鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板.pdf

一种鉴定肝纤维化及肝硬化之分子标记及其微阵列系统板，本发明至少包括28个蛋白质其中之一或者至少包括编码这些蛋白质的基因其中之一，在这些蛋白质或基因其中有8个为上调节基因，13个为下调节基因，9个为治疗标靶，本发明为具筛选能力的分子标记，以早期警告严重肝纤维化或肝硬化的发生，本发明的分子标记也是做为对药物设计具潜力的标靶。

权利要求书
1.   一种鉴定肝纤维化及肝硬化之分子标记，至少包括下列蛋白质其中之一或者至少包括编码下列蛋白质的基因其中之一：
白蛋白；丙氨酰(膜)氨肽酶；膜联蛋白A2；载脂蛋白F；淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白；α2-糖蛋白1，锌结合；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶；补体成分8，α肽；趋化因子(C-C基元)配基19；补体因子H相关4；补体因子H相关5；胶原，I，α2；胶原，III，α1；胶原，XVIII，α1；核心蛋白聚糖；皮肤桥蛋白；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶；糖原合成酶2；凝溶胶蛋白；干扰素γ；乳酸脱氢酶B；内腔蛋白；中间α(球蛋白)抑制因子H1；血小板衍生生长因子受体，α肽；S100钙结合蛋白A4；甲状腺素受体相关蛋白1；金属肽酶抑制因子1；以及肿瘤坏死因子。

2.   一种鉴定肝纤维化及肝硬化之分子标记的微阵列系统板，至少包括下列蛋白质其中之一或者至少包括编码下列蛋白质的基因其中之一：
白蛋白；丙氨酰(膜)氨肽酶；膜联蛋白A2；载脂蛋白F；淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白；α2-糖蛋白1，锌结合；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶；补体成分8，α肽；趋化因子(C-C基元)配基19；补体因子H相关4；补体因子H相关5；胶原，I，α2；胶原，III，α1；胶原，XVIII，α1；核心蛋白聚糖；皮肤桥蛋白；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶；糖原合成酶2；凝溶胶蛋白；干扰素γ；乳酸脱氢酶B；内腔蛋白；中间α(球蛋白)抑制因子H1；血小板衍生生长因子受体，α肽；S100钙结合蛋白A4；甲状腺素受体相关蛋白1；金属肽酶抑制因子1；以及肿瘤坏死因子。

3.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中所述蛋白质中至少有一个用以做为分化肝纤维化阶段。

4.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中所述蛋白质中至少有一个供应为用来检测严重的肝纤维化或肝硬化的筛选蛋白质的分子标记。

5.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中为了筛选肝纤维化，所述蛋白质中有8个为上调节基因：
膜联蛋白A2；胶原，I，α2；胶原，III，α1；凝溶胶蛋白；乳酸脱氢酶B；内腔蛋白；血小板衍生生长因子受体，α肽；以及金属肽酶抑制因子1。

6.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中为了筛选肝纤维化，所述蛋白质中有13个为下调节基因：
白蛋白；丙氨酰(膜)氨肽酶；载脂蛋白F；α2-糖蛋白1，锌结合；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶；补体成分8，α肽；补体因子H相关4；补体因子H相关5；胶原，XVIII，α1；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶；糖原合成酶2；中间α(球蛋白)抑制因子H1；以及甲状腺素受体相关蛋白1。

7.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中所述蛋白质中至少有一个提供为肝纤维化及肝硬化修复的指示剂。

8.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中所述蛋白质中有9个为治疗标靶：
血小板衍生生长因子受体，α肽；S100钙结合蛋白A4；胶原，III，α1；趋化因子(C-C基元)配基19；核心蛋白聚糖；皮肤桥蛋白；淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白；肿瘤坏死因子；以及干扰素γ。

9.   根据权利要求1或2所述的分子标记或微阵列系统板，其中所述蛋白质中至少有一个做为对肝脏损坏的预告。

10.   一种抗肝纤维化及抗肝硬化药物，至少包括权利要求1所述的分子标记其中之一。

11.   一种于筛选方法中做为影响肝纤维化或肝硬化过程的混合物，至少包括权利要求1所述的分子标记其中之一。

12.   一种用于判定肝脏疾病的免疫诊断套件，至少包括权利要求1所述的分子标记其中之一。

说明书鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板
技术领域
本发明是有关于肝脏疾病的检测，且特别是有关于一种鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板。
背景技术
许多疾病包括肝炎病毒感染、酒精滥用和长期暴露在有机溶剂中引起的肝损伤。肝损害的结果是发炎、组织硬化以及甚至是癌症的形成。肝发炎的持续攻击不仅仅触发了很多的生化事件，例如免疫反应、细胞激素和化学激素的分泌、坏疽、肝的星状细胞活化和氧化的压力，同时也触发了细胞和结构的重组，亦即肝纤维化和肝硬化(Marcellin等人，在2002年Hepatology第36期中Fibrosis and disease progression in hepatitis C第47～56节所发表的论述)。
肝纤维化所描述的是在肝细胞修复和修补创伤中的过程，非常像在创伤上的皮肤“结疤”的过程。结构上的重塑也是包含细胞外基质的堆积以形成结疤组织的特殊现象之一。肝损伤的重复修补的结果是结疤组织的堆积和肝细胞功能的丧失，例如解毒、新陈代谢的活动，导致了最终的严重后果-肝硬化。严重的肝硬化为肝疾病的死亡主因之一，其余则为肝细胞癌(此即肝癌)。
丙型肝炎的传染单独估计达世界人口的3％，其流行常伴随着乙型肝炎传染和酒精中毒引起的肝脏损伤。无适当治疗介入疾病过程的持续肝发炎和纤维化将导致肝脏变硬、肿胀以及最终放弃运作(代偿性机能减退)，如众所周知的肝硬化。肝炎要变得严重以及不可逆的结果需要20至25年的时间，但其时常不为病人所注意。
虽然当前的医药协定建议，对某些范围而言，肝纤维化及肝硬化经过慢性肝炎的治疗可能是可以回复的，但是并无适当的治疗可以充分的处理肝纤维化及肝硬化。在解决像这样垮掉的药物问题的发展中，肝脏纤维化的医疗是沉重的。在此时，可以有效地从患有慢性肝损害的病人身上检测到肝纤维化的一个血液筛选测试，这对医疗人员而言是极具需求的。
发明内容
因此，本发明的目的之一就是在提供一种鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板，能提供一个筛选测试，以从患有慢性肝损害的病人身上，来判定肝硬化。
此外，本发明的再一目的是提供一种鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记的微阵列系统板(microarray panel)，其能筛选笼罩在风险下的病人，以早期警告严重肝纤维化或肝硬化的发生，且对药物设计上，本发明的分子标记为甚具潜力的标靶。
本发明提出一种鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板，至少包括下列蛋白质其中之一或编码这些蛋白质的基因其中之一：
白蛋白(ALB)；丙氨酰(膜)氨肽酶(ANPEP)；膜联蛋白A2(ANXA2，annexin A2)；载脂蛋白F(APOF)；淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白(APP)；α2-糖蛋白1，锌结合(AZGP1)；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)；补体成分8，α肽(C8A)；趋化因子(C-C基元)配基19(CCL 19)；补体因子H相关4(CFHR4)；补体因子H相关5(CFHR5)；胶原，I，α2(COL 1A2)；胶原，III，α1(COL3A1)；胶原，XVIII，α1(COL 18A1)；核心蛋白聚糖(DCN)；皮肤桥蛋白(DPT)；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶(FTCD)；糖原合成酶2(GYS2)；凝溶胶蛋白(GSN)；干扰素γ(INFG)；乳酸脱氢酶B(LDHB)；内腔蛋白(LUM)；中间α(球蛋白)抑制因子H1(ITIH1)；血小板衍生生长因子受体，α肽(PDGFRA)；S100钙结合蛋白A4(S100A4)；甲状腺素受体相关蛋白1(THRAP1)；金属肽酶抑制因子1(TIMP1)；以及肿瘤坏死因子(TNF)。
依照较佳实施例所述的鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板，由于上述28个蛋白质/基因可用于肝相关并发症的检测，也能为治疗此类并发症甚具潜力的药物标靶，本发明可以治疗或减缓肝硬化的进行。
此外，从本发明的28个蛋白质候选者中，包含一个或多个的候选者所形成的检测，可由以抗体为主的方法，例如酶联免疫测定法(ELISA，Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay)，所检测到。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
图1出示为应用在本发明中的28个基因的图表。
图2出示为筛选肝硬化的分子标记板的图表。
图3出示为由路径分析所衍生的具潜力的治疗标靶板的图表。
图4出示为分子标记基因分辨F0/F1族群和F3/F4族群病人的预测能力的图表。
图5为依据本发明的一个较佳实施例，不同的基因的表达水平的分析。
图6为依据本发明的一个较佳实施例，上调基因在高度纤维化严重肝活体切片检查中的路径分析。
具体实施方式
以下将参照相关附图，说明本发明较佳实施例，其中相同的组件将以相同的参照符号加以说明。
图1出示为应用在本发明中的28个基因的图表。如图1所示，本发明所提供的一种鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板，至少包括下列蛋白质其中之一或编码这些蛋白质的/基因其中之一：
白蛋白(ALB，albumin)；丙氨酰(膜)氨肽酶(ANPEP，alanyl[membrane]aminopeptidase)；膜联蛋白A2(ANXA2，annexin A2)；载脂蛋白F(APOF，apolipoprotein F)；淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白(APP，amyloid beta[A4]precursor protein)；α2-糖蛋白1，锌结合(AZGP 1，alpha-2-glycoprotein 1，zinc-binding)；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT，betaine-homocysteinemethyltransferase)；补体成分8，α肽(C8A，complement component 8，alphapolypeptide)；趋化因子(C-C基元)配基19(CCL19，chemokine[C-C motif]ligand 19)；补体因子H相关4(CFHR4，complement factor H-related 4)；补体因子H相关5(CFHR5，complement factor H-related 5)；胶原，I，α2(COL 1A2，collagen，type I，alpha 2)；胶原，III，α1(COL3A 1，collagen，typeIII，alpha 1)；胶原，XVIII，α1(COL18A1，collagen，type XVIII，alpha 1)；核心蛋白聚糖(DCN，decorin)；皮肤桥蛋白(DPT，dermatopontin)；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶(FTCD，formiminotransferase cyclodeaminase)；糖原合成酶2(GYS2，glycogen synthase 2)；凝溶胶蛋白(GSN，gelsolin)；干扰素γ(INFG，interferon gamma)；乳酸脱氢酶B(LDHB，lactatedehydrogenase B)；内腔蛋白(LUM，lumican)；中间α(球蛋白)抑制因子H1(ITIH1，inter-alpha[globulin]inhibitor H1)；血小板衍生生长因子受体，α肽(PDGFRA，platelet-derived growth factor receptor，alpha polypeptide)；S100钙结合蛋白A4(S100A4，S100calcium binding protein A4)；甲状腺素受体相关蛋白1(THRAP1，thyroid hormone receptor associated protein 1)；金属肽酶抑制因子1(TIMP1，TIMP metallopeptidase inhibitor 1)；以及肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有一个蛋白质提供为肝纤维化分化阶段的蛋白质。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有一个蛋白质供应为筛选蛋白质的分子标记，以检测严重的肝纤维化或肝硬化，例如具有Metavir score分级(一种评估纤维化程度的软件分析)为F3或F4的肝脏检体样品。图2出示为筛选肝硬化的分子标记板的图表。如图2所示，本发明的分子标记中有8个蛋白质为上调基因(up-regulated genes)以筛选肝硬化，如下所示：
膜联蛋白A2(ANXA2)；胶原，I，α2(COL1A2)；胶原，III，α1(COL3A1)；凝溶胶蛋白(GSN)；乳酸脱氢酶B(LDHB)；内腔蛋白(LUM)；血小板衍生生长因子受体，α肽(PDGFRA)；以及金属肽酶抑制因子1(TIMP1)。
同时，图2也出示了本发明的分子标记中有13个蛋白质为下调基因(down-regulated genes)以筛选肝硬化，如下所示：
白蛋白(ALB)；丙氨酰(膜)氨肽酶(ANPEP)；载脂蛋白F(APOF)；α2-糖蛋白1，锌结合(AZGP1)；甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)；补体成分8，α肽(C8A)；补体因子H相关4(CFHR4)；补体因子H相关5(CFHR5)；胶原，XVIII，α1(COL18A1)；亚胺甲基转移酶环化脱氨酶(FTCD)；糖原合成酶2(GYS2)；中间α(球蛋白)抑制因子H1(ITIH1)；以及甲状腺素受体相关蛋白1(THRAP1)。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有1个蛋白质提供做为修复肝纤维化及肝硬化的指示剂。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有1个蛋白质可做为标靶，以发展抗肝纤维化及抗肝硬化药物。图3出示为由路径分析所得到的具潜力的治疗标靶板的图表。如图3所示，本发明的分子标记中有9个蛋白质为治疗标靶，如下所示：
血小板衍生生长因子受体，α肽(PDGFRA)；S100钙结合蛋白A4(S100A4)；胶原，III，α1(COL3A1)；趋化因子(C-C基元)配基19(CCL19)；核心蛋白聚糖(DCN)；皮肤桥蛋白(DPT)；淀粉状蛋白β(A4)前体蛋白(APP)；肿瘤坏死因子(TNF)；以及干扰素γ(INFG)。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有1个蛋白质可于筛选方法中，做为影响肝纤维化或肝硬化过程的混合物。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有1个蛋白质可做为对肝脏损坏的预告。
在较佳的实施例中，上述的分子标记中至少有1个蛋白质可使用于免疫诊断套件中，以判定肝脏疾病。
本发明为由具有逐渐纤维化阶段肝组织的基因表现数据图表而来的研究结果，其由慢性肝炎病人所得到。不同表现基因的板为由筛选的分子标记所判定及使用，以早期警告严重肝纤维化/肝硬化的发生，并做为对药物设计具潜力的标靶。
由上调基因中，本发明构建了一条生化路径，其以一个重要的基因-肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)为中心。在该生化路径中，肿瘤坏死因子与转化生长因子β-1(TGFβ-1，transforming growth factorβ-1)和干扰素γ(INFG，interferon gamma)基因互相关联，而在早期的报告中，此二基因同时也与肝纤维化有很强的相关性。本发明提出了一件事：肿瘤坏死因子(TNF)为掌握肝纤维化严重性转变的关键，且其对治疗或减缓肝纤维化的进行为一个令人满意的选择。
本发明为一种鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板，能随着不同的分子标记而具有多样化的实施例。为简单而清楚的叙述，本发明收集一个总数为54份，由慢性丙型肝炎病人身上得来的肝脏活体针吸切片(liver needle biopsy)，以举例说明本发明的具体实施方法。图4出示为分子标记基因分辨F0/F1族群和F3/F4族群病人的预测能力的图表，其中PPV(positive predictive value)为正预测值，NPV(negative predictive value)为负预测值。在随后的图表中，为了一致性，以Metavir score分级(一种评估纤维化程度的软件分析)来分类肝样品纤维化程度以及评定两个单独病理评价，包含准则(inclusion criteria)以及排除准则(exclusion criteria)。
下列图表为依据Metavir score分级的微阵列系统分析和病人分布区域：
 Metavir score  F0  F1  F2  F3  F4  总数 病人数  10  11  13  10  10  54
肝脏活体切片的核糖核酸(RNA)萃取
收集在生理实验室的肝脏活体切片为放入含有核糖核酸样品储存液RNALater(Ambion，CA，USA)的微量试管(microliter tube)中并冷藏直至欲使用的时候。以TRIZOL法(TRIzol Reagent)由活体组织中提取核糖核酸。基本上，将试剂(Invitrogen，CA，USA)加入试管中以与肝组织混合，以及在以酚萃取后(Smith等人发表在2003年Hepatology 38(6)：1458-67中，Hepatitis C virus and liver disease：global transcriptional profiling andidentification ofpotential markers)，以塑料杵均质化。纯化后的核糖核酸储存在70％的乙醇并保存于零下80℃的低温冷冻中。核糖核酸的产率及浓度以分光光度计(spectrophotometer)检测。平均而言，5-15微克(μg)的总RNA(total RNA)可以由长度约5公厘(mm)的单一肝脏活体切片中纯化而得。为了检测所需，核糖核酸的质量由纳米芯片RNA 6000Nano chip(Aglient，CA，USA)以生物分析器Bioanalyzer 2100(Agilent，CA，USA)来分析。其18S/28S的比例应如同未受损的核糖核酸萃取物一样高过1.2。
微阵列系统实验
微阵列系统实验的执行是根据厂商(Affymetrix，CA，USA)所提供的使用手册。由肝组织所得来重2μg的总RNA为使用来合成接随着第2链合成的第1链互补脱氧核糖核酸(cDNA)。含生物素的互补RNA(BiotinylatedcRNA)为体外合成，并且在断裂缓冲液(fragmentation buffer)中以95℃培养15分钟。之后，15μg含生物素的互补RNA碎片在微阵列系统芯片(生物芯片)中与22,285个探针组U133A(Affymetrix，CA，USA)杂交。杂交为由微阵列系统箱Affymetrix microarray oven(Affymetrix，CA，USA)在45℃中引导进行16小时。在杂交完成后，接随着以GeneArray Scanner 2500(Affymetrix，CA，USA)撷取影像，将芯片利用GeneChipFluidics Station400(Affymetrix，CA，USA)在流体状态中清洗及染色。以软件Affymetrixmicroarray suite(version 5.0)做质量及初步数据的分析。
数据分析
程序上，由使用芯片Affymetrix human U133A chips所得的微阵列系统实验结果，以由接随GeneCluster 2.0(http://www.broad.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html，MA，USA)而来的BioConductor project(Irizarry等人发表的Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data，Nucleic Acids Res.31：e 15，2003；http://www.bioconductor.org/)的RobustMulti-array Average(RMA)方法做标准化(normalized)处理。软件GeneSpring software(Silicon Genetics，CA，USA)用于T试验分析。软件Genesis 1.5.0software则用以做族群分析(http://genome.tugraz.at/Software/GenesisCenter.html；Graz University of Technology，Graz，Austria)。
图5为依据本发明的一个较佳实施例，不同的基因表现的阶层分析。如图5所示，不同的基因表现的阶层分析(hierarchical analysis)的数据图表为由对54份具有肝纤维化的不同阶段的慢性C型肝炎病人身上的肝脏活体切片样品，以芯片Affymetrix GeneChip U133的实验所得的阶层分析。
图6为依据本发明的一个较佳实施例，上调基因的路径分析。如图6所示，上调基因的路径分析为由对肝脏活体切片检查为高度纤维化的严重性所得而来。
在信使核糖核酸(mRNA)水平的基因表现，与其所存在的蛋白质产物是息息相关的。人类蛋白质组组织(HUPO，Human Proteome Organization，http://www.hupo.org)已经做出一个研究计划以揭露所有可以在人类血清及血浆所能检测得到的蛋白质。总共有3020个蛋白质具有高度的精确度。本发明提供了一个沿着肝纤维化的过程，可以在人类蛋白质组组织的数据所验定的8个下调基因以及12个上调基因。这些因子可用在更进一步的研究中，以探讨可能可以标示纤维化严重性的血清蛋白质的分子标记。
在本发明中，鉴定肝纤维化及肝硬化的分子标记及其微阵列系统板以总数28个的蛋白质为特色，这些蛋白质可以使用于肝相关的并发症的检测，以及做为治疗这些并发症具潜力的药物标靶。
在一个例子中，肿瘤坏死因子(TNF)用于发展治疗或减缓肝纤维化过程的药物。
慢性丙型肝炎感染的病人为笼罩在肝纤维化的高度风险中。在另一个例子中，虽然某些常态性的检查治疗仍有可能停止纤维化的加重，但是病人的血液得时常地被抽取以做筛选检查来检测纤维化是否变得严重。这些测试包含本发明中一个或多个由28个候选者而来蛋白质的分子标记，可由以抗体为主的方法，例如酶联免疫测定法(ELISA，Enzyme-Linked Immuno-SorbentAssay)，所检测到。
在另外的情况中，未察觉肝状况的病人可以由纤维化的阳性反应所筛选到，以及提供做为更进一步的诊断及治疗。
再另一个例子为历经治疗的肝炎病人可以由本发明的单一或组合的蛋白质分子标记来测试他们的肝情况的恢复。同时这些分子标记也能做为对肝纤维化逆转的测试。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。