一种纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法.pdf

本发明公开了一种纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法。其过程是将纤维蛋白原粉末溶解于生理盐水中，配制纤维蛋白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制凝血酶氯化钙溶液；将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的溶液同时注入到聚合物多孔支架中，获得纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架。本发明制备的纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架具有复合结构特征，其中聚合物多孔支架可以提供一定的力学强度和软骨细胞生长的空间，而纤维蛋白凝胶可以促进软骨细胞的迁移、增殖及分化，加速软骨组织的修复，具有很强的修复组织缺损的应用价值。本发明制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高。

权利要求书
1.  一种纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法，其步骤如下：
1)将纤维蛋白原粉末溶解于生理盐水中，配制浓度为10～40mg/ml的纤维蛋白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制浓度为1～20U/ml的凝血酶氯化钙溶液；
2)将聚合物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导入到聚合物多孔支架中；将导入乙醇的支架浸入到三蒸水中，反复进行先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成水，直至无乙醇残留；
3)将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的溶液同时注入到聚合物多孔支架中，将支架置于37℃恒温烘箱中孵育5～10分钟，使纤维蛋白原完全凝胶，即获得纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架。

2.  按权利要求1所述的纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法，其特征在于所说的聚合物多孔支架是聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚氨酯或胶原多孔支架。

说明书一种纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法
技术领域
本发明涉及一种组织再生支架的制备方法，尤其是纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法。
背景技术
软骨损伤是目前常见的疾病，由于关节炎或运动创伤所造成的关节软骨损伤给许多病人带来痛苦。软骨的代谢活跃而修复能力有限，没有血管，在损伤之后不能形成纤维凝块，没有炎性细胞迁移进入，也没有血管未分化细胞进入损伤的部位，所以不易自行进行修复。另外，软骨本身在损伤部位缺乏未分化的细胞，损伤之后没有软骨细胞迁移生长到损伤的软骨之中。而且，随着年龄的增长，软骨细胞的分裂能力逐渐降低，产生细胞外基质的能力也随之降低。迄今为止，临床上仍然缺少有效的方法修复受损的软骨组织。应用再生医学的方法和原理来进行软骨组织的修复是目前的一个重要手段，且取得了良好的效果。其中，软骨修复支架在软骨再生中起着十分重要的作用。
人体的软骨属于结缔组织，其中含有少量的软骨细胞和大量细胞间质。软骨细胞散在于软骨基质内的软骨陷窝内，陷窝周围的基质染色较深称为软骨囊。幼稚的软骨细胞较小，常单个分布于关节软骨的边缘区，呈扁圆形。由边缘向中央软骨细胞的体积逐渐增大，呈椭圆形或圆形，具有较明显的软骨囊。幼小的软骨细胞可分裂，深部成熟的软骨细胞常2～8个成群分布。软骨细胞间质的化学成分主要包括胶原蛋白、蛋白多糖和少量的非胶原蛋白。软骨组织中的胶原主要为II型胶原，占胶原总量的90％以上。II型胶原纤维在软骨内呈三维网状分布，为关节软骨提供抗张强度。蛋白多糖通过连接蛋白以非共价键形式与透明质酸结合形成巨大的蛋白多糖聚合体。蛋白多糖聚合体分子链上含有丰富的负酸根离子，可以结合大量的水形成水凝胶，为软骨提供抗压强度和弹性。水分占软骨组织全重的75％，其中含有大量正离子以平衡蛋白多糖分子中的负电荷，并含有许多软骨细胞所需的营养物质和细胞代谢产物。软骨组织内无血管，但由于软骨基质富含水分，营养物质易于渗透，故软骨细胞仍能获得必要的营养。
软骨组织中的其它非胶原蛋白如锚着蛋白、纤维粘连蛋白等通过与细胞表面受体和其它大分子之间的相互作用将软骨细胞粘连在软骨基质上，并稳定软骨基质的结构。
根据软骨基质成分和组织结构的不同，软骨分为透明软骨、纤维软骨和弹性软骨。关节软骨属于透明软骨，它的特点是纤维含量比纤维软骨和弹性软骨少，而蛋白多糖水凝胶含量相对较多，软骨基质为透明状。成熟的关节软骨根据其细胞和基质的变化可分为浅表层、中层、深层和钙化层。其中中层和深层中的蛋白多糖含量较高。
人体内的软骨具有极特殊的力学性能。例如关节软骨具有很好的弹性和韧性，可承受较大的负荷，同时具有光滑的表面，使关节活动时的摩擦力极小。软骨组织一旦缺损，将给患者带来巨大的痛苦和不便。
在正常软骨中，成熟的软骨细胞四周包围着由大量胶原和蛋白多糖组成的、高含水高交联度的细胞外基质，软骨细胞呈球形。然而，当软骨细胞被培养在聚合物多孔支架上时，软骨细胞呈扁平形粘附在支架孔壁上。以往的研究表明异常的生长环境对于软骨细胞的正常分化和表型是不利的。另一方面，软骨细胞可以在水凝胶材料中维持正常的球形，同时维持正常的软骨细胞表型。但是水凝胶的机械强度普遍不高，在体内外培养和植入手术中，非常容易因受力而破损或碎裂。因此，在软骨修复材料的设计中，应模拟软骨细胞的天然生长环境，构建具有可以促进软骨细胞正常生长和功能表达的修复支架。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以模拟人体天然软骨的纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法。
本发明的纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
1)将纤维蛋白原粉末溶解于生理盐水中，配制浓度为10～40mg/ml的纤维蛋白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制浓度为1～20U/ml的凝血酶氯化钙溶液；
2)将聚合物多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导入到聚合物多孔支架中；将导入乙醇的支架浸入到三蒸水中，反复进行先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成水，直至无乙醇残留；
3)将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶的溶液同时注入到聚合物多孔支架中，将支架置于37℃恒温烘箱中孵育5～10分钟，使纤维蛋白原完全凝胶，即获得纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架。
本发明中，所说的聚合物多孔支架可以是聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚氨酯或胶原多孔支架。
本发明的有益效果在于：
本发明制备的纤维蛋白凝胶填充的聚合物多孔支架具有复合结构特征，其中聚合物多孔支架可以提供一定的力学强度和软骨细胞生长的空间，而纤维蛋白凝胶是来源于血液的制品，具有良好的生物相容性和降解性能，其中含有大量的活性因子，具有更好的促进软骨细胞的迁移、增殖及分化性能，加速软骨组织的修复。因此，该复合体系具有很强的修复组织缺损的应用价值。本发明制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高。
附图说明
图1是纤维蛋白凝胶填充聚乳酸多孔支架的激光共聚焦显微镜照片，其中纤维蛋白凝胶用荧光素染色；
图2是不同浓度的纤维蛋白原的凝胶化曲线；
图3是不同浓度的纤维蛋白原填充聚乳酸支架的填充率；
图4是纯聚乳酸多孔支架和纤维蛋白凝胶填充支架的力学性能；
图5是软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充支架中的活性；
图6是软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充聚乳酸支架中的GAG的分泌；
图7是激光共聚焦显微镜观测软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充聚乳酸支架中的分布及形态(一周)，其中细胞采用荧光素二乙酸酯的方法进行染色；
图8是扫描电镜观测软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充聚乳酸支架中的分布及形态(一周)。
具体实施方法
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实例1：
1)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，于37℃恒温水浴中孵育10分钟，使纤维蛋白原充分溶解，纤维蛋白原溶液的浓度为10mg/ml；将凝血酶溶解于40mM氯化钙溶液中，放入37℃恒温水浴中孵育10分钟，配制成1U/ml的溶液；
2)将聚乳酸多孔支架浸入到乙醇中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇导入到聚合物多孔支架中，直到支架完全地浸入到乙醇中；将导入乙醇的支架浸入到三蒸水中，采用先抽真空，后恢复压力的方法，将乙醇置换成水，反复进行置换10次，每次10分钟，至无乙醇残留；
3)将步骤1)配制的等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液同时注入到聚乳酸多孔支架中，将支架置于37℃恒温烘箱中孵育10分钟，使纤维蛋白原完全凝胶，即获得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。凝胶在聚乳酸支架中的分布见图1。
实例2：
1)用实例1步骤1)的方法配制纤维蛋白原和凝血酶溶液，但纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/ml。
步骤2)和3)同实例1的步骤2)和3)，得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。
实例3：
1)用实例1步骤1)的方法配制纤维蛋白原和凝血酶溶液。但凝血酶溶液的浓度为20U/ml。
步骤2)和3)同实例1的步骤2)和3)，得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。
实例4：
步骤1)同实例1步骤1)。
步骤2)同实例1的步骤2)，但采用的是聚乳酸-乙醇酸共聚物多孔支架。
步骤3)同实例1步骤3)，得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。
实例5：
步骤1)同实例1步骤1)。
步骤2)同实例1的步骤2)，但采用的是聚氨酯多孔支架。
步骤3)同实例1步骤3)，得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。
实例6：
步骤1)同实例1步骤1)。
步骤2)同实例1的步骤2)，但采用的是胶原多孔支架。
步骤3)同实例1步骤3)，得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。
实例7：
步骤1)和2)同实例1步骤1)和2)。
步骤3)同实例1步骤3)，但孵育时间为5分钟，得纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架。
实例8：
1)用实例1步骤1)的方法配制纤维蛋白原和凝血酶溶液，纤维蛋白原的浓度分别为10mg/ml，20mg/ml和40mg/ml，凝血酶溶液的浓度为10U/ml。
2)将等体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液混合，利用紫外光谱测定了不同纤维蛋白原浓度时的凝胶时间，见图2。
实例9：
1)用实例8步骤1)的方法配制各种浓度的纤维蛋白原和凝血酶溶液。
步骤2)和3)同实例1的步骤2)和3)。
4)利用称重的方法计算纤维蛋白凝胶在聚乳酸支架中的填充率。图3为不同浓度(纤维蛋白原凝胶后的最终浓度)的纤维蛋白原填充聚乳酸支架的填充率。
实例10：
1)步骤1)同实例1步骤1)，但纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/ml，凝血酶溶液的浓度为10U/ml。
步骤2)和3)同实例1步骤2)和3)。利用力学测试仪测定无凝胶填充聚乳酸支架和纤维蛋白凝胶填充聚乳酸支架的力学性能，结果见图4，可见填充后支架的力学强度得到提高。
实例11：
步骤1)同实例1步骤1)，但纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/ml，凝血酶溶液的浓度为10U/ml。纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液首先用220nm过滤膜过滤灭菌。然后将软骨细胞与纤维蛋白原溶液均匀混合。软骨细胞的最终浓度为100万/ml。
步骤2)和3)同实例1步骤2)和3)。
将制备的纤维蛋白凝胶填充的聚乳酸多孔支架放到24孔培养板中，加入培养液，在培养箱中进行体外培养。细胞活性采用3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)方法检测。图5为软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充支架中的活性随培养时间的变化，可见软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充的支架中具有更高的活性。采用1，9-二甲基亚蓝显色剂显色-紫外检测的方法测定细胞分泌的硫酸粘多糖(GAG)，结果见图6，可见软骨细胞在纤维蛋白凝胶填充的支架中能够分泌更多的GAG。细胞培养一周后的形态采用激光共聚焦显微镜和扫描电镜进行观测，结果分别见图7和图8。