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本发明提供具有抗艾滋病毒作用的冬凌草提取物，系冬凌草水提醇沉物的脱鞣质部分。经抗HIV检测，此部位显示活性。此部位无紫外吸收，对碘不显色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反应呈紫红色，显示为多糖化合物。通过不同浓度的乙醇沉淀多糖，得到沉淀多糖DBS－40、DBS－60、DBS－70、DBS－80、DBS－90。将DBS－70多糖经36DM透析袋透析得到DBS－70－6多糖，其平均分子量为7900，含四种单糖：鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它们之间的摩尔比为1.0∶2.2∶1.4∶1.0。本发明还提供所述冬凌草提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。

权利要求书
1.  抗艾滋病毒的冬凌草提取物，包含多糖有效部位，所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物的脱鞣质部分，所述多糖有效部位无紫外吸收，对碘不显色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反应呈紫红色。

2.  如权利要求1所述的冬凌草提取物，其中所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物脱鞣质部分的醇提物。

3.  如权利要求2所述的冬凌草提取物，其中所述多糖有效部位是40％、60％、70％、80％或90％EtOH沉淀多糖DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90。

4.  如权利要求3所述的冬凌草提取物，其中所述多糖有效部位是DBS-70多糖经36DM透析袋透析所得的DBS-70-6多糖，其平均分子量为7900，含四种单糖：鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它们之间的摩尔比为1.0∶2.2∶1.4∶1.0。

5.  权利要求1所述冬凌草提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。

说明书具有抗艾滋病毒作用的冬凌草提取物及其应用
技术领域
本发明涉及艾滋病防治药物，具体涉及具有艾滋病毒抑制活性的天然植物药提取物，更具体地涉及冬凌草提取物抗艾滋病毒的活性部位。
技术背景
艾滋病是由其致病源艾滋病毒(HIV)引起的一种对人类健康造成巨大危害的传染病，又称世纪绝症。现已共识，要从根本上防治艾滋病，疫苗是最好的选择。一个理想的疫苗应该是广谱、高效、低毒、价廉。然而由于艾滋病毒的高度变异及强大的逃逸功能，使得疫苗的研究变得十分艰难，在可预见的将来，这样的疫苗要获得成功还有十分长的路要走。因此抗艾滋病毒药物的研究并使其投向市场服务于感染病毒的患者是一个十分迫切的任务。
迄今为止，由美国FDA公布正式上市的抗艾滋病毒药物为23个，包括三种类型：a、病毒逆转录酶抑制剂；b、病毒蛋白酶的抑制剂；c、阻断细胞与病毒融合的短肽(表1，见下页)。
                   表1  抗逆转录病毒药物  a.病毒逆转录酶抑制剂  非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)  地拉夫定(Rescriptor)  依非韦伦(Sustiva)  奈韦拉平(尼维拉平)   核苷/核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)  阿布卡韦(Ziagen)  阿布卡韦+拉米夫定+齐多夫定(Trizivir)  地丹诺辛(Videx、ddI)  Emtricitabine(Emtriva、FTC)  拉米夫定(Epivir、3TC)  拉米夫定+齐多夫定(Combivir)  斯塔夫定(Zerit、D4T)  Tenofovir DF(Viread)  扎西他宾(HIVID ddC)  齐多夫定(叠氮胸苷、AZT、ZDV)  b.蛋白酶抑制剂(Pis)  安泼那韦(Agenerase)  Atazanavir(Reyataz)  印第那韦(Crixivan)  Lopinavir+利托那韦(Kaletra)  那非那韦(奈非那韦)  利托那韦(Norvir)  杀奎那韦-sgc  (Fortovase、沙奎那韦)    c.融合和抑制剂  Enfuvirtide(Fuzeon，T-20)    
另有三十多个新的候选药物分别在临床I，II，III期开发中(表2)。
                        表2  开发中的抗HIV新药物  药物  类别  临床分期  公司  ACH-126，444(Beta-L-Fd4C)  ADA(偶氮二碳酰胺)  Atazanavir(BMS-232623)  BMS-806  Calanolide A  Capavirine  Coviracil(emtricitabine，FTC)  DAPD(amdoxovir)  DPC 083  DPC 817  Hydrea(羟基脲)  L870810  Peptide T  PRO 542  S-1360  SCH-C  T-20  T-1249  替普那韦  TMC 114  TMC 125  UK-427,857  VX-175/GW433908  NRTI  锌指抑制剂  蛋白酶抑制剂  Entry inhibitor  NNRTI  NNRTI  NRTI  NRTI  NNRTI  NRTI  细胞因子抑制剂  整合酶抑制剂  Entry inhibitor  Entry inhibitor  整合酶抑制剂  Entry inhibitor  Entry inhibitor  Entry inhibitor  蛋白酶抑制剂  蛋白酶抑制剂  NNRTI  Entry inhibitor  蛋白酶抑制剂  I期  I/II期  III期  I期  I/II期  II/III期  III期  II期  II期  I/II期  II/III期  I期  II期  II期  I/II期  I期  III期  I/II期  II期  II期  II期  I期  III期  Achillion  Hubriphar  Bristol-Myers Squibb  Bristol-Myers Squibb  Sarawak MediChem  Plizer/Agouron  Triangle(已上市)  Triangle  Bristol-Myers Squibb  Bristol-Myers Squibb  Bristol-Myers Squibb  Merck  Georgetown University  Progenics  Shionog  Schering-Plough  Trimeris/Roche(已上市)  Trimeris/Roche  Boehringer IngeIhem  Tibotec-Virco  Tibotec-Virco  Pfizer  Vertex/GlaxoSmithKline
临床用药的经验表明，单个药物的应用很容易对病毒产生耐药性。根据患者的症状选用不同类别的药物进行组合的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)(俗称“鸡尾酒疗法”)的发明及运用在很大程度上缓解了患者的发病进程，改善了生活品质，延长了生命。因此，扩大可选择的新药阵容是保证治疗质量而面临的新任务。参见如下文献及网站的资料(这些文献和资料均引入本说明书作为参考)：
1.Johnston ML：HIV/AIDS疫苗开发——挑战、进步和未来方向，Reviews in Medical Virology，6(3)：123-140，1996。
2.www.ARAS.AB.CA/haart.html
3.www.hivandhepatitis.com
4.www.fdg.gov
通常开发一个新药至上市需要8～10年，资金达上亿美元。一般情况下，一个患者的药物花费每年在$8,000～12,000之间，个别药物甚至高达$15,000～20,000。这对大部分普通患者来说是难以承受的，特别对发展中国家的患者来说，更是难以消受。这样，另辟新径，寻找一条适合发展中国家的创新药物同样迫切与重要。从天然植物药的提取物中筛选抗HIV的有效成份或有效部位，使其最终成为新药，是一条可能和可行的道路。同时也为这一领域的研究开辟了一条新路。
本发明者曾通过体外抗艾滋病毒试验，从大量天然植物药中筛选到具有艾滋病毒抑制活性的冬凌草。冬凌草为唇形科植物碎米桠(Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara)的干燥地上部分。夏、秋二季采割，晒干。本品茎呈方柱形，长80～70cm，表面红褐色，有柔毛；质硬，断面淡绿色或黄白色。页对生，有柄；叶片皱缩，展平后呈卵形或宽卵形，长6.5～13cm，宽3～6cm；先端渐尖，基部宽楔形、截形或近心形，急缩下延至柄，边缘有粗锯齿；上表面绿棕色，有腺点，下表面绿色，沿叶脉披疏柔毛。聚伞状圆锥花序顶生，花小，花萼筒状钟形，5齿裂，花冠二唇形。小坚果宽倒卵形，顶端无毛。气微香，味苦、甘，微寒。具有清热解毒，活血止痛功效。用于咽喉肿痛，扁桃体炎，蛇虫咬伤(中国药典一部，1977版)。
资料表明，冬凌草茎叶含挥发油，油中成份为α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯0.16～1％、柠檬烯(Limonene)0.16％、1.8桉油素(Cineole)0.33％、对-聚伞花素(P-Cymene)0.16％、王醛(Nonaldehyde)1.33％、癸醛(Decanal)1％b-、β-榄香烯(β-Elemene)20.23％、棕榈酸(Palmatic acid)6.6％。还得到两种二萜：冬凌草甲素(Oridinin)、乙素(Ponicidin)、丙素C20H26O6、丁素C20H30O6、己素、戊素C23H32O6、庚素、辛素以及α-香树脂醇(α-Amyrin)和五个未知结构成份。此外，根、茎和叶尚含微量元素铁、锌、锰、铜、铬、镍、钴、钼、硒等。
中国发明专利和专利申请CN94110281.4、95100286.4、95113606.2、95112013.1、97121836.6、98111550.0、0113767.3、01115446.2、02125611.x涉及抗肿瘤中药，其中包含冬凌草；中国发明专利申请CN03118782.x涉及抗炎、抗病毒的中药，其中也包含冬凌草。然而，这些专利申请揭示的都是一些复方方剂，而且无一提及冬凌草的抗艾滋病毒作用，更无一揭示抗艾滋病毒的活性部位。
本发明者曾通过实验研究，提取到冬凌草抗HIV的粗提物。将冬凌草粉末用乙醇迴流或室温浸泡，低速离心所得沉淀再经水提和乙醇沉淀后制成粗提物DBSHH和DBSHE。两者均有体外抗HIV活性，以DBSHH为佳。用凝胶层析柱Sephadex-G75将DBSHH进一步分离得到DBSHH-1、DBSHH-2、DBSHH-3和DBSHH-4，抗HIV活性以DBSHH-2为佳(CN200410017625.5)。
发明内容
本发明的目的是提供具有抗艾滋病毒活性的冬凌草提取物(DBS)。
本发明的第二个目的是提供冬凌草提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。
本发明提供的抗艾滋病毒的冬凌草提取物包含多糖有效部位，所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物的脱鞣质部分，所述多糖有效部位无紫外吸收，对碘不显色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反应呈紫红色。
所述多糖有效部位是冬凌草水提醇沉物脱鞣质部分的醇提物。
所述醇提物是40％、60％、70％、80％或90％EtOH沉淀多糖DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90。
所述醇提物中DBS-70多糖经36DM透析袋透析得到DBS-70-6多糖，其平均分子量为7900，含四种单糖：鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它们之间的摩尔比为1.0∶2.2∶1.4∶1.0。
所述多糖有效部位的制备方法是将DBS水提醇沉物溶解于水中，再用明胶溶液沉淀完全，脱去鞣质，得到澄清溶液。
所述DBS脱鞣质部分用终浓度为40％、60％、70％、80％、90％乙醇沉淀得到沉淀多糖DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90。
所述DBS-70多糖用36DM透析袋透析72小时，再经冷冻干燥后，得到DBS-70-6多糖。
附图说明
图1为多糖DBS-70-6分子量测定的色谱图。
图2为多糖DBS-70-6的气相色谱分析图。
具体实施方式
下面实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1  冬凌草提取物的制备
DBS水提醇沉物169克，加入2000ml水溶解，加入400ml明胶溶液(3.2g明胶溶于600ml水中形成溶液)。静置过夜，使之沉淀完全。离心弃去沉淀，得到透明澄清溶液。取少量澄清液，滴加明胶溶液若无沉淀产生，说明鞣质等多酚类物质沉淀完全。
实施例2  冬凌草提取物的细胞毒性试验
在一96孔培养板中，将制备物，即实施例1所得澄清液系列稀释，每三孔为一样品，然后加入适量实验室T-细胞株MT-2。在CO2培养箱37℃培养3天后，对细胞进行染色，测定OD值，经阅读软件转换成或细胞生存百分率。如果植被物毒性很强，则细胞会全部或大部死亡，活细胞生存百分率为零或很低；反之，制备物无毒性或低毒性，活细胞生存百分率则接近100或很高。见表1。
                表1  样品浓度(μg/ml)  存活率(％)  480  64  240  88  120  90  60  95  30  106  15  94  7.5  74  3.75  64
实施例3  冬凌草提取物抗艾滋病毒实验
在一96孔培养板中，根据实施例2所得的结果，选择制备物起始浓度作系列稀释。加适量滴度的实验室艾滋病毒株(HIV-IIIB)与细胞株MT-2。在CO2培养箱37℃培养6天左右后，对细胞进行染色，测OD值，经阅读软件转换成未感染细胞百分率。如果制备物对病毒无抑制作用，则被感染的细胞最终成多核巨细胞而破裂死亡(合胞体)；如有抗病毒作用，则有不同程度的未感染细胞存活。以存在50％未感染细胞的制备物浓度为有效浓度。见表2。
                            表2  DBS-A  DBS-B  样品浓度(μg/ml)  存活率(％)  样品浓度(μg/ml)  存活率(％)  100  61  100  70  50  62  50  67  25  76  25  71  12.5  90  12.5  48  6.25  86  6.25  51  3.125  89  3.125  27  1.5625  80  1.5625  14  0.78  52  0.78  3
经上述抗HIV筛选，实施例1所得提取物为抗艾滋病毒的有效部位。此部位紫外无吸收，对碘不显色，甲醇和丙酮中不溶，Molish反应呈紫红色，显示为多糖化合物。
实施例4  冬凌草提取物的初步分离
经Sepabead SP825大孔树脂对冬凌草提取物进行初步分离，洗脱液依次为水、10％EtOH、20％EtOH、30％EtOH、50％EtOH，从而得到五个洗脱流份。
实施例5  冬凌草提取物洗脱流份的细胞毒性试验
本实施例参照实施例2的步骤进行，其中制备物为实施例4所得的五个洗脱流份。
实施例6  冬凌草提取物洗脱流份的抗艾滋病毒实验
本实施例参照实施例3的步骤进行，其中制备物最大浓度为实施例5所得的最大浓度。
分别测试抗HIV活性，结果显示实施例4所得五个洗脱流份均呈阳性，而且抗病毒作用未表现出明显差异。这说明DBS多糖化合物的抗HIV作用不是由其中的某一类多糖引起，而是全部多糖都具有这方面的作用。见表3。
                                        表3  DBS-5-1  DBS-5-4  DBS-5-7  DBS-5-11  样品浓度  (μg/ml)  存活率  (％)  样品浓度  (μg/ml)  存活率  (％)  样品浓度  (μg/ml)  存活率  (％)  样品浓度  (μg/ml)  存活率  (％)  240  76  250  63  240  78  260  83  120  91  125  78  120  74  130  73  60  93  62.5  96  60  95  65  94  30  87  31.25  101  30  97  32.5  85  15  21  15.63  88  15  101  16.25  58  7.5  3  7.813  19  7.5  77  8.125  21  3.75  2  3.906  57  3.75  39  4.063  6  1.875  0  1.953  88  1.875  41  2.031  38
实施例7  冬凌草提取物的纯化
DBS脱鞣质部分(多糖)以适量水完全溶解，加入无水乙醇，使乙醇的终浓度为40％，部分多糖发生沉淀，将其离心，所得沉淀命名为粗多糖DBS-40，上清液定量加入无水乙醇，使乙醇的终浓度为60％，又有部分多糖发生沉淀，将其离心，得到粗多糖DBS-60；同法分别得到70％、80％、90％EtOH沉淀多糖DBS-70、DBS-80、DBS-90。
经抗HIV活性测试，显示DBS-40、DBS-60、DBS-70、DBS-80、DBS-90均呈现抗病毒作用。
实施例8  DBS多糖化合物的透析
根据实施例2的结果，从实验的可操作性和实验难度考虑，选择对DBS-70、DBS-90进行透析处理。采用36DM透析带(购自国药集团化学试剂有限公司，20050907)透析72小时(透析缓冲液为自来水)，除去小分子物质。DBS-90透析后，透析袋内无残余；DBS-70透析后，透析袋内有残余，将其冷冻干燥，得到DBS-70-6较为纯净多糖组分。
实施例9  DBS多糖化合物DBS-70-6的分子量测定
根据实施例3的结果，采用HP GPC法测定，以0.1M KH2PO4作为流动相，进样量是40μl，标准右旋糖酐作为标准品，分子量分别为21400、84400、133800、2000000。由标准品的分子量的对数对其在柱上的保留时间作图，得到标准曲线：y＝-0.4109x+8.8121(R2＝0.9999)，同时测定DBS多糖化合物DBS-70-6在柱上的保留时间，结果显示保留时间为11.952分钟。根据标准曲线，由此保留时间11.952分钟，换算得到DBS多糖化合物分子量为7900。
实施例10  多糖DBS-70-6的组成
称取10mg样品于试管中，加入3ml 2M三氟乙酸，充氮后封管，120℃水解2h，减压浓缩去TFA后，溶于水，室温下加入25mg硼氢化钠，还原4h，加入冰醋酸中和，再用冰醋酸-甲醇(1∶9)混合液反复多次蒸去生成的硼酸，所得粉末经充分干燥后，用醋酐于110℃乙酰化2h。然后经气相色谱分析(Shimadzu QP-5050-A型气相仪，5％OV225/AW-DMC-Chromosorb W填充柱)其成份，检测到四种单糖，即鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖及葡萄糖，它们之间的摩尔比为1.0∶2.2∶1.4∶1.0，并且糖醛酸反应呈阴性。
图1及图2显示气相色谱结果。其中：  峰号  峰面积％  单糖  1  0.15  鼠李糖  2  0.33  阿拉伯糖  3  0.21  半乳糖  4  0.15  葡萄糖