放大图像；J-L，显示区域中未转染的粒细胞的高倍放大。对于A-C，比例尺表示80μm；对于D-F，比例尺表示40μm；以及对于G-L，比例尺表示20μm；
图6和图7描述玻璃体内注射后Cy3标记的杆状病毒的吸收和运输的共焦图像。GCL，神经节细胞层(ganglion cell layer)；INL，内核层(inner nuclear layer)。
图8为玻璃体内注射后杆状病毒DNA的PCR分析图。泳道1，100bp梯；泳道2和泳道4，没有注射和用1x PBS模拟注射作为阴性对照；泳道3，纯化的病毒作为阳性对照；泳道5、6、7、8和9，分别从视网膜、视神经、外侧膝状体核、上丘和初级视皮层收集的组织样品；
图9显示玻璃体内注射后萤光素酶报道基因活性的定量测定结果；
图10描述玻璃体内注射后显示神经元中萤光素酶表达的共焦图像。用显示转染的细胞的针对萤光素酶的抗体和显示神经元的针对神经元特异核内蛋白(NeuN)进行双重免疫染色。对于A-F，比例尺表示40μm，对于G-I，表示80μm；I：视网膜；II：外侧膝状体；III：上丘；IV：初级视皮层。
【具体实施方式】
本发明人已首次证明重组杆状病毒载体可以通过轴突运输迁移到神经元细胞体，引起投射神经元中转基因表达。在将Cy3-标记的杆状病毒载体立体定位注射到大鼠纹状体后，沿着皮质纹状体途径和黑质纹状体途径观察到杆状病毒载体的逆向轴突运输。玻璃体内注射后，在从视网膜、视神经、外侧膝状体、上丘至初级视皮层的视觉系统的确定连接中观察到病毒粒子的顺向轴突运输和跨突触运输。PCR分析证实在从投射区收集的组织样品中存在运输的病毒DNA。采用含有神经元特异性启动子的重组杆状病毒，在远离注射部位的神经元细胞中可检测到转基因表达。
用于神经元基因转染的轴突运输的应用使病毒载体靶向神经回路远侧部分的神经元。通过采用更接近脑区的注射位点，该方法可以靶向CNS结构深处的神经元群或可以使通过注射方法引起的敏感区域的损伤达到最小。纹状体是用于检测该方法的常用区域之一。有三个脑区突出到纹状体：大脑皮质、黑质和丘脑板内核。黑质中的多巴胺能神经元具有突出到纹状体的大面积的长轴突并已用于研究包括腺病毒(Ghadge等，1995；Peltekian等，2002)、AAV(Kaspar等，2002)和HSV(Jin等，1996)的很多病毒载体的逆向运输。本发明人已发现，采用所述杆状病毒载体，虽然黑质中转基因表达仍然非常显著，但是与大脑皮质中的表达相比相对较低，可能是由于这两种脑区中神经元数量的差异造成的。
视觉系统是定义明确的具有向心和离心非交互连接的感觉途径(Peters，1985)。在啮齿动物中，来自视网膜的大部分芽枝(projection)在丘脑、上丘(SC)和下丘脑中的几个结构的对侧(Millhouse，1977)。在丘脑中，几种包括背外侧膝状核(dorsal lateral geniculate nucleus，dLGN)的丘脑核是初级视网膜接受区。从dLGN将神经芽枝运输到初级和次级视皮质(区域17和18)(Hughes，1977；Caviness，Jr.和Frost，1983)。神经元进一步从视网膜突出到许多其它皮质和皮质下区，如颞、额、和腹侧眶皮质以及基底核。因此，这些视网膜和视皮质之间的连接用于分析跨神经元运输。在玻璃体内注射所述杆状病毒载体后，虽然在视网膜中病毒进入神经元和神经胶质，但是视网膜中神经元特异性启动子下的转基因表达限于神经节细胞中。此外，眼内接种杆状病毒引起沿着视觉相关结构的神经元的顺序感染，表明该病毒可以穿过几种突触。
因此，例如可以将杆状病毒载体送递到不易于局部注射的任意靶神经元细胞，因为其在不易达到的中枢神经系统的区域或其广泛分布于需要多次局部注射的中枢神经系统的不同区域。通过识别远离此种靶神经元细胞的中枢神经系统中的位点并将所用载体施用在该位点，可以将所述载体通过轴突运输送递到所述靶神经元细胞。
根据本领域中通常的意义，在文中可互换使用的术语“神经元细胞”和“神经元”，是指一般包括细胞体、几个树突和轴突的神经系统的任意传导细胞。除非上下文另外清楚注明，该术语包括单个细胞以及多个或一群细胞。
如技术人员应理解地，很多神经元细胞具有突出到通过注射可达到的中枢神经系统中的区域的长轴突。因此，如文中所用的术语靶神经元细胞，包括通过注射可到达的远离其轴突的神经元细胞，以及通过跨突触运输可以送递载体的另一神经元细胞的细胞体。如果在通过跨突触运输进入投射神经元细胞或另一神经元细胞的细胞体前通过轴突运输注射到位点的载体运输，该位点“远离”靶神经元细胞。相反，如果可以将载体送递到没有任何轴突运输的局部注射区域内或周围的神经元细胞，局部注射的位点不远离这些神经元细胞。技术人员可容易地识别所需的靶神经元细胞和施用位点，该位点通过注射可到达且远离靶神经元细胞，以致通过轴突运输将所述载体送递到靶神经元细胞。此类靶神经元细胞及其远侧施用位点的实例包括视神经中的靶神经元细胞、如背外侧膝状核和上丘的丘脑中的视网膜接受区、以及从视网膜的远侧位点或通过注射到玻璃体中可到达的初级和次级视皮质。分别在大脑皮质和黑质的皮质纹状体途径和黑质纹状体途径上的靶神经元细胞通过在纹状体的远侧部位注射是可到达的。可以通过参考多种神经解剖学图谱和文本确定靶细胞和可到达此种细胞的远侧部位的更多实例，例如，Atlas ofFunctionalNeuroanatoiny)，W.J.Hendleman，CRC出版社，2000；Neuroanatomy：AFunctionalAtlas ofPartsandPathways，R.Poritsky，Hanley&Belfus，1992；FunctionalNeuroanatomy，A.K.Afifi和R.A.Bergman，McGraw-Hill，1998；Functional Systems：3D Reconstructions withcorrelated Neuroimaging，H-J Kretschmann和W.Weinrich，Thieme，1998；和Neuroanatomy：AnAtlasofStructures，Sectionsand Systems第5版，D.E.Haines，Lippincott，Williams&Wil kins，2002。
杆状病毒是公知和表征的并且包括苜蓿银蚊夜蛾的用途的用于哺乳动物基因转染的杆状病毒载体是已知的(参见例如，Sakis等，PNAS97(26))。技术人员可以容易地构建任意用于本发明的合适的杆状病毒载体。所述杆状病毒载体可以是基因组已被修饰，以表达与神经元特异性启动子或如CMV启动子的病毒启动子或以下讨论的任意可操作连接的启动子/增强子可操作连接的转基因的重组杆状病毒。可以用技术人员已知的如PCR和分子克隆技术的标准技术修饰杆状病毒。例如，用如Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统(Gibco BRL，LifeTechnologies，美国)的市售克隆和表达系统可以容易地修饰杆状病毒。
术语“基因”根据它的通常定义使用，表示核酸序列的可操作连接单位。术语“转基因”是指外源基因，例如，参考通过杆状病毒转基因的表达是指杆状病毒基因组以外的基因，并且包括治疗基因的表达。
文中所用的术语“治疗基因”或“治疗转基因”试图广泛地描述其表达引起如治疗、预防或减轻神经元疾病的所需结果的任意基因。
优选地，所述基因为包括任意具有临床用途的基因的治疗基因，如编码或涉及疾病预防或治疗的基因产物或蛋白的基因，或涉及疾病预防或治疗的具有细胞调节作用的基因。所述基因产物应取代对象中的缺陷或缺失的基因产物、蛋白质或细胞调节作用，因此能预防或治疗对象中的疾病或病症。治疗基因包括生长因子基因(包括成纤维生长因子基因家族、神经生长因子基因家族的基因和胰岛素样生长因子基因)和抗细胞凋亡基因(包括bc1-2基因家族的基因)。
如中风、癫痫、头和脊髓创伤、帕金森病、亨廷顿病(Huntington’sdisease)、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化和很多神经遗传病的神经系统疾病对个体具有破坏性作用并导致与长期照顾和丧失生产力相关的高社会成本。这些疾病的共同特征是神经元丧失(neuronal loss)。很多上述病症与一种或多种基因的缺失、机能障碍或无效相关并对常规治疗方法不能很好地反应。因此，已认为将涉及治疗基因的送递和表达的基因运输到中枢神经系统(CNS)是治疗这些病症的潜在方法。该方法可以介导神经营养因子、抗凋亡蛋白质、抗氧化分子和其它治疗因子的表达水平恢复、停止或防止神经元变性。基因治疗对于治疗CNS恶性肿瘤也提供了很多希望。
例如，对于帕金森病有两种主要的基因治疗策略。第一种方法是转移如BDNF(brain derived neurotrophicfactor，脑衍生的神经营养因子)、GDNF(glia derived neurotrophicfactor，神经胶质衍生的神经营养因子)和如bc1-2的抗凋亡基因的编码营养因子或保护性蛋白质的基因，以减慢或停止持续的神经变性过程。第二种方法是转移编码如TH(酪氨酸羟化酶)、GTPCH(GTP-环水解酶)和恢复纹状体DA(多巴胺)水平和紧张性的AADA(芳族氨基酸脱羧酶)的神经递质合成和代谢酶的基因，以增强部分变性系统的功能。
对于亨廷顿病，基因治疗的方法包括1)抑制突变的IT15基因表达的反义策略，和2)保持尾状、壳和大脑皮质中γ-氨基丁酸能变性(GABAergic degeneration)的保护性策略。已表明NGF、CNTF(ciliaryneurothropic factor，纤毛神经营养因子)对亨廷顿病实验动物模型提供保护作用。
身体中最复杂的器官CNS的独有特征对在CNS中成功的基因治疗提出几种障碍。这些特征包括由于颅骨和血脑屏障的物理障碍、末端分化神经元的性质和用治疗基因有效转染它们的困难引起的限制到达CNS。而且，在CNS中发现的细胞型非常多样，其中很多对生理功能至关重要并且对任何种类的变化是高度敏感的。这需要开发局限于特定类型的CNS细胞的CNS基因治疗，因此保证在目的细胞中的治疗效果并限制由非靶CNS细胞中基因表达引起的副作用。
在不同的实施方案中，可以将包括与治疗基因序列可操作连接的启动子的杆状病毒载体送递到远离施用位点的神经元细胞。所述启动子可以是如CMV或神经元特异性启动子的强病毒启动子。通过采用神经元细胞特异性启动子可以完成在选定的细胞型中的特异性基因表达。
神经元特异启动子可以是功能为活化神经元或神经元细胞中并基本上不在其它细胞型中可操作连接的序列的转录的任一核苷酸序列。如果在任一此类细胞型中可操作连接序列的转录水平足够低，启动子一般不活化转录，从而不影响细胞的生理功能。
神经元细胞特异性启动子可包括用于如突出蛋白I(Synapsin I)、神经元特异性烯醇化酶、神经丝-L和神经肽Y的神经元基因的启动子和对特殊类型的神经元细胞特异的启动子。例如，酪氨酸羟化酶基因启动子(4.8kb5’UTR)对儿茶酚胺能和CNS神经元是特异的、多巴胺-b-羟化酶基因启动子对肾上腺素能和去甲肾上腺素能神经元是特异的和L7浦肯野细胞蛋白质启动子对视网膜杆双极神经元是特异的。对于这些和其它包括D1A多巴胺受体基因启动子、人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、SCG10启动子、Tαc1α-微管蛋白启动子、醛缩酶C启动子、β-微管蛋白基因启动子、GnRH基因增强子和启动子、谷氨酸脱羧酶65基因启动子、β-半乳糖苷α1，2-岩藻糖基转移酶基因启动子、神经元烟碱乙酰胆碱受体β3基因启动子、GABA(A)受体δ亚基基因启动子、神经元特异性FE65基因启动子、N-型钙通道α1B亚基基因启动子和微管相关蛋白1B基因启动子的神经元细胞特异性启动子，参见Harrington CA，Lewis EJ，Krzemien D，Chikaraishi DM.Identification andcell type specificity of the tyrosine hydroxylase gene promoter.NucleicAcids Res1987，15：2363-2384；Coker GT3rd，Vinnedge L，O’Malley KL；Characterization of rat and human tyrosine hydroxylase genes：functionalexpression of both promoters in neuronal and non-neuronal cell types.Biochem Biophys Res Commun 1988，157：1341-1347；Banerjee SA，HoppeP，Brilliant M，Chikaraishi DM.5’flanking sequences of the rattyrosine hydroxylase gene target accurate tissue-specific，developmental，and transsynaptic expression in 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所述启动子包括至少一个能够活化与该序列可操作连接的神经元细胞特异性表达的核苷酸序列，并且在部分实施方案中所述核苷酸序列将保留对于该序列作为启动子所需的转录因子的最小结合位点。在部分实施方案中，所述载体包括多个拷贝的相同序列或两个或多个不同的对活化转录活性有效的核苷酸序列。对于可用的不同启动子，通过使用上述本领域已知方法的常规技术的一种，可以知道或识别转录因子结合位点。通过标准表达测定法可以容易地确定合适的启动子/增强子构建体。
已表明血小板衍生的生长因子β-链(PDGFβ)启动子(SasaharaM，Fries JW，Raines EW，Gown AM，Westrum LE，Frosch MP，BonthronDT，Ross R，Collins T.PDGFβ-chain in neurons of the central nervoussystem；posterior pituitary，and in a transgenic model.Cell1991；64：217-227)对包括多巴胺能神经元的CNS神经元细胞是特异的，并且在一个实施方式中，神经元特异性启动子是PDGFβ启动子。在特定实施方式中，神经元特异性启动子是人PDGFβ启动子。
在一些情况下，神经元特异性启动子的转录活性可能是弱的，提供低于治疗基因序列表达的理想水平。在不同实施方式中，所述神经元特异性启动子可以与增强子可操作连接。“增强子”是能够增强可操作连接的启动子的转录活性核苷酸序列，并且在神经元特异性启动子的情况下，能够提高所述启动子的神经元细胞特异性转录活性。
当所述序列置于功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，如果所述启动子活化编码序列的转录，编码序列与该启动子可操作连接。相似地，当增强子增强可操作连接的序列的神经元细胞特异性转录时，神经元细胞特异性启动子与异源增强子可操作连接。当增强子与启动子分离时，增强子可起作用，并且如果这样，增强子可以与神经元特异性启动子可操作连接，但可为不连续的。然而，一般而言，可操作连接的序列是连续的。
在不同的实施方式中，所述增强子可以是异源增强子，表示不是与神经元细胞特异性启动子自然地可操作连接，并且，当如此可操作连接时，增强了神经元细胞特异性启动子的神经元细胞特异性转录活性的核苷酸序列。所指的增强转录活性表示与仅使用神经元细胞特异性启动子观察到的转录水平相比，是指如在实施例中描述的可以在包括采用报道基因构建体的标准转录测定法中检测的任何可检测到的可操作连接的序列的转录水平的增强。
所述增强子可以是已知的强病毒增强子或启动子元件，如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)启动子(German CM，Merlino GT，Willingham MC，Pastan I，Howard BH.The Rous sarcoma virus longterminal repeat is a strong promoter when introduced into a variety ofeukaryotic cells by DNA-mediated transfection.Proc Natl Acad Sci U S A1982；79：6777-6781)、SV40启动子(Ghosh PK，LebowitzP，Frisque RJ，Gluzman Y.Identification of a promoter component involved in positioningthe5’termini of simian virus40early mRNAs.Proc Natl Acad Sci U S A1981；78：100-104)、包括CMV立即早期(immediate earl y，IE)基因增强子(CMVE增强子)的CMV增强子或启动子(Boshart M，Weber F，Jahn G，Dorsch-Hasler K，Fleckenstein B，Schaffner W.A very strongenhancer is located upstream of an immediate early gene of humancytomegalovirus.Cell1985；41：521-530；Niwa H，Yamamura H，MiyazakiJ.Efficientselectionfor high-expression transfectantswitha noveleukaryotic vector.Gene1991；108：193-200；也参见美国专利号5,849,522和5,168,062)。
在本发明的实施方式中，CMVE增强子与PDGFβ启动子上游可操作连接。在另一实施方式中，CMVE增强子与PDGFβ启动子上游可操作连接并且两个序列是连续的。
在本文中全部引入作为参考的美国申请号10/407，009中描述了包括已知启动子和增强子序列的等位变体和衍生物的可操作连接的神经元特异性启动子和增强子的其他实施方案。
在不同实施方案中，因为此种变体和衍生物与已知的增强子和启动子在缓和或严格条件下杂交，所以其可为基本上同源。例如，在缓和或严格条件下，与滤膜结合序列的杂交可以在65℃下在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中进行，并在42℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤(参见Ausubel，等(编者)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，Green PublishingAssociates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，纽约，在2.10.3页)。备选地，例如，在严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以在65℃下在0.5MNaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中进行，并在68℃下在0.1x SSC/0.1％SDS中洗涤(参见Ausubel，等(编者)1989，同上)。杂交条件取决于目的序列可以根据已知方法改变(参见Tijssen1993，Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization withNucleic Acid Probes，第1部分，第2章“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，纽约)。一般而言，对于确定离子强度和pH的特定序列选择严格条件为低于热熔点大约5℃。例如，可以在42℃下在5倍的SSC和50％的甲酰胺中严格杂交并在65℃下在包括0.1倍的SSC的洗涤缓冲液洗涤。例如，严格杂交的洗涤可以为至少15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟或120分钟。
序列之间的同源程度也可表示为当序列最佳比对时同一性的百分数，表示序列之间准确匹配的发生。可以用如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math2：482，the homology alignment algorithm of Needlemanand Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的局部同源性规则、Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444的相似性检索方法和这些规则的计算机化实现(如Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，麦迪逊，威斯康星州，美国)的多种规则进行同一性比较的序列的最佳比对。也可用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(用公开的默认设置)中描述的BLAST规则进行序列比对。用于进行BLAST分析的软件可以从国家生物工程信息中心(National Centerfor BiotechnologyInformation)(通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的因特网)获得。在不同实施方案中，如用此种规则确定的，该变体和衍生物可为大于50％、80％至100％、至少80％、至少90％或至少95％同一。
可将所述杆状病毒载体送递到任一脊椎动物对象。在一个实施方式中对象是人。
为了将杆状病毒送递到远离载体施用位点的中枢神经系统的特定区域的靶神经元细胞，可以用本领域已知的标准方法和如实施例中描述的方法将其施用到对象。例如，为了将载体通过杆状病毒的轴突运输送递到运输远离或达不到的位点的神经元或送递到皮质或脊髓，可以将载体施用到如纹状体中的可到达的位点。由于杆状病毒可以顺向和逆向运输，所述可到达的位点可以位于相同神经元途径的靶细胞的上游或下游。
优选地杆状病毒通过注射施用，所述注射包括立体定位注射和注射到眼的玻璃体和皮质或用于损伤的脊髓再生的脊髓注射。对于人类患者，立体定位框架基质将固定到颅骨中并用高分辨率MRI对具有立体定位框架基质的脑成像。用适当的立体定位软件，图像将转化成适合于载体DNA靶注射的立体定位框架的三维同等物。
以足够达到如治疗基因在靶细胞中表达的所需结果的量施用杆状病毒。
当向患者施用时，杆状病毒以有效量施用，并于该剂量和充足的时限以达到需要的结果。例如，可以送递治疗基因必要的量和剂量施用杆状病毒，所述治疗基因的产物起到减轻、改善、缓和、改进、稳定、防止扩散、放慢或延迟神元经疾病或病症的进程或治愈神经元疾病或病症。
向患者施用的有效量可以根据如杆状病毒的药物动力学性质、施用方式、对象的年龄、健康和体重、病症或疾病状态的性质和程度、治疗的频率和如果存在共同治疗的类型，和病毒的毒力和滴度的很多因素对象而变化。
基于上述因素，本领域技术人员可以确定适当的量。最初，可以取决于患者的临床反应根据需要可以调节的合适的量施用杆状病毒。杆状病毒的有效量可以以经验确定，并且取决于可以安全施用的杆状病毒的最大量。因为杆状病毒在脊椎动物中具有很小的细胞毒性至无细胞毒性，因此可以耐受大剂量。然而，施用的杆状病毒的量应为产生需要结果的最小量。
在不同实施方式中，向人类患者施用约109空斑形成单位(“pfu”)的剂量。在其它实施方式中，单次剂量中可以施用约102～约109pfu、约106～109pfu、约102～约107pfu、约103至106pfu或约104～105pfu。
杆状病毒的有效量可根据最初治疗方案的效果重复施用。一般在监测任何反应时周期性施用。技术人员应认识到根据所选的施用方案和途径，可以施用低于或高于上述指示的剂量。
为了辅助施用，可以将该病毒配制成药物组合物中的成分。该组合物可以通常包括可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和多种可容性载体。对于所有形式的送递，重组杆状病毒可以在生理盐溶液中配制。
通过所选的施用途径、与活病毒的相容性和标准药学实践确定可药用稀释剂的比例和同一性。一般而言，药物组合物与不显著损害活病毒的生物学性质的组分配制。合适的载体和稀释剂例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，美国1985)中描述。
重组杆状病毒溶液可以在生理学合适的缓冲液中制备。在普通储藏和使用条件下，这些制剂包括防止微生物的生长但不会灭活活病毒的防腐剂。本领域技术人员应知道怎样制备合适的剂型。例如在1999年出版的Remington’s Pharmaceutical Sciences and in The United StatesPharmacopeia：The National Formulary(USP24NF19)中描述了用于合适剂型的选择和制备的常规步骤和配料。
适用于注射用途的药物组合物的形式包括无菌含水溶液或用于无菌可注射溶液或分散剂的临时制剂的分散剂和无菌粉剂，其中术语无菌不延伸到待施用的杆状病毒自身。在所有情况下，所述必须是无菌的并且必需是容易吸到注射器的程度的液体。
将治疗基因送递到CNS的远离或不可到达区域的神经元允许治疗神经元病症或疾病。例如，用本发明的方法，治疗基因送递可以靶向黑质中的多巴胺能神经元用于治疗帕金森病(Bilang-Bleuel等，1997)。同样，使用本发明的方法，在通过单一局部注射广泛分布在不易达到的大脑皮质的多个区域的神经元中可以实现治疗转基因的表达，因此允许亨廷顿病(HD，Mittoux等，2002)影响的神经元的皮质纹状体苍白体神经元保护。
本发明的一个技术方案提供了一种用于治疗患者中神经元病症的方法，该仿佛发包括识别病症影响的CNS中靶神经元细胞、识别远离所述靶神经元细胞的CAN中的位点和向所述位点施用包括与神经元特异性启动子可操作连接的治疗基因的杆状病毒载体，其中，通过轴突运输将杆状病毒载体运输送递到所述神经元细胞。本发明也提供了杆状病毒载体用于治疗神经元病症和在生产用于此种治疗的药物中的此种用途。
“治疗”神经元病症是指用于获得包括临床结果的有益或需要的结果的方法。无论可检测到或不可检测到，有益或需要的临床结果可以包括但不限于减轻或改进一种或多种症状或病症、减小疾病程度、稳定疾病状态、防止疾病发展、防止疾病扩散、延迟或放慢疾病进程、延迟或放慢疾病发作、改进或减轻疾病状态和缓和(部分或全部)。“治疗”也可以表示延长超过患者没有治疗下期望的存活。“治疗”也可以表示抑制疾病的进程，暂时放慢疾病的进程，尽管更优选地，其涉及永久停止疾病的进程。如本领域技术人员应当理解地，如果改善特定疾病状态时，治疗导致经治疗的患者的副作用超过通过治疗引起的任意益处，结果可能不是有益的或需要的。
不受限制地，神经元病症可为中风、局部缺血、癫痫、头和脊髓创伤或损伤、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化或神经遗传病。
“病症影响的神经元细胞”是指涉及、利于或由神经元病症引起的具有缺陷或机能障碍并且可以通过在神经元细胞中治疗基因的表达治疗的任意神经元细胞。
如HSV和伪狂犬病毒的某些病毒可以跨突触运输并已成功地用作跨神经元示踪物(Babic等，1994；Blessing等，1994；Norgren，Jr.和Lehman，1998)。因为杆状病毒地有效地跨突触运输的当前的发现，此类病毒具有作为用于示踪感觉和运动途径的强效神经元示踪物的潜力。与其它跨神经元示踪物病毒相比，顺向轴突运输比逆向运输相对较慢和效率较低(Mclean等，1989；Card等，1990；Card等，1991；Vann和Atherton，1991；Norgren，Jr.等，1992；Blessing等，1994；Sun等，1996)，杆状病毒在轴质中顺向和逆向均非常快速地扩散。例如，在大鼠中观察到在2天内重组杆状病毒从纹状体运输到大脑皮质和从视网膜运输到初级视皮层。然而，由于杆状病毒轴突运输的双方向性，杆状病毒可能不适于示踪互逆的途径。
因此，在一个实施方式中提供了一种用于示踪神经元途径的方法，该方法包括在对象的中枢神经系统中的位点向对象施用用于检测的杆状病毒和检测所述杆状病毒的运输途径。
杆状病毒可通过本领域已知的任一方法用于检测，从而当将其注射到对象的CNS中时能够检测到。例如，可用所述病毒粒子表面可检测的标记标记所述杆状病毒，例如，通过连接或结合一个如包膜蛋白的标记。或者，例如可以通过在病毒装配期间，在病毒颗粒内整合示踪分子标记所述杆状病毒。连接的标记可以是荧光染料分子、放射标记、不透射线材料、有助于磁共振成像的发光纳米晶体量子点(quantum-dot)或材料。
放射标记是本领域已知的，并包括公知的如Tc-99m、I-123、I-125，In-111、In-113m、Ga-67或其它合适的γ-放射源的医学放射性核素。不透射线材料也是已知的并包括碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。不透射线材料的具体实例包括钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸、碘卡酸、碘醋胺酸、碘达酸(iodamide)、胆影酸(iodipamide)、碘氧亚氨酸(iodoxamic acid)、碘枸来米(iogulamide)、约海克索(iohexol)、碘异酞醇(iopamidol)、碘番酸、碘桂酸(ioprocemic acid)、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺(iosulamide meglumine)、约苏美克酸(ios-umetic acid)、碘酞硫(iotasul)、碘得酸(iotetric acid)、碘酞酸(iothalamic acid)、碘出酸(iotroxic acid)、碘格利酸(ioxaglic acid)、羟泛影酸(ioxotrizoic acid)、胺磺苯丙酸(ipodate)、葡甲胺、甲泛影酰胺(metrizamide)；甲基三元影酸(metrizoate)、丙碘酮和氯化亚铊。可以通过磁共振检测或增强磁共振效果的材料包括钆、铜、铁和铬，并可以常规有机金属螯合物的形式制备，然后可以与杆状病毒结合。
通过遗传修饰表达在神经元特异性启动子的控制下表达编码如荧光蛋白的可检测的蛋白质的基因，杆状病毒也可用于检测。例如，如在实施例中描述的，可修饰杆状病毒以在CMV E/PDGF启动子控制下表达绿色荧光蛋白。
使用包括用于视觉诊断图像的用于检测的任一常规方法也可检测杆状病毒，并将取决于所用的具体可检测系统。例如，遗传修饰杆状病毒以表达用荧光数字成像显微镜可以检测的荧光蛋白。其它方法包括计算机层析X射线照相术(computed tomography，CT)、如正电子发射体层摄影术(position emission tomography，PET)的全身扫描、磁共振影成像(MRI)和超声波扫描术(sonography)。本领域技术人员将能够确定用于检测具体可检测标记的适当方法。
在向患者施用所述病毒后的合适的时间间隔可以检测到或显像杆状病毒，从而使杆状病毒沿着神经元途径运输，并且如果必要表达可检测产物。例如，显像可发生在向对象施用经遗传修饰以表达荧光蛋白的杆状病毒后2和20天之间的任何位置。
实施例
我们研究了杆状病毒载体是否可以在轴突中运输，因此在远离注射位点的区域介导基因表达。纹状体内注射接着皮质纹状体途径和黑质纹状体途径的检查和视觉途径的玻璃体内注射分别用于研究逆向和顺向轴突运输。使用带有神经元特异性CMV E/PDGF启动子的重组杆状病毒载体以促进神经元细胞体中的基因表达。
材料和方法
重组杆状病毒载体的制备：根据Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统手册(Gibco BRL，Life Technologies，美国)构建重组杆状病毒。将CMVE/PDGF、CMV或PDGF启动子控制下的萤光素酶cDNA插入到转移质粒pFastBaclTM中。将各启动子插入Not1和Xba1之间，并将萤光素酶cDNA在Xhol和HindIII之间插入到pFASTBac1中。根据标准方法(O′Reilly等，1992)，重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中增殖。从昆虫细胞培养基出芽的病毒通过0.2μm孔径过滤器过滤并通过25,000g超速离心浓缩60分钟。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮病毒颗粒并通过在Sf9细胞上的空斑试验确定感染滴度。
杆状病毒的Cy3标记：用羰花青染料Cy3(Amersham)标记纯化的病毒。在pH9.3的碳酸钠碳酸氢纳缓冲液中将待标记的杆状病毒原种调节到浓度为2x1010粒子/毫升。先在pH9.3的1ml的0.1M碳酸钠中将Cy3试剂重新组成(计划将1mg蛋白质标记为染料/蛋白质的终摩尔比在4和12之间)。用100μl病毒制剂与200μl Cy3重组体混和。在室温下30分钟后，通过28,000g离心30分钟纯化标记的病毒。用1x PBS洗涤病毒颗粒2次以除去未反应的Cy3，然后在1x PBS中重悬浮。将纯化的病毒整分到一次性小管中并在使用前储藏在4℃。
动物：本研究中使用成年雄性Wistar大鼠(重250～320g)。在所有动物的处理和照顾中，遵循世界卫生组织(1985)规定的、国立新加坡大学实验动物中心(the Laboratory Animal Center，NationalUniversity of Singapore)采用的用于动物研究的国际指导原则(theInternational Guiding Principles for Animal Research)。
体内注射方法：对于纹状体内注射，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(60mg/kg体重)麻醉大鼠并用设在O的压尺(nose bar)在立体定位仪器上定位(对于纹状体注射)。将病毒粒子在3个注射点[等同物(来自前囟点和硬脑膜)：前面(A)，+1.5mm，侧面(L)，+2.0mm，腹面(V)，-5.0mm；A，+0.5mm，L，+3mm，V，-5.0mm和A，-0.3mm，L，+3mm，V，-5.0mm]或在1点[A，+0.5mm，L，+3mm，V，-5.0mm]分别和两侧注射到纹状体中。对于各注射，注射值为5μl或10μl含有5x106pfu或1x107病毒粒子。注射率为0.5μl/分钟并将针头原位保持5分钟，然后在各注射结束时缓慢收回。对于玻璃体内注射，将动物如上述相同的方式麻醉。具有30号内径的针头的注射器穿透巩膜进入玻璃体后面至ora seratta，然后缓慢吸出10μl玻璃体。其后，将10μl病毒粒子(107pfu)缓慢向后注射到后房。
萤光素酶测定：对于萤光素酶活性测定，将通过0.1M PBS(pH7.4)心内灌注感染后2天后深度麻醉的病毒感染的大鼠处死。收集组织样品并在-80℃保存直到进行处理。加入PBS缓冲液(每50mg组织100ul PBS)，各样品在冰上超声匀浆10秒，然后在微型离心机上4℃、13,000rpm离心。用来自Promega的测定试剂盒对10μl室温的上清液用于萤光素酶活性测定。在单孔发光计(Berthold Lumat LB9501)上测定10秒。
来自组织样品的病毒基因组的PCR检测：将通过0.1M PBS(pH7.4)心内灌注感染后2天后深度麻醉的病毒感染的大鼠处死。收集组织样品并通过研杵研碎匀浆，并根据DNeasyTM组织试剂盒(Qiagen)的标准方法提取病毒基因组。引物靶向序列大约400个碱基对的序列，在天然病毒基因组和插入的报道基因之间重叠。PCR引物如下列出：
5’引物：5’-AT TGC TCA ACA GTA TGG GCA-3’(SEQ ID NO.：1)
3’引物：5’-CGA AGA AGG AGA ATA GGG TTG-3’(SEQ ID NO.：2)
扩增循环包括94℃7min，1个循环；94℃45s，52℃30s，72℃30s，36个循环和72℃7min的一个最终延伸循环。为了排除整个过程的污染，平行处理没有病毒感染的正常大鼠脑。
免疫组织化学分析：用Cy3标记的或未标记的杆状病毒纹状体内注射或玻璃体内注射2天后，将大鼠处死(n＝2)。深度麻醉后，首先用0.1M PBS(pH7.4)溶液灌注接着用0.1M PBS(pH7.4)中的4％多聚甲醛灌注所有大鼠。灌注后，除去脑和眼球并在相同的固定剂中后固定2～4小时，然后将其转移到含有20％蔗糖的0.1M PBS中并在4℃过夜。将各脑的冷冻冠状切片切成30μm的厚度并在0.1M PBS中保存。自由漂浮的切片在含有0.2％Triton X-100的pH7.4的0.1M PBS中洗涤20分钟，然后用PBS中的5％正常山羊血清封闭1小时。各眼球的冷冻矢状切片切成30μm的厚度并置于涂敷明胶的载玻片上。
然后将切片与一级抗体多克隆抗萤光素酶(Promega；1∶150稀释)和单克隆抗神经元特异性核蛋白(NeuN)(Chemicon International，美国；1∶500稀释)孵育过夜。将切片在0.1M PBS中洗涤并进一步与通过Tritc结合的抗兔IgG(Sigma-Aldrich，Inc.，美国；1∶100稀释)和与通过Fitc结合的抗鼠IgG(Sigma-Aldrich；1∶100稀释)孵育1小时。孵育后，切片在PBS中洗涤3次。然后将其收集在涂敷明胶的载玻片上，DAKO荧光封固剂封固并用盖玻片覆盖。对照切片没有用一级抗体孵育。
Cy3标记的病毒用于显示体内病毒的内化。对于这组，将切片在仅与单克隆抗神经元特异性核蛋白(NeuN)(Chemicon International，美国；1∶500稀释)或单克隆抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidic protein，GFAP，Chemicon)孵育过夜。将切片在0.1M PBS中洗涤并与进一步与通过Fitc结合的抗鼠IgG(Sigma-Aldrich；1∶100稀释)孵育1小时。然后将切片同上进行处理。
共焦扫描显微术的双重标记的显像：用Carl Zeiss LSM410共聚焦激光扫描显微镜检查切片。各切片最初用488nm激光谱线和放射滤光器BP510-525扫描，用于检测Fitc荧光素；并且用543nm激光谱线和放射滤光器LP570用于检测Tritc荧光素。
结果
纹状体内注射：我们首先用Cy3标记的杆状病毒载体检查载体的可能逆向轴突运输。通过立体定位仪器将Cy3标记的载体与1x109空斑形成单位(pfu)的浓缩病毒粒子注射到Wista大鼠纹状体。收集皮质纹状体途径和黑质纹状体途径的组织切片并使用抗神经元核蛋白(NeuN，神经元特异性标记)的抗体免疫染色以显示纹状体和大脑皮质中的神经元或使用抗酪氨酸羟化酶(TH，多巴胺能神经元特异性标记)的抗体免疫染色以显示黑质中的多巴胺能神经元。由于Cy3与病毒的包膜蛋白结合，组织中显示的荧光素呈现与病毒衣壳一起运输的病毒粒子。
图1显示纹状体、大脑皮质核黑质的共焦图像。在纹状体中，在NeuN-阳性或阴性细胞中均检测到Cy3信号，表明病毒粒子进入神经元和非神经元细胞。在大脑皮质和黑质中，Cy3信号与NeuN或TH信号严格地共定位，表明将病毒粒子注射到纹状体后，进入轴突末端并在轴质中运动到投射神经元的细胞体后，定位在大脑皮质和黑质中。这通过在远离被注射的纹状体的大脑皮质和黑质中检测杆状病毒基因组的PCR分析(图2)得到支持。
为了检测投射神经元中基因转移的可能性，检查了由神经元特异性CMV E/PDGF启动子病毒CMV启动子驱动的萤光素酶报道基因的表达。注射5x106pfu重组杆状病毒后2天测定了萤光素酶活性。荧光素酶活性不仅仅在注射的纹状体中，在远端黑质和大脑皮质区域也可检测到(图3)。在大脑皮质中检测到来自三个部分的总萤光素酶活性90％以上，在黑质中检测到约1％。
用免疫组织学染色进行了进一步的实验以确定具有萤光素酶表达的细胞的类型。在纹状体中，在NeuN阳性和阴性细胞中均检测到萤光素酶信号(图4)。如图5中所示，萤光素酶报道基因的表达与在大脑皮质中的NeuN-阳性神经元或黑质中的TH-阳性神经元严格地共定位。在大脑皮质中，萤光酶信号主要在位于深层的大锥体神经元中检测到(图5)，所述大锥体神经元为已知将其长轴突投射到纹状体壳的一群细胞。在大脑皮质的表层有非常少的具有颗粒中间神经元形态的转导细胞(图5)。
与大脑皮质相比，虽然其绝对值仍然高度显著，但是黑质中荧光素酶的表达相对较低。考虑到这两个脑区中神经元数量的差异，可以预料转基因表达水平的差异。
玻璃体内注射：为了研究杆状病毒的可能的顺向轴突运输，为了转导视网膜神经节细胞(retina ganglio cell，RGC)，将Cy3标记的载体注射到大鼠玻璃体中。这些神经元具有突出到外侧膝状体(lateralgeniculate body，LGB)和上丘(SC)的长轴突并与位于那里的中间神经元形成突触。从LGB，中间神经元的轴突通过脑的深部白质散开以形成最终在脑后部的初级视皮层终止的视辐射。
玻璃体内注射109pfu的标记的杆状病毒载体后，在从视网膜、视神经、LGB、SC至初级视皮层的视觉系统的不同部分，在共焦显微镜下可观察到病毒颗粒。在视网膜中，在NeuN-阳性和阴性细胞中检测到病毒粒子(图6和图7)。在视神经中可以容易地检测到标记的粒子并且沿着该神经的矢状切面分布，表明病毒沿着RGC的轴突顺向运输移动。Cy3信号严格地定位在LGB和SC的NeuN-阳性神经元，表明病毒颗粒到突触后神经元的可能的跨突触运输。病毒载体跨过突触间隙运输的假设通过在初级视皮层中的第三神经元中检测到Cy3信号得到强烈支持。从视觉系统的不同部分收集的样品中病毒基因组的PCR分析为杆状病毒载体的顺向运输和跨突触运输提供了另一条证据(图8)。
然后用在神经元特异性CMV E/PDGF启动子控制下的萤光素酶报道基因载体研究了用杆状病毒使用于在突出的、突触后神经元中基因转移的可能性。玻璃体内注射1x107pfu的重组杆状病毒后，在视觉回路的所有部分检测到萤光素酶活性，在视网膜中有最高的转基因表达，在LGN和初级视皮层中也有转基因表达(图9)。SC有最低的萤光素酶表达，与大鼠中只有少量轴突从RGC突出到这个区域的事实一致(http://thalamus.wustl.edu/course/和http://psych.athabascau.ca/html/Psych402/Biotutorials/)。如通过免疫组织学染色显示地，无论检查视觉系统的哪部分，萤光素酶表达只限制在神经元中(图10)。LGB中大部分转导神经元是大神经元细胞，可能是从大神经节细胞接收输入信号的LGB的大M细胞。
在啮齿动物中，大部分来自视网膜的芽枝在丘脑、上丘(SC))和下丘脑中的几种结构的对侧。在丘脑中，几种包括背部侧膝体核(dLGN)的特定丘脑核是初级视网膜接受区。从dLGN，神经元芽枝与初级和二级视皮质(区域17和18)连接。神经元进一步从视皮质突出到如颞、额和腹外侧眶皮质和基底核的很多其它皮质和皮质下区域。因此，这些视网膜和视皮质之间的连接用于分析跨神经元运输。此时，我们发现，在神经元特异性启动子的帮助下，如通过Cy3标记显示地，虽然在玻璃体内注射杆状病毒后该病毒均进入神经元和神经胶质，但是视网膜中转基因表达限制在神经节细胞。该研究进一步表明眼内接种杆状病毒引起沿视觉相关结构的神经元的顺序感染，为病毒跨过几个突触的能力提供了证据。
如本领域技术人员可理解地，对文中描述的示例性实施方式的很多改变是可能的。如通过权利要求书限定地，本发明在其范围内试图包括所有此类改变。
文中参考的所有文献全部引入作为参考。
参考文献
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【序列表】
<110>王朔
李颖
<120>用于向神经元细胞基因送递的方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>1
attgctcaac agtatgggca 20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>2
cgaagaagga gaatagggtt g 21