说明书用于干燥细胞形式的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2005年8月11日提交的美国申请流水号60/707,425和2006年3月31日提交的美国申请流水号60/788,133的优先权，并引证并入这两项申请的全部内容。
背景
病毒颗粒、细胞生物体(cellular organisms)和其它膜结合物质(membranebound materials)的干燥形式在制药产业和公共卫生产业中可以有很大的用处。干燥细胞形式(DCF)在长期储存、加工便利性、食品投递、农业和人类卫生应用等方面显示出效用。DCF的例子包括用于食品应用的干酵母，深低温保藏的细胞(例如血细胞)，以及用于基因投递的全细胞(Trsic-Milanovicet al.，J Serb.Chem.Soc.，66：435-42，2001；Diniz-Mendes et al.，Biotechnol.Bioeng.，65：572-8，1999；及Seville et al.，J.Gene Med.，4：428-37，2002)。
DCF通常由两种方法制备：i)冻干(lyophilization)或冷冻干燥(freeze-drying)，其涉及对细胞形式的含水悬液进行批量干燥(bulk drying)；或ii)深低温保藏(cryopreservation)，其涉及将高水平的冷冻保护剂(cryoprotectant)注入含水细胞悬液中，并且以最大程度减少细胞死亡的规定速率将悬液温度降低到0℃以下。冻干(或冷冻干燥)及深低温保藏的一个缺点是难于在保护大部分细胞物质的同时以较低的成本制备大量DCF(Kirsopand Snell，eds.，1984，Maintenance of Microorganisms：A Manual of LaboratoryMethods，London，Academic Press)。两种技术都受到跨脂质双层膜传质及相关的渗透应力(osmotic stress)的限制。
在卡介苗(BCG)疫苗的产业化制备中使用冻干。每年数以百万计的新生儿通过注射被给予BCG以防御结核(TB)，一种由称作结核杆菌(tuberclebacillus)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的细菌引起的疾病(Roche et al.，Trends Microbiol.，3：307-401，1995)。目前，TB是第六大致死因素，这种全球性传染病正在以3％的估计年增长率增加。AIDS的出现和它与结核的联系使得对新疫苗的需求日益紧迫，这是由于BCG在人体对TB感染的易感期内，典型地是人生命的前30年内，仅仅具有中等的效力(Fine，Lancet，346：1339-1345，1995)。BCG缺乏效力的可能原因之一是在生产出的DCF中BCG活力较低。
概述
本发明部分地基于喷雾干燥细胞物质的新方法和组合物的发现，这些方法和组合物展现显著的产物得率、较高的生物体活性(例如活力)和良好的粉末加工性能。干燥细胞形式，例如，由本文公开的组合物和方法产生的干燥细胞形式，具有低的含水量，可适用于对受试者吸入给药。干燥细胞形式在冰点以上(above freezing)的温度储存时保持一段时间的活性，为方便的储存(例如长期储存)和投递提供了可能。这些性质使得本文所述的方法和组合物可以用于疫苗制备物，例如，供注射给药、口服或吸入的疫苗制备物。
在一个方面中，本发明包括这样的干粉末，其具有少于约10％(例如少于约8％、5％、4％、3％、2％或1％)的水(例如游离水)、细胞物质、以及以干重计至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或更多)的赋形剂。在一些实施方案中，粉末是没有进行冷冻而制备的。在一些实施方案中，粉末是通过喷雾干燥制备的。在一些实施方案中，细胞物质包括细菌(例如分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、或卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin))、病毒、真核微生物、哺乳动物细胞(例如红细胞、干细胞、粒细胞、成纤维细胞或血小板)、膜结核细胞器、脂质体、基于膜的生物反应器、或基于膜的药物投递系统。在一些实施方案中，赋形剂的质量与细胞物质的单位数之比为至少0.25pg赋形剂每单位细胞物质(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000或20,000pg赋形剂每单位细胞物质)。在一些实施方案中，赋形剂质量对细胞物质质量之比为至少0.1(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或2000)。在一些实施方案中，当所述粉末包括活细胞(例如细菌)时，多于0.5％(例如1％、2％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％或更多)的细胞是活的。在一些实施方案中，在超过0℃(例如超过4℃、10℃、20℃、25℃、30℃、40℃或50℃)储存多于10天(例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120天)的时间后，粉末中的活细胞保持它们初始活性的多于1/1000(例如多于1/500、1/200、1/100、1/50、1/20或1/10)。在一些实施方案中，赋形剂包括亮氨酸、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖苷(dextran)、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、清蛋白、甘油、乙醇、或其混合物。在一些实施方案中，所述粉末不包括冷冻保护剂，例如添加的冷冻保护剂或者显著量的冷冻保护剂(例如不是所述赋形剂的冷冻保护剂)。在一些实施方案中，所述粉末不包括盐，例如添加的盐或者显著量的盐。所述干粉可以配制为药物组合物，例如用于吸入给药的药物组合物。
在另一个方面中，本发明包括制备包括细胞物质的干粉末的方法，所述方法是通过：提供水溶液，其中所述水溶液包括至少0.01mg/ml(例如，至少0.1、1、2、5、10、20、50、100或200mg/ml)赋形剂和至少105单位/ml(例如，至少106、107、108、109或1010单位/ml)的细胞物质，并且在产生包含所述细胞物质的、含有少于约10％(例如少于约8％、5％、4％、3％、2％或1％)重量的水(例如游离水)的干粉末的条件下，喷雾干燥所述溶液。在一些实施方案中，赋形剂质量与细胞物质单位数之比为至少0.25皮克赋形剂每单位细胞物质(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000或20,000pg赋形剂每单位细胞物质)。在一些实施方案中，赋形剂质量与细胞物质质量之比为至少0.1(例如至少0.25、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、100、200、500、1000或2000)。在一些其中细胞物质包括细菌(例如革兰氏阳性细菌)的实施方案中，所述溶液不含添加的盐或冷冻保护剂。在一些其中细胞物质包括真核细胞(例如哺乳动物细胞)的实施方案中，所述溶液可以含有盐或者其它足以使渗透压最小化的溶质。
在一些实施方案中，所述溶液包括以干重计至少10％(例如至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或更多)的赋形剂。在一些实施方案中，所述溶液包括少于1010单位/ml(例如少于109、108、107或106单位/ml)的细胞物质。在一些实施方案中，所述细胞物质包括细菌(例如分枝杆菌属的细菌，例如结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳动物细胞(例如红细胞、干细胞、粒细胞、成纤维细胞或血小板)、膜结合细胞器、脂质体、基于膜的生物反应器、或基于膜的药物投递系统。在一些实施方案中，所述赋形剂包括亮氨酸、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖苷、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、清蛋白、甘油、乙醇、或其混合物。在一些实施方案中，所述水溶液不含有冷冻保护剂，例如不是所述赋形剂的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述干粉末配制在药物组合物中，例如用于吸入给药的药物组合物。本发明还包括由所述新方法产生的、包含细胞物质的干粉末。
在另一个方面中，本发明包括将细胞物质喷雾，以通过减小渗透应力(osmotic stress)使对该物质的损伤最小化的方法。可以通过下面的方法来减小渗透应力：获得待喷雾干燥之细胞物质(本文中又称细胞)单位的半径初始值(Rc(0))；选择下列各项的值：(i)喷雾干燥器的入口和出口气体温度差(ΔT)；(ii)平均微滴大小(Rd)；(iii)溶剂的气化潜热(λ)；(iv)细胞物质的膜对于冷冻保护剂的液压渗透率(hydraulic permeability)(Lp)；(v)细胞外溶质的摩尔数(xes)；(vi)细胞内溶质的摩尔数(xis)；(vii)细胞外冷冻保护剂的摩尔数(xecp)；(viii)冷冻保护剂的初始细胞内浓度(Cicp(0))；和(ix)细胞数(ncells)；用这些值求出方程36
-1LpRgasTdRc(t)dt=xse43π[(kt+Rod2)3/2-ncells(Rc(t))3]-xsi43πRc(t)3-Vexcluded]]>
+σ[xcpe43π[(kt+Rod2)3/2-ncells(Rc(t))3]-Ccpi(0)]2Σn=1∞sin2(λn)-λnsin(λn)cos(λn)λn2-λnsin(λn)cos(λn)e-λn2Dcp*‾t/Rc(t)2---(36)]]>
的值，以及，若Rc(t)在预测的干燥时间内维持在最小极限和最大极限之内，则使用所选值的条件喷雾干燥所述细胞物质以使对所述物质的损伤最小化。在一些实施方案中，所述方法还包括确定预测的干燥时间。可以对最小极限和最大极限加以选择以使对所述物质的损伤最小化。例如，最小极限可以为初始半径的至少约60％(例如至少70％、80％、90％、95％、98％或99％)。
例如，最大极限可以为初始半径的至多160％(例如至多140％、125％、110％、105％、102％或101％)。在一些实施方案中，细胞物质包括细菌(例如分枝杆菌属的细菌，例如结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳动物细胞(例如红细胞、干细胞、粒细胞、成纤维细胞或血小板)、膜结合细胞器、脂质体、基于膜的生物反应器、或基于膜的药物投递系统。在一些实施方案中，在即将进行喷雾干燥前对细胞物质添加冷冻保护剂(例如添加到细胞物质之内或之外)。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述干粉末配制在药物组合物中，例如供吸入给药的药物组合物中。本发明还包括由所述新方法制备的、包含细胞物质的干粉末。
在又一个方面中，本发明包括产生干粉末的方法，其中所述干粉末包括少于约10％(例如少于约8％、5％、4％、3％、2％或1％)的水(例如游离水)，以及分枝杆菌属的细菌，所述方法是通过：提供水溶液，其中所述水溶液包括至少0.01mg/ml(例如至少0.1、1、2、5、10、20、50、100或200mg/ml)赋形剂和至少105菌落形成单位/ml(例如至少106、107、108、109或1010菌落形成单位/ml)的分枝杆菌属细菌，并且在产生含有少于约10％(例如少于约8％、5％、4％、3％、2％或1％)的水(例如游离水)，及所述分枝杆菌属细菌的干粉末的条件下，喷雾干燥所述溶液。在一些实施方案中，所述溶液相对每个菌落形成单位的分枝杆菌属细菌含有至少0.25pg的赋形剂(例如每个菌落形成单位至少0.5、1、2、5、10、15、20、25、35或50pg的赋形剂)。在一些实施方案中，所述水溶液不含冷冻保护剂，例如不是所述赋形剂的冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述分枝杆菌属细菌是结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)或卡介苗细菌。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述干粉末配制在药物组合物中，例如用于吸入给药或用于将该粉末在药用液体载体中复原(reconstitute)后注射给药的药物组合物中。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述干粉末配制成疫苗，例如用于吸入给药或用于将该粉末在药用液体载体中复原后注射给药的疫苗。本发明还包括通过所述新方法制备的、包含分枝杆菌属细菌的干粉末。
在另一个方面中，本发明包括含干粉末的疫苗组合物，所述干粉末含有少于约10％(例如少于约8％、5％、4％、3％、2％或1％)的水(例如游离水)，细胞物质，和以干重计至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或更多)的赋形剂。在一些实施方案中，所述干粉末是通过本文所述的方法制备的。所述疫苗组合物可以配制为用于肠胃外或粘膜(例如口服或吸入)施用。在一些实施方案中，细胞物质包括细菌(例如分枝杆菌属细菌，例如结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳动物细胞(例如红细胞、干细胞、粒细胞、成纤维细胞或血小板)、或膜结合细胞器。疫苗组合物可包含一种或多种佐剂。在一些实施方案中，将所述一种或多种佐剂与所述细胞物质一起喷雾干燥以形成所述干粉末。在一些实施方案中，在产生所述干粉末之后将它们与所述一种或多种佐剂混合。
本发明还包括通过对受试者(例如人或动物)施用包含本文所述干粉末的疫苗组合物的免疫方法。在一些实施方案中，所述干粉末是通过本文所述的方法制备的。疫苗组合物可以配制用于肠胃外或粘膜(例如口服或吸入)施用。在一些实施方案中，所述受试者是婴儿、儿童或成人。在一些实施方案中，所述细胞物质包括细菌(例如分枝杆菌属的细菌，例如结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、或卡介苗)、病毒、真核微生物、哺乳动物细胞(例如红细胞、干细胞、粒细胞、成纤维细胞或血小板)、或者膜结合细胞器。用于免疫方法中的疫苗组合物可以包括一种或多种佐剂。
在进一步的方面中，本发明包括储存本文所述的干粉末的方法，所述方法是通过将所述粉末保持在冰点以上的温度，例如4℃到50℃(例如4℃到40℃、4℃到30℃、4℃到20℃、4℃到10℃、10℃到50℃、10℃到40℃、10℃到30℃)，经过至少1天时间(例如至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长)。在一些实施方案中，将所述干粉末保持在环境温度。在一些实施方案中，所述干粉末是通过本文所述的方法制备的。在一些实施方案中，所述干粉末配制为药物组合物或疫苗组合物。
在另外的方面中，本发明包括运输包含干粉末的药物组合物或疫苗组合物的方法，所述干粉末含有少于约10％(例如少于约8％、5％、4％、3％、2％或1％)的水(例如游离水)，细胞物质，和以干重计至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或更多)的赋形剂。所述方法包括制备包含干粉末(例如通过本文所述方法制备的干粉末)的药物组合物或疫苗组合物，并在冰点以上的温度，例如4℃到50℃(例如4℃到40℃、4℃到30℃、4℃到20℃、4℃到10℃、10℃到50℃、10℃到40℃、10℃到30℃)，运输所述药物组合物或疫苗组合物。在一些实施方案中，在环境温度运输所述药物组合物或疫苗组合物。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员所知道的相同的意义。尽管与本文所述方法和物质相似或等同的方法和物质可以用于本发明的实施或测试中，下文描述了合适的方法和物质。本文引证并入本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的全部内容。若有矛盾，当以包括定义在内的本说明书为准。另外，这里的物质、方法和实施例仅用于示例说明，并不意在限制。
附图和下文的描述给出了本发明的一种或多种实施方案的细节。根据该说明书和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的及优点是显然的。
附图说明
图1是被水包围的细胞物质的模型的示意图。Rc表示细胞的半径。Ces、Cecp、Cs和C′cp分别指示细胞外盐浓度、细胞外冷冻保护剂浓度、细胞内盐浓度和细胞内冷冻保护剂浓度。
图2A是平行膜的二维图。
图2B是凸平台边界(convex plateau borders)的二维图。
图3是80∶20亮氨酸∶耻垢分枝杆菌的喷雾干燥产物的电子显微照片。
图4是95∶5亮氨酸∶耻垢分枝杆菌的喷雾干燥产物的电子显微照片。
图5是90∶10亮氨酸∶耻垢分枝杆菌的喷雾干燥产物的荧光显微照片。所用的耻垢分枝杆菌表达了GFP，并且在显微照片中显示荧光。
图6是25℃储存1周后的95∶5亮氨酸∶耻垢分枝杆菌的电子显微照片。
图7是描述下列条件下正在干燥的微滴中相对细胞体积(V/V0)的数值解的图：(a)细胞内的冷冻保护剂的量大于细胞外；(b)无冷冻保护剂；(c)细胞内外冷冻保护剂的量相等。
图8是描述在相似的渗透应力作用下，甘油和盐对喷雾干燥的耻垢分枝杆菌活力的影响的图。
图9是描述喷雾干燥粉末中耻垢分枝杆菌活力得率对赋形剂(亮氨酸)溶液百分比的图。
图10是描述50∶50亮氨酸/耻垢分枝杆菌(smeg)粉末在三种储存条件下耻垢分枝杆菌活力得率随时间变化的线图。
图11是描述95∶5亮氨酸/耻垢分枝杆菌(smeg)粉末在三种稳定条件下耻垢分枝杆菌活力得率随时间变化的线图。所示结果为5次实验的平均。
图12A和12B是描述在有和无单磷脂A条件下95∶5亮氨酸/耻垢分枝杆菌(smeg)粉末在三种稳定条件下耻垢分枝杆菌活力得率随时间变化的线图。
图13是描述在存在表面活性剂泰洛沙泊和PluronicTM-F68的条件下喷雾干燥的95∶5和50∶50亮氨酸∶耻垢分枝杆菌的活力得率的图。
图14是描述在两种储存条件下牛分枝杆菌BCG活力得率随时间变化的线图。
图15是喷雾干燥后1个月活的NIH3T3胚胎小鼠成纤维细胞的显微照片。
图16是原代采集的大鼠心脏成纤维细胞在喷雾干燥后第3天和第8天的一组20X相差显微图像。
图17是NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞在喷雾干燥后第3天和第8天的一组20X相差显微图像。
详述
本发明涉及用于制备干燥细胞形式(DCF)的新组合物和方法。这些组合物和方法有助于制备大批量的具有良好加工特性和细胞活力的细胞物质干燥形式。在优选的实施方案中，以至少50％(例如至少60％，70％，80％或90％)的典型初始赋形剂浓度(以干重计)干燥细胞物质。但是，在一些情况下初始赋形剂浓度可以低达25％。可以选择或加工这些赋形剂使得细胞物质与冷冻保护剂一起被干燥，以降低干燥过程中的渗透应力。
本文中描述的组合物和方法可以用来干燥任何细胞物质，例如与药品、农业或食品应用有关的细胞物质。“细胞物质”在本文中可以与“膜结合物质”(membrane bound material)互换使用，指被脂双层构成的膜包裹的物质。示例性的细胞物质包括细菌(例如革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，及其疫苗形式)、膜结合的病毒(例如HIV)、真核微生物(例如酵母)、哺乳动物细胞(例如血细胞(例如脐带血细胞)、血小板、干细胞、粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞(例如血管内皮细胞)、肌细胞、皮肤细胞、骨髓细胞和其它细胞)、膜结合细胞器(例如线粒体)、脂质体、基于膜的生物反应器(Bosquillonet al.，J.Control Release，99：357-367，2004)、和基于膜的药物投递系统(Smithet al.，Vaccine，21：2805-12，2003)。
细胞物质的其它例子包括膜结合病毒(例如流感病毒、狂犬病毒、痘苗病毒、西尼罗河病毒、HIV、HVJ(仙台病毒)、乙肝病毒(HBV)、正痘病毒(例如天花病毒和痘苗病毒)、单纯疱疹病毒(HSV)、和其它疱疹病毒)。其它示例性的细胞物质包括病毒性传染病(例如AIDS、AIDS相关并发症(AIDSRelated Complex)、禽痘(水痘)、感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多壁虱热、登革热、埃博拉出血热、流行性腮腺炎、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、人乳头瘤病毒(HPV)、流行性感冒(流感)、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病、狂犬病、风疹、SARS、天花(痘)、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗河病及黄热病)的致病原、细菌性转染病(例如炭疽、细菌性脑膜炎、布氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒、淋病、脓疱病、军团菌病、麻风(汉森氏病)、钩端螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、诺卡菌病、疫咳(百日咳)、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热、落矶山斑点热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、结核、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒，和尿道感染)的致病原，寄生虫性传染病(例如非洲锥虫病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、查加斯病、支睾吸虫病、隐孢子虫病、囊虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自生(free-living)阿米巴感染、贾第虫病、腭口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、黑热病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、毛线虫病、旋毛虫病、鞭虫病，和锥虫病)的致病原、及真菌性传染病(例如曲霉病、芽生菌病、念珠菌病(dandidiasis)、球孢子菌病(doccidioidomycosis)、隐球菌病(dryptococcosis)、组织胞浆菌病和足癣)的致病原。此外，这些致病原的减毒(例如营养缺陷)形式和能够促进抗致病原免疫的相关物质(例如，BCG和痘苗)可以用于本文所述的方法，例如，用于制备疫苗的方法(参见，例如Sambandamurthy et al，Nat.Med.，9：9，2002；Hondalus et al.，Infect.Immun.，68：2888-98，2000；及Sampson et al.，Infect.Immun.，72：3031-37，2004)。
用于本文所述方法和组合物的赋形剂包括，但不限于，相容的碳水化合物、天然和合成的多肽、氨基酸、表面活性剂、聚合物或其组合。典型的赋形剂对干燥中的细胞物质的膜的反射系数(reflection coefficient)将小于1.0(例如小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)(见例如Adamskiand Anderson，Biophys J，44：79-90，1983；及 and Sigler，Physiol.Res.，49：191-195，2000)。合适的碳水化合物包括单糖，诸如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖、右旋糖等等。也可以使用二糖，诸如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖等。其它赋形剂包括环糊精，诸如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，诸如棉子糖、麦芽糖糊精、右旋糖苷等等；和醛醇/糖醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇等等。合适的多肽包括二肽阿斯巴甜(aspartame)。合适的氨基酸包括任何在标准药品加工技术作用下形成粉末的天然存在氨基酸，这些氨基酸包括非极性(疏水)氨基酸和极性(不带电荷、带正电荷和带负电荷)氨基酸，这些氨基酸被FDA认定为一般安全(GRAS)。非极性氨基酸的代表性例子包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。极性不带电荷氨基酸的代表性例子包括半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。极性带正电荷氨基酸的代表性例子包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。极性带负电荷氨基酸的代表性例子包括天冬氨酸和谷氨酸。合适的合成有机聚合物包括聚[1-(2-氧-1-吡咯烷基)乙烯]，即聚维酮(povidone)或PVP。
干燥组合物
通常，使用相对少量赋形剂干燥细胞物质，经常涉及冷冻。在没有冷冻的情况下，所得粉末往往含有显著量的水，这是因为细胞物质若不经冷冻，则不能干燥到一定的含水量(例如大约40％重量的水)以下而仍保持活性。具有良好加工性和稳定性的干粉末通常需要少于10％重量，优选少于5％重量的水。这是因为较高的含水分数导致粉末颗粒之间产生显著的毛细力，从而使粉末发生团聚(aggregation)。因此，为了获得具有良好的粉末加工性和稳定性的DCF，就涉及使用大量赋形剂来进行喷雾干燥。具体地说，为了获得总含水量少于10％或5％的干粉末，应当用以重量计至少25％(例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或更多)的赋形剂与细胞形式一起干燥，得到含有相对较小重量分数的细胞物质的干粉末，这样在保留足以维持活性的水分的同时，又不使粉末存在过多水分以致损害粉末的总体加工性能。
喷雾干燥是食品业、药业和农业中使用的标准过程。在喷雾干燥中，通过使喷雾的微滴与干燥介质(例如空气或氮气)混合，使水分从雾化的进料液(喷雾(spray))中蒸发出去。该过程干燥除去微滴中的挥发物质，留下不挥发组分的“干”颗粒，这些颗粒的大小、形态、密度和挥发物含量由干燥过程所控制。被喷雾的混合物可以是溶液、乳液、悬液或分散体(dispersion)。干燥过程的许多因素可影响干燥颗粒的性质，包括喷嘴类型、转鼓大小(drumsize)、挥发溶液和循环气体的流速、以及环境条件(Sacchetti and Van Oort，Spray Drying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques，GlaxoWellcome Inc.，1996)。
通常，喷雾干燥过程包括四个过程：混合物分散为小微滴，喷雾与干燥介质(例如空气)混合，水分从喷雾中蒸发，及干燥产物与干燥介质分离(Sacchetti and Van Oort，Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques，Glaxo Wellcome Inc.，1996)。
混合物分散成小微滴极大地增加待干燥物的表面积，使得干燥过程更加迅速。典型地，分散能量越高导致所得的微粒越小。分散可以通过本领域已知的任何手段实现，包括压力喷嘴、双流体喷嘴、旋转雾化器、以及超声喷嘴(Hinds，Aerosol Technology，2nd Edition，New York，John Wiley andSons，1999)。在一些实施方案中，以小于200psi的压力喷雾混合物。
分散(喷雾)混合物之后，将所得的喷雾与干燥介质(例如空气)混合。典型地，混合在连续的加热空气流中发生。热空气改善对于喷雾微滴的传热，并增加蒸发速率。空气流可以在干燥后排放到大气中，或者循环并再利用。空气流通常通过在气流的任一端提供正压和/或负压来维持(Sacchetti andVan Oort，Spray Drying and Supercritical Fluid Particle Generation Techniques，Glaxo Wellcome Inc.，1996)。
当微滴与干燥介质发生接触时，由于微滴比表面积高、尺寸小，很快发生蒸发。基于干燥系统的性质，在经干燥的产物中可保留残余水平的水分(Hinds，Aerosol Technology，2nd Edition，New York，John Wiley and Sons，1999)。
然后将产物与干燥介质分离。典型地，产物的初级分离发生在干燥室的底部，然后使用例如旋风分离器、静电沉降器、过滤器或气体洗涤器回收产物(Masters et al.，Spray Drying Handbook，Harlow，UK，LongmanScientific and Technical，1991)。
最终产物的性质，包括粒度、最终湿度和得率，依赖于干燥过程的许多因素。典型地，对入口温度、空气流速、液体进料流速、微滴尺寸、和混合物浓度等参数进行调节以产生期望的产物(Masters et al.，Spray DryingHandbook，Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。
入口温度是指经加热的干燥介质，通常是空气，在流入干燥室之前测得的温度。典型地，入口温度可以根据希望加以调节。产物回收部位的干燥介质温度称为出口温度，它依赖于入口温度、干燥介质流速、以及被喷雾混合物的性质。典型地，较高的入口温度使最终产物中水分量降低(Sacchetti and Van Oort，Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques，Glaxo Wellcome Inc.，1996)。
空气流速(air flow rate)是指干燥介质通过系统的流动(flow)。空气流可以通过在喷雾干燥系统任一端或者内部维持正压和/或负压来提供。典型地，较高的空气流速导致颗粒在干燥设备中的停留时间(即干燥时间)较短，并导致最终产品中残余水分的量较大(Masters et al.，Spray Drying Handbook，Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。
液体进料流速是指每个单位时间内输送到干燥室的液体的量。液体的通量(throughput)越高，微滴蒸发成为颗粒所需的能量越多。因此，流速越高导致输出温度(output temperature)越低。典型地，降低该流速，同时保持入口温度和空气流速恒定，可降低最终产物的含水量(Masters et al.，SprayDrying Handbook，Harlow，UK，Longman Scientific and Technical，1991)。
微滴大小/尺寸是指被喷雾喷嘴分散的微滴的大小。典型地，较小的微滴使得最终产物的含水量较低，粒度较小(Hinds，Aerosol Technology，2ndEdition，New York，John Wiley and Sons，1999)。
待喷雾干燥的混合物的浓度也对最终产物有影响。典型地，较高的浓度导致最终产物的粒度较大，这是由于每个被喷雾微滴的物质较多(Sacchetti and Van Oort，Spray Drying and Supercritical Fluid ParticleGeneration Techniques，Glaxo Wellcome Inc.，1996)。
用于喷雾干燥的系统可以从例如Armfield，Inc.(Jackson，NJ)、BrinkmannInstruments(Westbury，NY)、BUCHI Analytical(New Castle，DE)、Niro Inc(Columbia，MD)、Sono-Tek Corporation(Milton，NY)、Spray Drying Systems，Inc.(Randallstown，MD)和Labplant，Inc.(North Yorkshire，England)购买。
喷雾干燥粉末的最终含水量可以通过本领域已知的任何手段来确定，例如，通过热重分析法。热重分析法通过加热粉末并测量水分蒸发过程中的质量损失来确定含水量(Maa et al.，Pharm.Res.，15：5，1998)。典型地，对于含有细胞物质(例如细菌)的样品而言，水将分两个相(phases)蒸发。第一相称为游离水，主要是干燥赋形剂的含水。第二相称为结合水，主要是细胞物质的含水。对游离水和结合水都可以加以测量，来确定粉末在赋形剂或细胞物质中是否含有所希望的水分含量(Snyder et al.，Analytica Chimica Acta，536：283-293，2005)。
在喷雾干燥过程中减少渗透应力
待喷雾干燥的细胞溶液中引入的赋形剂可以通过这样的方式选择和/或引入，使得细胞物质的膜承受的总体渗透应力最小，从而维持活性。尽管由于上述的原因，相对于细胞物质质量分数保持所需的赋形剂质量分数是相当重要的，但是对于细胞活力而言，这些赋形剂的性质、喷雾干燥前引入这些赋形剂的方式，可能是重要的，甚至是关键的。
对于细胞物质而言，微滴在喷雾干燥转鼓中的干燥可以看成类似于生物体在标准深低温保藏过程中的冷冻过程，如图1所示(James，″Maintenanceof Parasitic Protozoa by Cryopreservation，″Maintenance of Microorganisms，Academic Press，London，1984)。
当含有生物体的微滴蒸发时，微滴中(和细胞外)的盐浓度(Ces)相对于生物体中的盐浓度(Cis)将会增加。理由是细胞膜对于盐的转移而言是不可通透的，而对于水的转移而言是相对可通透的。结果是，微滴的干燥增加了正在蒸发的微滴中的盐浓度，形成对细胞膜的渗透应力(由膜任一侧的盐浓度不平衡所致)，导致水从细胞中被推出。可以将这种脱水过程看成膜试图通过消除盐浓度的不平衡来机械性地减少渗透应力(Batycky et al.，Phil.Trans.Roy.Soc.Lond.，A355：2459-88，1997)。
细胞物质在微滴蒸发过程中的“脱水”与细胞物质经受冷冻时发生的过程是基本相同的。如上所述，过度脱水可导致细胞物质的裂解，为了避免过度脱水，已经开发了与深低温保藏领域相关的技术，也就是冷冻保护剂的使用和冻融循环的控制。冷冻保护剂是以慢于水而快于盐的速率渗透细胞膜的药理学惰性物质。由于这些技术与喷雾干燥细胞物质的方法相关，下文对它们进行简要的综述(Karlsson and Toner，Biomaterials，17：243-256，1996)。
首先，鉴于膜对冷冻保护剂的半透性，冷冻保护剂对膜施加渗透压，该渗透压与冷冻保护剂的浓度成比例，并且对于最好的冷冻保护剂而言，它非常接近于相当浓度的盐所施加的渗透压。这意味着，浸没在含有非渗透性盐浓度相似大小冷冻保护剂的水性介质中的细胞膜所经受的渗透应力和非等渗条件往往会受到冷冻保护剂物质的存在的显著影响。因此，冷冻保护剂的跨膜扩散提供了一种抵消渗透应力的手段，即使在膜任一侧的盐浓度不相等的情况下也是如此。由此，冷冻保护剂提供了分散(diffuse)渗透应力的手段。适合用于所述新方法的冷冻保护剂包括但不限于二甲亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油(Chesne and Guillouzo，Cryobiology，25：323-330，1988)。在一些实施方案中，冷冻保护剂不包括在干燥后的混合物中。
在深低温保藏规程中，将冷冻保护剂添加到细胞物质的悬液中，添加的浓度(Cecp)与盐浓度显著相关。应当指出，可以控制这种添加以免使细胞受到过高的渗透应力，也就是说，可以以足够慢的速率添加冷冻保护剂，使得冷冻保护剂可以扩散穿过细胞膜而不使细胞脱水。然后在冷冻—由于细胞内天然冷冻保护剂的作用，冷冻导致细胞外形成冰，从而增加细胞外的盐浓度—的过程中，冷冻保护剂能够扩散穿过细胞膜而提高细胞内浓度，从而增加冷冻保护剂内部浓度(Cicp)。这样就减轻了细胞膜上的渗透应力，尤其是当冷冻以足够慢的速率进行的条件下。这样，冷冻保护剂有助于保持细胞活力，解释了它在保存血液、精液及其它有用细胞方面的用途(Karlsson and Toner，Biomaterials，17：243-256，1996)。
虽然喷雾干燥与深低温保藏具有类似性，但它对于细胞物质有独特的优势，这种优势对于大规模使用是特别重要的。大批量细胞悬液的细胞深低温保藏是困难的，这是因为当悬液尺度远远大于细胞尺度时，两种尺度上的传质动力学要求(在添加或去除冷冻保护剂和冷冻细胞过程中所涉及的)是极为不同的。这可能是采用标准深低温保藏方法的血液冷冻不容易适用于完整器官冷冻的原因之一。喷雾干燥自动将细胞悬液分成较小的量(即微滴)，它们可以粗略地看成深低温保藏小单位。规模放大不需要显著增加喷雾的微滴的量：规模放大是通过增加喷雾干燥容器的尺寸、增加通过喷嘴的悬液流量(flow)，和其它标准规模放大手段来实现的。
因此，喷雾干燥可以提供用于产生大量DCF的方法，这些DCF的活性比通过深低温保藏和冻干技术获得的活性更高。
下文描述了一种理论形式，它提供了对细胞形式进行喷雾干燥，使膜应力最小化，从而使活力最大化的规则。这些方法依赖于使用冷冻保护剂和控制喷雾干燥的参数例如溶剂类型、入口气体温度和喷雾干燥喷嘴尺寸和旋转速度(微滴大小)。
所述方法确定喷雾微滴能够在加热环境中被干燥的速率，这样，在深低温保藏剂存在的条件下，可以调节悬浮物质的膜半径。由此，可以防止膜收缩到Rcmin以下或者扩张到Rcmax以上。举例说明，在Rcmin的情况下，并非所有的悬浮物质均将由于渗透压驱使的脱水作用而收缩到临界半径(Rccri)以下。若细胞壁是刚性的，可以直接将这种条件与导致失活的临界应力相等同。首先，考虑问题中的理想化几何条件和浓度，然后考虑两个极限条件下的动力学。然后，建立流体力学和传质方程来描述作为系统参数之函数的细胞半径变化率。
为便于说明，可以设想这样一种细胞悬液，其中细胞是具有平衡半径Rco的球体。在这些细胞中有盐和冷冻保护剂，它们在细胞内的浓度为Cis和Cicp，在细胞外的浓度为Ces和Cecp。
在喷雾干燥时，形成悬浮物质的微滴个体。在这里，我们假设细胞在喷雾溶液和喷雾过程中保持均匀分布，因此在各个被喷雾的微滴中的浓度相等。流速(其可在喷雾干燥中加以物理控制)可由下式明确解出：
a=Nncellsto---(1)]]>
其中a是每单位时间生成微滴的速率，ncells是每个被喷雾的微滴个体中悬浮的细胞数，N是体积中的总细胞数，to是将体积Vo喷雾所需的时间量。
待喷雾悬液中细胞的体积分数将以φo表示，其中
且N是悬浮体积φo中的总细胞数。
假设这些微滴具有均一的半径Rdo，从而细胞物质的分数可以表示为
φo=ncells(RocRod)3---(3)]]>
其中n是在每个被喷雾的微滴个体中悬浮的细胞数。
在假设均匀的情况下，在原始悬液中测得的四个浓度Ces、Cecp、Cis、Cicp等于每个被喷雾微滴的细胞中盐和冷冻保护剂的初始浓度。已知每个微滴中盐和冷冻保护剂的绝对摩尔数必须守恒，这些浓度将基于微滴直径和细胞直径的变化而随时间变化。
令xis和xes、及xicp和xecp分别代表在微滴个体中分散后盐和冷冻保护剂在细胞外部和细胞内部的摩尔数，这样就有：
Csi=xsi43πRc3-Vcexcluded---(4)]]>
Ccpi=xcpi43πRc3-Vcexcluded---(5)]]>
Cse=xse43πRd3(1-φ)=xse43π[Rd3-ncellsRc3]---(6)]]>
Ccpe=xcpe43πRd3(1-φ)=xcpe43π[Rd3-ncellsRc3]---(7)]]>
这里，Vcexcluded是每个细胞个体中盐和/或冷冻保护剂不能分配到其中的体积，将其看作对时间恒定的。由于盐不能渗透过膜，参数xis和xes(代表细胞内和细胞外的盐摩尔数)对时间也是恒定的。这样上述表达式中仅有的时间变量就是Rc和Rd以及细胞内和细胞外的冷冻保护剂摩尔数xicp和xecp。
每个微滴个体将在喷雾干燥转鼓中蒸发，其蒸发速率依赖于外部条件、微滴大小、微滴挥发性等等。在初始时，考虑到悬液最初很稀(φo＜＜1)的性质，细胞个体平均而言将是相互远离的。随着时间的推移，细胞将越来越多地紧密接触，这样可以设想两种极限情形：
这里，在干燥过程中φ(t)＜＜1。在此情况下，假设每个细胞个体是孤立的(isolated)，如同它悬浮在无限大的浴(bath)中一样对演变中的盐和冷冻保护剂浓度(从而对渗透应力)起反应。由于问题的对称性(参见下文传质的考虑因素)，微滴和细胞均径向收缩(或扩张)。因此，考虑图1，细胞个体中和周围由于渗透应力而不因流体运动所致的速度分布可表示如下：
v＝ιr vr(t) (8)
其中ιr是在以细胞中心为原点的球面坐标系统中沿着坐标r的单位矢量，vr(t)是径向速度的大小。
此外，设细胞和微滴流体是不可压缩的。
▽·v＝0 (9)
或
∂vr∂r=0---(10)]]>
由于细胞中心处的径向速度必须为零，结论是在每一处
v＝0 (11)
这个结论暗示，细胞膜的任何径向运动必须是“非物质性的”(non-material)，意思是膜运动不等于连续流体的质量平均运动。
因此，情况1是这样一个问题：细胞个体在微滴内的演变是扩散驱动的。
在φo→1的极限条件下，正在干燥的微滴中的细胞个体极度紧密接触。细胞膜因渗透应力而发生的演变被限定在这样的环境中：细胞膜或者成平面地挨着相邻的细胞，或者在所谓“平台边界”(plateau borders)附近形成凸出曲面。这样的膜环境显示在图2中。
在情形2中，情形1的几个基本假设不再成立。首先，考虑到细胞的紧密接触和由于细胞的排除体积而造成的微滴“毗邻”相传质阻力，预期外部或连续相中盐和冷冻保护剂浓度的增加相对于跨细胞膜水运输而言不会是即刻的。这就意味着随着微滴体积持续减小，微滴外周的盐和冷冻保护剂浓度相对于微滴中心附近的浓度将会显著增加，从而靠近微滴外周的细胞将受到高渗透应力，而位于中心的细胞将受到极少乃至没有渗透应力。于是，使干燥过程中每个细胞的径向扩张或收缩最小化这一目标的意义就不明确了，因为各个细胞随时间将经历不同的条件。情形2中的目标是：或者使最易受攻击的细胞，即位于外周的那些细胞的细胞膨胀最小化，或者考虑对于燥过程的合理时间约束，拯救微滴中最大数目的细胞。(注意，使外周的细胞死亡最小所需要的最终干燥限制条件，在极限条件下可能要求无限慢的干燥。)
为了本分析的目的，其余的考虑将专门围绕着情形1进行。
对于情形1可以确定两个显著的传质问题。第一个问题涉及正在干燥的微滴中盐和冷冻保护剂的传质，假设正在干燥的微滴中盐和冷冻保护剂的浓度均一地作为时间的函数增加。由于细胞悬液是稀的，微滴干燥问题可以单独地考虑。这后一个问题是球状水微滴在热空气连续体中干燥的问题。
在外部盐和冷冻保护剂浓度均一突然变化的无边界环境中的球状细胞传质问题早先已经由Batycky等人(1997)加以解决。在他们的分析中，细胞流体被描述为一种连续体，细胞内的盐和冷冻保护剂浓度视为在整个细胞质液和内部细胞器中是均匀化的(homogenized)，或者是特别平均化的(specially averaged)。根据膜上渗透压的标准定义，即雷诺输运定理(Reynolds Transport Theorem)和对水通过膜的渗透性的达西定律描述(Darcylaw description)，可证明膜速度为：
U=dRocdt=-LpRgasT[(Cse-Csi|R=Rc(t))+σ(Ccpe-Ccpi|R=R(t))]---(12)]]>
其中Lp是膜的液压渗透率(m/s·atm)；σ称为反射系数(reflection coefficient)(0＜σ＜1)，表示膜对冷冻保护剂的渗透性相对于盐减少的分数。
细胞中膜处盐和冷冻保护剂浓度的时间变化率可以通过解相关的传质守恒方程来求出。虽然细胞中盐和冷冻保护剂的浓度很高，对于恒定的盐和冷冻保护剂仍假设为菲克扩散(Fickian diffusion)。根据Batycky et al.(1997)并纳入Edwards和Davis(Chem.Eng.Sci.，50：1441-54，1995)的结果，这些扩散率表示为过程-尺度系数(course-scale coefficients)它们反映细胞中细胞器的存在。
在Batycky et al.(1997)中，盐浓度的控制微分方程可以表述为：
∂Csi‾∂t=1r2∂∂r(Ds*‾r2∂Csi‾∂r)---(13)]]>
Ds*‾∂Csi‾∂r+dRc(t)dtCsi=0,∀r=R(t),t---(15)]]>
设初始条件为
t＝0时，Csi=Csi(0),]]>其中t＝0时，Rc(t)＝Ri (16)
在上述方程中，Csi和通过下式关联：
Csi‾=Csi(1-Vexcludedc43πRc(t)3)---(17)]]>
解这些方程可得：
Csi‾=xsi43πRc(t)3---(18)]]>
Csi=xsi43πRc(t)3-Vexcludedc---(19)]]>
在Batycky et al.(1997)中，冷冻保护剂浓度的控制微分方程可以表述为：
∂Ccpi‾∂t=1r∂∂r(Dcp*‾r2∂Ccpi‾∂r),---(20)]]>
其边界条件为
Dcp*‾∂Ccpi‾∂r+dRc(t)dtCcpi=Pcp(Ccpe-Ccpi),∀r=(Rc(t),t)---(22)]]>
初始条件为
t＝0时，Ccpi=Ccpi(0)---(23)]]>
t＝0时，Rc(t)=Roc---(24)]]>
关联为：
Ccpi‾=Ccpi(1-θ+κα+Kθ),∀r,t---(25)]]>
其中θ是细胞的渗透压惰性的部分(细胞器)，κ＝亨利定律吸收系数，α是细胞器比表面积，K是进入细胞器的分配系数。
用方程(14)(Batycky et al.1997)解这些方法得到
-1LpRgasTdRcdt=Cse-xsi43πRc(t)3-Vexcluded+σ[Ccpe-Ccpi(0)]2Σn=1∞sin2(λn)-λnsin(λn)cos(λn)λn2-λnsin(λn)cos(λn)e-λn2Dcp*‾t/Rc(t)2---(26)]]>
其初始条件为
t＝0时，Rc(t)=Roc---(27)]]>
其中λn是下列超越方程非零根的特征值：
βλn＝tan(λn) (28)
其中，Psp是半透性溶质进入细胞的速率，系数β定义为：
β=(1-PspRc(t)Dsp*‾(1-θ+κα+κθ))-1---(29)]]>
注意，虽然λn在扩散的快速时间尺度上是基本恒定的，它们在细胞膜扩张的时间尺度上是随时间缓慢变化的。方程(28)将细胞半径Rc(t)与外部盐和冷冻保护剂浓度相关联，外部盐和冷冻保护剂浓度则依赖于微滴蒸发的速率。下面描述这种关联关系。
许多研究者已经考察了在气相中干燥的球状微滴，尤其是忽略气体中的对流效应时。喷雾干燥器中的蒸发依赖于蒸发的控制速率(governing rate)和蒸发的停留时间(residence time)。停留时间是干燥器中喷雾-空气运动的函数。在微滴相对于周围的空气运动的情况下，运动中的微滴周围的流动条件影响蒸发速率。此时，若空气和微滴之间的相对速度极低，则微滴完全被空气流所影响。根据边界层理论，以零相对速度运动的微滴的蒸发速率与静态空气条件中的蒸发相同。因此，将微滴通过喷雾干燥的蒸发作为与静态空气条件下蒸发类似的机制进行建模。
实验中和理论上，微滴半径和喷雾干燥过程的控制性参数之间遵从的一般关系由下式给出(Masters，1991，Spray Drying Handbook，LongmanScientific and Technical，Harlow，UK)：
dt=-λρ1DKdLMTDdD---(30)]]>
其中D＝2Rc，Kd是蒸发中的微滴周围气膜的平均热导率，ρ1是气相的密度，λ是微滴的气化潜热，LMTD是由下式定义的对数平均温差：
LMTD=ΔT0-ΔT12·303log10(ΔT0/ΔT1)---(31)]]>
其中ΔT0和ΔT1是微滴和气相之间初始和最终的温差。
对(30)积分得到：
Rd(t)=kt+Rod2---(32)]]>
其中
k=-KdLMTDλρ1---(33)]]>
将(32)代入(6)和(7)，将盐和冷冻保护剂的即时浓度与微滴蒸发参数关联起来：
Cse=xse43π(kt+Rod2)3/2(1-φ)=xse43π[(kt+Rod2)3/2-ncells(Rc(t))3]---(34)]]>
Ccpe=xcpe43π(kt+Rod2)3/2(1-φ)=xcpe43π[(kt+Rod2)3/2-ncells(Rc(t))3]---(35)]]>
喷雾干燥方法可以用下面的微分方程来表示：
-1LpRgasTdRc(t)dt=xse43π[(kt+Rod2)3/2-ncells(Rc(t))3]-xsi43πRc(t)3-Vexcluded]]>
+σ[xcpe43π[(kt+Rod2)3/2-ncells(Rc(t))3-Ccpi(0)]2Σn=1∞sin2(λn)-λnsin(λn)cos(λn)λn2-λnsin(λn)cos(λn)e-λn2Dcp*‾t/Rc(t)2---(36)]]>
通过求解上述方程，可以确定为了使应力最小化、使Rminc<Rc(t)<Rmaxc]]>得以保持、或者使对悬浮膜结合物质的应力最大化而必需的喷雾干燥器入口和出口气体温度(即ΔT)、喷嘴类型和微滴尺寸的旋转速度(Rd)、溶剂类型(λ)、冷冻保护剂类型(Lp)等条件。在深低温保藏细胞冷冻及融解速率的规则中可以找到与这些规则相类似的规则。
药物组合物
本文中描述的干燥细胞形式，例如用所述新组合物或新方法制备的干燥细胞形式，可以制备为药物组合物，例如疫苗组合物。细胞物质可以与多种药学可接受的稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、以及其它本领域公知的材料一起喷雾干燥来制备药物粉末。或者，在喷雾干燥之后，可以将产物与多种药学可接受的稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、佐剂、以及其它本领域公知的材料中的至少一种一起配制来制备药物组合物，例如药物粉末。术语“药学可接受的”意思是不干扰活性成分的生物学活性的有效性的无毒物质。组合物的特征可以依赖于施用途径。在一些实施方案中，组合物在施用之前可以储存在受控制的温度。
药物组合物(例如含有干燥细胞形式的药物组合物)的施用可以通过多种常规方式实施，例如吸入、口腔摄入或皮肤、皮下或静脉内注射。优选的是通过吸入施用。在一些实施方案中，组合物作为疫苗施用。
干燥细胞形式可以配制为利用医疗装置，例如吸入器(见例如美国专利6,102,035(粉末吸入器)和6,012,454(干粉末吸入器))来吸入。吸入器可包括单独的用于活性化合物的区室(其具有适于储存的pH)，用于中和缓冲剂的另一区室，以及用于在即将雾化前将化合物与中和缓冲剂混合的机构。在一个实施方案中，吸入器是定量吸入器。
用来局部投药于肺气道的三种常用系统包括干粉末吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)和雾化器。MDI是在最常用的吸入给药方法中使用的，可以用来投递溶解形式或作为分散体的药物。典型地，MDI包含氟利昂或其它相对高蒸气压推进剂，其在装置起动时迫使气溶胶化的药物进入呼吸道。和MDI不同，DPI通常完全依靠患者用力吸气来将干粉末形式的药物导入肺中。雾化器对液体溶液施加能量来形成供吸入的药物气溶胶。也有人探讨了使用含氟化合物介质在液体通气(liquid ventilation)或肺灌洗(pulmonarylavage)过程中直接对肺投递药物。这些方法以及其它方法可以用来投递干细胞形式。美国专利6,732,732和6,766,799也记载了示例性的吸入装置。
所述组合物可以方便地以压缩包装或雾化器提供的气溶胶喷雾的形式投递，其中使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供输送一定量的阀门来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的、含有干燥细胞形式的胶囊和药筒。
虽然不是必要的，但可以使用投递增强剂诸如表面活性剂来进一步加强肺投递。本文中使用的“表面活性剂”是指这样的化合物，它具有亲水部分和亲脂部分，这些部分通过与两个不能融合的相之间的界面相互作用来促进药物的吸收。表面活性剂对于干颗粒有用是由于几个原因，例如，减少颗粒聚结、减少巨噬细胞吞噬等等。当与肺表面活性剂偶联时，化合物可以更有效率地吸收，因为表面活性剂，例如DPPC，会大大有助于化合物的扩散。表面活性剂是本领域公知的，包括但不限于磷酸甘油酯，例如磷脂酰胆碱、二棕榈酰L-α-磷脂酰胆碱(DPPC)和二磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9；月桂酯(auryl ether)；棕榈酸；油酸；山梨聚糖三油酸酯(SpanTM 85)；甘胆酸盐、表面活性蛋白(surfactin)；泊洛沙姆(poloxomer)；山梨聚糖脂肪酸酯；山梨聚糖三油酸酯；泰洛沙泊(tyloxapol)；和磷脂。
在另一个方面中，干燥细胞形式可以与这样的药学可接受载体一起配制，该药学可接受载体具有不可吸入的颗粒大小，即使得该载体不会以任何显著量被摄入肺中的大小。该制剂可以是干燥细胞形式的较小颗粒(例如少于10μm)与载体的较大颗粒(例如约15到100μm)所成的均匀混合物。在分散时，较小的颗粒随之被吸入肺中，而较大的颗粒通常保留在口腔中。适合用于混合的载体包括具有可接受的口味并且在毒理学上无害的结晶或无定形赋形剂，包括吸入或口服的，例如糖、二糖和多糖。代表性的例子包括乳糖、甘露糖醇、蔗糖、木糖醇等等。
对于口服施用，可以使用药学可接受的赋形剂诸如粘合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)，将药物粉末配制成例如通过常规方式制备的片剂或胶囊。片剂可以通过本领域公知的方法进行包衣。用于口服施用的液体制备物可以采取，例如，溶液、糖浆或悬液的形式，或者可以作为干产品提供，在使用前用水或其它合适的溶媒加以调制。这样的液体制备物可以使用药学可接受的添加剂诸如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性溶媒(例如杏仁油、油性酯、乙醇或经分级的植物油)、和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸)，通过常规手段加以制备。这些制备物还可视需要含有缓冲剂、盐、调味剂、着色剂、和甜味剂。
所述组合物可以配制为用于通过注射，例如推注或连续输注，进行肠胃外施用。活性成分可以以粉末的形式提供，在使用前用合适的溶媒，例如无菌无热原水加以调制。注射用制剂可以以单位剂量形式提供，例如与添加的防腐剂一起装在安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取油性或水性溶媒中的悬液、溶液或乳液的形式，并可含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等物质。
佐剂
本发明的疫苗可以与其它免疫调节剂一起配制。具体地，疫苗组合物可包含一种或多种佐剂。可用于本文所述疫苗组合物中的佐剂包括，但不限于：
A.含矿物质组合物
适于用作本文所述的佐剂的含矿物质组合物包括矿物质盐，诸如铝盐和钙盐。还包括矿物质盐诸如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等等(例如，见《Vaccine Design》第8和第9章，(1995)Powell和Newman编，ISBN：030644867X.Plenum)、或不同矿物质化合物的混合物(例如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地，磷酸盐为过量)、其中化合物采取任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形等等)，对盐的吸附是优选的。含有矿物质的组合物还可以配制为金属盐的颗粒(PCT公布号WO00/23105)。
铝盐可以包含在本文所述的组合物中，使得Al3+的剂量是每剂0.2到1.0mg。在一个实施方案中，用于本发明组合物的基于铝的佐剂是明矾(硫酸铝钾(AlK(SO4)2)，或者明矾衍生物，例如通过将抗原与明矾在磷酸盐缓冲液中混合，然后用碱例如氢氧化铵或氢氧化钠进行滴定和沉淀，从而原位生成的明矾衍生物。
另一种用于本发明疫苗组合物中的基于铝的佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)3)或结晶羟基氧化铝(AlOOH)，后者是一种优秀的吸附剂，具有大约500m2/g的表面积。或者，提供磷酸铝佐剂(AlPO4)或羟基磷酸铝，它们含有磷酸基团，代替氢氧化铝佐剂的一些或所有羟基基团。本文提供的优选的磷酸铝佐剂是无定形的，可溶于酸性、碱性和中心介质。
在另一实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含磷酸铝和氢氧化铝二者。在它的一个更具体的实施方案中，佐剂含磷酸铝的量大于氢氧化铝的量，例如磷酸铝对氢氧化铝的重量比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或大于9∶1。更具体地，铝盐存在的量可以为每个疫苗剂量0.4到1.0mg，或每个疫苗剂量0.4到0.8mg，或每个疫苗剂量0.5到0.7mg，或每个疫苗剂量约0.6mg。
通常，通过最优化分子间的静电引力，使得在所需的pH抗原携带与佐剂相反的电荷，来选择优选的基于铝的佐剂，或者多种基于铝的佐剂的比例，例如磷酸铝对氢氧化铝的比例。例如，在pH 7.4，磷酸铝佐剂(等电点＝4)吸附溶菌酶而不吸附清蛋白。若靶标是清蛋白，则选择氢氧化铝佐剂(等电点＝11.4)。或者，用磷酸预处理氢氧化铝可降低其等电点，使其成为用于更碱性抗原的优选佐剂。
B.油乳液
适合在所述组合物中用作佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳液。特别优选的佐剂是亚微米水包油乳液。优选用于本发明的亚微米水包油乳液是任选含有不同量MTP-PE的鲨烯-水乳液，例如含4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v TweenTM 80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)、和/或0.25-1.0％ SpanTM 85(山梨聚糖三油酸酯)，以及，任选地，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺[N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluatminyl-L-alanine-2-(1′-2′-dipalmitoyl-s-n-glycero-3-huydroxyphosphophoryloxy)-ethylamine](MTP-PE)的亚微米水包油乳液，例如，名为“MF59”的亚微米水包油乳液(国际公布WO90/14837；美国专利6,299,884和6,451,325，及Ott et al.，“MF59--Design and Evaluationof a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines”于《Vaccine Design：TheSubunit and Adjuvant Approach》中(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)PlenumPress，New York，1995，pp.277-296)。MF59含有4-5％w/v鲨烯(例如4.3％)、0.25-0.5％w/v TweenTM 80、及0.5％w/v SpanTM 85，以及任选的不同量的MTP-PE，使用微流化床(microfluidizer)诸如110Y型微流化床(Microfluidics，Newton，Mass.)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE可以以约0-500.μg/剂、更优选0-250.μg/剂、最优选0-100μg/剂的量存在。例如，“MF59-100”每剂含100μg MTP-PE，等等。MF69，另一种用于本发明的亚微米水包油乳液，含有4.3％w/v鲨烯、0.25％w/v TweenTM 80、及0.75％w/v SpanTM 85，及任选的MTP-PE。另一种亚微米水包油乳液是MF75，又称SAF，含有10％鲨烯、0.4％TweenTM 80，5％PluronicTM嵌段聚合物L121、以及thr-MDP，同样微流体化成亚微米乳液。MF75-MTP代表包含MTP，例如每剂100-400μgMTP-PE的MF75制剂。
用于所述组合物中的亚微米水包油乳液、它们的制备方法和免疫刺激剂，例如胞壁酰肽，在国际公布WO90/14837和美国专利6,299,884和6,451,325中有详细记载。
完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可以在主题组合物中用作佐剂。
C.皂苷制剂
皂苷制剂也可以在所述组合物中用作佐剂。皂苷是一群异质的固醇糖苷和三萜类糖苷，存在于多个植物物种的树皮、叶、茎、根甚至花中。从皂树(Quillaia saponaria Molina)的树皮分离的皂苷作为佐剂已经得到了广泛的研究。还可以从菝葜(Smilax ornata)(sarsaprilla)、圆锥石头花(Gypsophillapaniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)产业制备皂苷。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，和脂质制剂，例如免疫刺激复合物(ISCOM)。
已经利用高效薄层层析(HP-TLC)和反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化了皂苷组合物。使用这些技术特异性纯化的级分已经得到鉴定，包括QS7，QS17，QS18，QS21，QH-A，QH-B和QH-C。典型地，皂苷是QS21。美国专利5,057,540公开了一种制备QS21的方法。皂苷制剂还可以包括固醇，例如胆固醇(见PCT公布WO96/33739)。
可以使用皂苷和胆固醇的组合来形成独特的颗粒，称为免疫刺激复合物(ISCOM)。ISCOM典型地还包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。优选地，ISCOM包括Quil A、QHA和QHC中的一种或多种。在EP0109942、WO96/11711和WO96/33739中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含有其它去污剂。见WO00/07621。
在Barr et al.，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：247-271中可见基于皂苷的佐剂的发展的综述。另见Sjolander et al.，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：321-338。
D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明组合物的佐剂。这些结构通常含有一种或多种来自病毒的蛋白质，任选与磷脂组合或配制在一起。它们通常是非致病性、非复制性的，且通常不含有任何天然病毒基因组。病毒蛋白可以重组制备或者从完整病毒分离。这些适合用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核心或壳体蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、人乳头瘤病毒、HIV、RNA噬菌体、Qβ噬菌体(例如外壳蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬菌体、和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白质。VLP在WO03/024480、WO03/024481和Niikura et al.，Virology(2002)293：273-280；Lenz et al.，Journal of Immunology(2001)5246-5355；Pinto et al.，Journal of Infectious Diseases(2003)188：327-338；及Gerber et al.，Journal ofVirology(2001)75(10)：4752-4760中有进一步讨论。病毒体在例如Gluck et al.，Vaccine(2002)20：B10-B16中有进一步讨论。在鼻内三价INFLEXALTM产品(Mischler & Metcalfe(2002)Vaccine 20 Suppl 5：B17-23)和INFLUVACPLUSTM产品中使用免疫增强性重建流感病毒体(IRIV)作为亚基抗原投递系统。
E.细菌或微生物衍生物
适合用于本发明组合物中的佐剂包括细菌或微生物衍生物，诸如：
(1)肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这样的衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰基化链的3-脱-O-酰基单磷酰脂质A的混合物。EP 0 689 454中公开了3-脱-O-酰基单磷酰脂质A的一种优选的“小颗粒”形式。这样的3dMPL“小颗粒”小到足以无菌滤过0.22微米的滤膜(见EP 0689 454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯(aminoalkyl glucosaminide phosphate)衍生物，例如RC-529。参见Johnson et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.，9：2273-2278。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，诸如OM-174。OM-174在例如Meraldi et al.，Vaccine(2003)21：2485-2491；和Pajak et al.，Vaccine(2003)21：836-842中有记载。
(3)免疫刺激性寡核苷酸
适合用作佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(一种序列，含有非甲基化的胞嘧啶，其后随鸟嘌呤，二者通过磷酸酯键相连)的核苷酸序列。含有回文或多聚(dG)序列的寡核苷酸或者细菌双链RNA也已被证明具有免疫刺激性。
CpG可包括核苷酸修饰/类似物诸如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链的或单链的。任选地，鸟嘌呤可以被类似物诸如2’-脱氧-7-脱氮鸟嘌呤取代。关于可能的类似物取代的例子可参见Kandimalla et al.，Nucleic AcidsResearch(2003)31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923。CpG寡核苷酸的佐剂效应在Krieg，Nature Medicine(2003)9(7)：831-835；McCluskie et al.，FEMS Immunology and Medical Microbiology(2002)32：179-185；WO98/40100；美国专利6,207,646；美国专利6,239,116和美国专利6,429,199中有进一步讨论。
CpG序列可以是针对TLR9的，诸如基序GTCGTT或TTCGTT。见Kandimalla et al.，Biochemical Society Transactions(2003)31(part 3)：654-658。CpG序列可以是对诱导Th1免疫应答特异性的，例如CpG-A ODN，或者它可以是对诱导B细胞应答更特异性的，例如CpG-B ODN。在Blackwell et al.，J.Immunol.(2003)170(8)：4061-4068；Krieg，TRENDS inImmunology(2002)23(2)：64-65和WO01/95935中讨论了CpG-A和CpG-BODN。典型地，所述CpG是CpG-A ODN。
典型地，CpG寡核苷酸构建的方式使得5’末端是受体识别可及的。任选地，两个CpG寡核苷酸序列可以在它们的3’末端搭接形成“免疫体”(immunomers)。参见，例如，Kandimalla et al.，BBRC(2003)306：948-953；Kandimalla et al.，Biochemical Society Transactions(2003)31(第3部分)：664-658；Bhagat et al.，BBRC(2003)300：853-861和WO03/035836。
(4)ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以在所述组合物中用作佐剂。典型地，所述蛋白质来源于大肠杆菌(例如大肠杆菌不耐热肠毒素″LT″)、霍乱(″CT″)、或百日咳(″PT″)。WO95/17211描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途，WO98/42375描述了它作为肠胃外佐剂的用途。优选地，佐剂是脱毒的LT突变体诸如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作为佐剂的用途可在下列文献中见到：Beignon et al.，Infection and Immunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza et al.，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza et al.，Int.J.Med.Microbiol.(2000)290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten et al.，Infection andImmunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan et al.，Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos et al.，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni et al.，Vaccines(2003)2(2)：285-293；和Pine et al.，J.ControlRelease(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸取代的编号基准典型地依据Domenighini et al.，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167中提供的ADP-核糖基化毒素A亚基和B亚基的比对。
F.生物粘附剂和粘膜粘附剂
生物粘附剂(bioadhesives)和粘膜粘附剂(mucoadhesives)也可以用作主题组合物中的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化透明质酸微球(Singh et al.(2001)J.Cont.Rele.70：267-276)或粘膜粘附剂诸如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可以在所述组合物中用作佐剂。参见例如WO99/27960。
G.颗粒
微颗粒(microparticles)和纳米颗粒(nanoparticles)(例如聚合纳米颗粒)也可以在所述组合物中用作佐剂。微颗粒(典型地为直径～100nm到～150μm，例如直径～200nm到～30μm，或直径～500nm到～10μm的颗粒)和纳米颗粒(典型地为～10nm到～1000nm的颗粒，例如直径～10nm到～100nm，直径～20nm到～500nm，或直径～50nm到～300nm)可以由生物可降解且无毒的材料(例如聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等等，与聚(丙交酯-共-乙交酯)形成。任选地，可以处理颗粒，使它们具有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂诸如CTAB处理)。可以对颗粒的特异性进行改造，使得它们对期望位置投递药物的浓度增加。参见例如Matsumoto et al.，Intl.J.Pharmaceutics，185：93-101，1999；Williams et al.，J.Controlled Release，91：167-172，2003；Leroux et al.，J.Controlled Release，39：339-350，1996；Soppimath et al.，J.Controlled Release，70：1-20，2001；Chawla et al.，Intl.J.Pharmaceutics，249：127-138，2002；Brannon-Peppas，Intl.J.Pharmaceutics，116，1-9，1995；Bodmeier et al.，Intl.J.Pharmaceutics，43：179-186，1988；Labhasetwar et al.，Adv.Drug DeliveryReviews，24：63-85，1997；Pinto-Alphandary et al.，Intl.J.Antimicrobial Agents，13：155-168，2000；Potineni et al.，J.Controlled Release，86：223-234，2003；Kostet al.，Adv.Drug Delivery Reviews，46：125-148，2001；和Saltzman et al.，DrugDiscovery，1：177-186，2002。
颗粒，优选是纳米颗粒，可以组装成具有一定结构的、微米大小尺度的聚集体，它们具有由亲脂性和/或亲水性分子(通常是药用“赋形剂”)的混合物构成的外壳或基质。纳米颗粒可以在上文所述方法中形成，并可掺入细胞物质，其中细胞物质充当颗粒本体、位于颗粒表面上或包裹在颗粒内。聚集颗粒的外壳或基质可包含药用赋形剂诸如脂质、氨基酸、糖、聚合物，还可掺入核酸和/或肽和/或蛋白质和/或小分子抗原。还可以使用抗原性物质的组合。这些聚集颗粒可以在下列方法中形成。
美国专利申请流水号2004/0062718描述了一种用作疫苗的多孔纳米颗粒聚集体颗粒(PNAP)的制备方法。抗原可通过构成纳米颗粒、连接于纳米颗粒表面或包裹于纳米颗粒中而与纳米颗粒相结合，或者可以掺入微颗粒的外壳中，然后引发体液免疫和细胞免疫。其它示例性的PNAP制备方法在Johnson and Prud’homme，Austral.J.Chem.，56：1021-1024，2003中有记载。
这些颗粒如Edwards et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，19：12001-12005，2002所述的那样聚集产生由较小的亚单位颗粒所成的较大颗粒(称为特洛伊/木马颗粒，因为它们保持它们的较小亚单位的独特性质，同时也保持较大颗粒的关键特征)。药物可以包裹在亚单位颗粒中，或者包裹在由较小颗粒聚集体构成的较大颗粒中。
颗粒可采取适于吸入的干粉末形式。在一个具体的实施方案中，颗粒可具有少于约0.4g/cm3的振实密度。本文将具有少于约0.4g/cm3的振实密度的颗粒称为“空气动力学轻颗粒”(aerodynamically light particles)。更优选具有少于约0.1g/cm3的振实密度的颗粒。空气动力学轻颗粒的优选尺寸，例如体积中值几何直径(VMGD)，为至少大约5微米。在一个实施方案中，VMGD为大约5微米到大约30微米。在另一个实施方案中，颗粒具有大约9微米到大约30微米的VMGD。在另一个实施方案中，颗粒的中值直径、质量中值直径(MMD)、质量中值包膜直径(MMED)或质量中值几何直径(MMGD)为至少5微米，例如约5微米到约30微米。空气动力学轻颗粒优选具有大约1微米到大约5微米的“质量中值空气动力学直径”(MMAD)，本文中又称“空气动力学直径”。在一个实施方案中，MMAD为大约1微米到大约3微米。在另一个实施方案中，MMAD为大约3微米到大约5微米。
在另一个实施方案中，颗粒具有小于约0.4g/cm3的包膜质量密度(envelope mass density)，本文中又称“质量密度”。各向同性颗粒的包膜质量密度定义为颗粒质量除以能够将颗粒包入其中的最小球形包膜体积。
振实密度可以使用本领域技术人员知道的仪器，例如双平台微处理器控制振实密度测试仪(Dual Platform Microprocessor Controlled Tap DensityTester)(Vankel，N.C.)或GeopycTM仪(Micrometrics Instrument Corp.，Norcross，Ga.30093)来加以测量。振实密度是包膜质量密度的标准量度。振实密度可以使用USP Bulk Density and Tapped Density，United States Pharmacopiaconvention，Rockville，Md.，10th Supplement，4950-4951，1999的方法来确定。可能促成低振实密度的特征包括不规则的表面构造及多孔结构。
颗粒的直径，例如它们的VMGD，可以使用电区传感仪(electrical zonesensing instrument)诸如Multisizer IIe(Coulter Electronic，Luton，Beds，England)或者激光衍射仪(例如Helos，Sympatec，Princeton，N.J.制造)来测量。其它用于测量颗粒直径的仪器是本领域公知的。样品中颗粒的直径将依赖于颗粒组成及合成方法等因素而不同。可以对样品中颗粒大小的分布加以选择，以实现呼吸道内目标部位中的最优沉积。
可以以适于对呼吸道的选定区域，诸如肺深部或上气道或中气道进行局部投递的材料、表面粗糙度、直径和振实密度来制备颗粒。例如，对上气道投递可以使用较高的密度或较大的颗粒，或者，可以施用样品中带有相同或不同治疗剂的、大小不一的颗粒的混合物，以在一次施用中靶向肺的不同区域。空气动力学直径为大约3到大约5微米的颗粒优选用于对中气道和上气道投递。空气动力学直径为大约1到大约3微米的颗粒优选用于对肺深部投递。
气溶胶的惯性碰撞和重力沉降是正常呼吸条件下气道和肺腺泡中主要的沉积机制(Edwards，J.Aerosol Sci.，26：293-317，1995)。这两种沉积机制的重要性与气溶胶的质量而非与颗粒(或包膜)体积成比例地增加。由于在肺中气溶胶沉积的部位是由气溶胶的质量决定的(至少对于平均空气动力学直径大于约1微米的颗粒是如此)，通过增加颗粒表面的不规则性和颗粒孔隙率而减小振实密度，可以在所有其它物理参数相等的条件下，允许向肺中投递较大的颗粒包膜体积。
可以计算空气动力学直径来提供肺中的最大沉积，这一点在以往是利用直径小于约5微米，优选约2到约3微米的极小颗粒来实现的，这些颗粒随后受到吞噬。选择具有更大的直径但足够轻(因此具有“空气动力学上轻”的特征)的颗粒，可实现同等的肺投递，而尺寸较大的颗粒不被吞噬。相对于具有光滑表面的颗粒，使用具有粗糙或不均匀表面的颗粒可获得更好的投递。
可以制备或分离合适的颗粒，例如通过过滤或离心，来为颗粒样品提供预选择的大小分布。例如，样品中多于约30％、50％、70％或80％的颗粒可具有至少约5微米的选定范围内的直径。一定百分比的颗粒所必须落入的选定范围可以是，例如，约5到约30微米，或者任选地，约5到约15微米。在一个优选实施方案中，至少一部分的颗粒具有约9到约11微米的直径。任选地，还可以制备这样的颗粒样品，其中至少约90％，或任选地约95％或约99％具有选定范围内的直径。颗粒样品中较高比例的较大直径空气动力学轻颗粒的存在，可增强其中掺入的治疗剂或诊断剂对肺深部的投递。大直径颗粒通常意指中值几何直径至少约5微米的颗粒。
优选的靶向抗原呈递细胞(“APC”)的颗粒具有400nm的最小直径，这是APC吞噬的极限。用于穿过组织运输并靶向细胞以供摄取的优选颗粒具有10nm的最小直径。最终的制剂可形成适于肺投递并在室温稳定的干粉末。
H.脂质体
美国专利6,090,406、美国专利5,916,588和EP 0 626 169记载了适合用作佐剂的脂质体制剂的例子。
I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适合在组合物中使用的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。参见例如WO99/52549。这样的制剂还可以包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂与辛苯昔醇(octoxynol)的组合(WO01/21207)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其它的非离子型表面活性剂诸如辛苯昔醇的组合(WO01/21152)。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
J.聚磷嗪(PCPP)
聚磷嗪(polyphosphazene)制剂在例如Andrianov et al.，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne et al.，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196中有记载。
K.胞壁酰肽
适合用作佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(nor-MDP)、和N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺酰-l-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)。
L.咪唑并喹啉化合物
适合在所述化合物中用作佐剂的咪唑并喹啉(imidazoquinoline)化合物的例子包括咪喹莫特(Imiquimod)及其类似物，它们在Stanley，Clin.Exp.Dermatol.(2002)27(7)：571-577；Jones，Curr.Opin.Investig.Drugs(2003)4(2)：214-218；和美国专利4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944及5,525,612中有进一步描述。
M.缩氨基硫脲化合物
缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)化合物的例子，以及配制、制造、和筛选所有适合在所述组合物中作为佐剂的化合物的方法，包括在WO04/60308中记载的那些。缩氨基硫脲用于刺激人外周血单个核细胞以产生细胞因子，例如TNF-α，是尤其有效的。
N.色胺酮化合物
色胺酮(tryptanthrin)化合物的例子，以及配制、制造、和筛选所有适合在所述组合物中作为佐剂的化合物的方法，包括在WO04/64759中记载的那些。色胺酮化合物用于刺激人外周血单个核细胞以产生细胞因子，例如TNF-α，是尤其有效的。
O.人免疫调节剂
适合在所述组合物中用作佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子、及肿瘤坏死因子。
所述组合物还可包括一种或多种上述佐剂的组合方面。例如，下面的佐剂组合物可以用于本发明中：
(1)皂苷和水包油乳液(WO99/11241)；
(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)(见WO94/00153)；
(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；
(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO98/57659)；
(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(见欧洲专利申请0835318，0735898和0761231)；
(6)SAF，含10％鲨烯、0.4％TweenTM 80、5％PluronicTM嵌段聚合物L121、和thr-MDP，或者微流体化成为亚微米乳液，或者涡旋振荡形成颗粒尺寸较大的乳液；
(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％鲨烯、0.2％TweenTM 80、和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分：单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；
(8)一种或多种矿物质盐(例如铝盐)+无毒的LPS衍生物(例如3dPML)；和
(9)一种或多种矿物质盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的核苷酸序列)。
铝盐和MF59是用于可注射疫苗的典型佐剂。细菌毒素和生物粘附剂是用于粘膜投递疫苗，诸如鼻用或吸入疫苗的典型佐剂。其它可用于粘膜疫苗的佐剂在例如Stevceva and Ferrari，Curr.Pharm.Des.，11：801-11，2005和Cox et al.，Vet.Res.，37：511-39，2006中有所讨论。
实施例
实施例1：耻垢分枝杆菌悬液的喷雾干燥
为了举例说明对没有赋形剂的细胞形式进行喷雾干燥会产生过于潮湿而无法制备或加工的粉末，使用耻垢分枝杆菌作为模型微生物。使用Büchi微型喷雾干燥器B-290(BüchiMini Spray Dryer B-290)(BrinkmannInstruments，Westbury，NY)进行喷雾干燥来形成干粉末，其中对入口温度、流速和赋形剂浓度均进行控制。
在不存在赋形剂的条件下将微生物喷雾干燥。将纯耻垢分枝杆菌的溶液在PBS-Tween80中洗涤后，重悬于90mL水中，以得到3x108CFU/mL的细菌浓度。在19.5℃和48％湿度的环境条件下，以入口温度130℃、出口温度50℃、流速22mL/min将该耻垢分枝杆菌溶液喷雾干燥。细菌团块在喷雾干燥器缸体中聚集，未能以粉末形式从旋风分离器喷出。从喷雾干燥器中收集的物料是潮湿的，几乎无法加工。
实施例2：使用亮氨酸喷雾干燥耻垢分枝杆菌
为了举例说明相对少量的赋形剂不能产生成功干燥的粉末，使用亮氨酸作为模型赋形剂将耻垢分枝杆菌喷雾干燥。干燥的溶液由80％(以重量计)的4mg/mL亮氨酸溶液和20％的3x109CFU/mL耻垢分枝杆菌悬液组成400mL溶液。溶液在即将到达喷嘴前在线(in line)混合。在20℃和69％湿度的环境条件下，以入口温度150℃、出口温度60℃、流速8mL/min将溶液喷雾干燥。平均微滴大小估计为50-60微米。该过程通过喷雾干燥器的旋风分离器产生了产物，但产物过于潮湿，得率低。得到了含活细菌的微黄色粉末(图3)。但该粉末结团，且表现的流动性质较差。
实施例3：使用较高浓度的亮氨酸喷雾干燥耻垢分枝杆菌
较高浓度的赋形剂，诸如亮氨酸，可产生良好的喷雾干燥粉末，而更高的赋形剂浓度可增加微生物活力。再次通过将90％和95％的4mg/mL亮氨酸溶液和10％及5％的3x109CFU/mL耻垢分枝杆菌悬液混合制备了400ml的溶液。这些溶液也是在即将到达喷嘴之前在线混合。在20℃和69％湿度的环境条件下，以入口温度150℃、出口温度55℃、流速8mL/min将溶液喷雾干燥。平均微滴大小估计为50-60微米。
表1提供了喷雾干燥操作所得的结果。在所有情况下，喷雾干燥均得到了细微、白色、有活力的粉末，适于气溶胶分散，产物得率较高。活力以含潮霉素的7H9琼脂平板上的菌落形成单位数计算。与90∶10(亮氨酸∶耻垢分枝杆菌)的粉末相比，95∶5的粉末观察到了显著较高的生物体活力(约20-80倍)(图4)，说明在喷雾干燥过程中添加的赋形剂对保护微生物的重要性。根据粉末的大体外观来估计含水量。使用热重分析法(TGA)对含水量加以定量分析。图5是描绘表达绿色荧光蛋白(GFP)的耻垢分枝杆菌的荧光显微照片，这些耻垢分枝杆菌使用90∶10亮氨酸∶耻垢分枝杆菌进行了喷雾干燥。该显微照片显示，粉末的颗粒中只有一部分含有发荧光的耻垢分枝杆菌(绿色)。
表1.用亮氨酸喷雾干燥耻垢分枝杆菌
亮氨酸∶ 耻垢分枝 杆菌比例 CFU入 CFU出 质量入 (mg) 质量出 (mg) ％活力 ％产物 得率 含水量(1-低， 2-中，3-高)
95∶5 1.50x1010 7.00x108 1016 562 8.4％ 55.3％ 1
90∶10 3.00x1010 2.10x107 1682 556 0.2％ 33.1％ 1
95∶5 1.50x1010 7.00x108 1661 1651 4.7％ 99.4％ 2
90∶10 3.00x1010 2.25x107 1682 903 0.1％ 53.7％ 2
表1中的产物得率以终产物中的质量相比于被喷雾溶液中溶质质量的比例来计算。终产物的质量包括粉末中的任何残留水。通常，一部分质量粘附于干燥设备而无法回收。
实施例4：用甘露糖醇喷雾干燥耻垢分枝杆菌
为了证明可以用其它赋形剂来喷雾干燥微生物，使用糖类甘露糖醇进一步进行实验。赋形剂溶液由95％的10mg/mL甘露糖醇溶液和5％的3x109CFU/mL耻垢分枝杆菌悬液组成，溶液体积为200mL，通过在即将到达喷嘴之前在线混合生成。在21.9℃和63％湿度的环境条件下，以入口温度145℃、出口温度55℃、流速12mL/min将溶液喷雾干燥。平均微滴大小估计为50-60微米。喷雾干燥得到了细微、白色、有活力的粉末，适于气溶胶分散，产物得率为50％，含有活细菌。
实施例5：干燥的耻垢分枝杆菌在储存中的活力
为了测定经喷雾干燥的耻垢分枝杆菌在储存过程中的活力，如实施例3那样进行了喷雾干燥，并将所得粉末在密封容器中于4℃、25℃和40℃储存1到2周。活力以平板上的菌落形成单位数计。95∶5亮氨酸∶耻垢分枝杆菌粉末在4℃或25℃储存1周后保留了显著的活力，但在40℃储存后没有显著活力。90∶10亮氨酸∶耻垢分枝杆菌粉末在4℃储存1周后保留了活力，但在更高的温度则无活力。图6显示了95∶5亮氨酸∶耻垢分枝杆菌粉末在25℃储存1周后的电子显微照片。
实施例6：采用冷冻保护剂的喷雾干燥的模拟
为了显示喷雾干燥过程中赋形剂导入的方式可能是活力保留的重要因素，用方程36来模拟在无冷冻保护剂、细胞内和细胞外有等浓度的冷冻保护剂、以及细胞内冷冻保护剂浓度大于细胞外冷冻保护剂浓度这三种不同条件下喷雾干燥过程中的细胞物质体积(图7)。目的是证明一种范式，根据该范式，通过在细胞内、细胞外，或细胞内外两侧引入冷冻保护剂(赋形剂)可以使膜应力最小化。
模拟使用Mathematica程序(Wolfram，Inc.，Champaign，IL)来进行。对所有三个图，初始细胞半径(Rc(0))设定为1μm，初始微滴半径(Rd0)设定为25μm，将相对细胞体积对时间作图。Lp设定为1.0μm/(atm min)；Rgas设定为0.08205745867258821(atm L)/(K mol)；T设定为295.15K。在所有三种情况下，k＝-(Kd LMTD)/(λρ1)(方程33)。通过设定入口温度500℃、出口温度200℃、初始微滴温度20℃和最终微滴温度65℃来求出LMTD。将这些值输入方程30，得到LMTD＝((500℃-20℃)-(200℃-65℃))/(2.303*log10((500℃-20℃)/(200℃-65℃)))。Kd设定为0.02kcal/(m hr℃)；λ设定为530kcal/kg；ρ1设定为1000kg/m3。细胞数(ncells)设定为100，排除体积(Vexcluded)设定为初始体积的0.46倍。设定为10-6。
对于图7中的轨迹(a)，细胞外的冷冻保护剂浓度低于细胞内的冷冻保护剂浓度，细胞外盐的量(xes)设定为0.26M乘以初始微滴体积(Vd0＝4/3π(Rd0)3)，细胞内盐的量(xis)设定为0.26M乘以初始微滴体积，细胞外冷冻保护剂的量(xecp)设定为0mol，细胞内冷冻保护剂的浓度(Cicp(0))设定为1M。使用这些条件，对0到0.105秒的时间求方程36的值，得到轨迹(a)。
对于图7中的轨迹(b)，细胞外或细胞内没有冷冻保护剂，细胞外盐的量和细胞内盐的量(xes和xis)设定为0.26M乘以初始微滴体积。细胞内冷冻保护剂的量(xecp)和浓度(Cicp(0))分别设定为0mol和0M。使用这些条件，对0到0.105秒的时间求方程36的值，得到轨迹(b)。
对于图7中的轨迹(c)，细胞内的冷冻保护剂浓度等于细胞外的冷冻保护剂浓度，细胞外盐的量和细胞内盐的量(xes和xis)设定为0.26M乘以初始微滴体积。细胞内的冷冻保护剂浓度(Cicp(0))和细胞外的冷冻保护剂浓度设定为1M，从而细胞外冷冻保护剂的量(xecp)为1M乘以初始微滴体积。使用这些条件，对0到0.105秒的时间求方程36的值，得到轨迹(c)。
这些结果显示，依赖于导入冷冻保护剂赋形剂的方法，得到差异极大的体积偏移(volume excursion)(或膜应力)分布图。从这一认识可以发展出使细胞活力损失最小化的细胞形式喷雾干燥方法。
实施例7：通过最小化膜渗透应力最优化耻垢分枝杆菌的细胞活力
为了举例说明最小化膜应力可如何改善干燥细胞的活力，如实施例3中那样，将95％的4mg/mL亮氨酸溶液和5％的3x109CFU/mL耻垢分枝杆菌悬液混合，制备了400ml的溶液。但是在这种情况下，没有向耻垢分枝杆菌悬液添加甘油。同样，在没有甘油，并使用等渗盐水(0.9％NaCl)代替前面所有实施例中使用的蒸馏水的条件下，将相同溶液喷雾干燥。溶液也是在即将到达喷嘴时在线混合。在20℃、69％湿度的环境条件下，以入口温度150℃、出口温度55℃、流速8mL/min对溶液进行喷雾干燥。平均微粒大小估计为50-60微米。
表2.使用和不使用甘油对95∶5(耻垢分枝杆菌/亮氨酸)喷雾干燥
甘油 CFU入 CFU出 质量入(mg) 质量出(mg) ％活力 ％产物得率
有 1.50x1010 7.00x108 1016 562 8.4％ 55.3％
无 1.50x1010 1.93x109 1520 830 24.1％ 53.5％
表2提供了用和不用甘油对95∶5亮氨酸/耻垢分枝杆菌混合物进行喷雾干燥操作所得的结果。在所有情况下，喷雾干燥均得到了细微、白色、有活力的粉末，适于气溶胶分散，产物得率较高。活力以含潮霉素的7H9琼脂平板上的菌落形成单位数计算。与使用甘油的95∶5(亮氨酸∶耻垢分枝杆菌)粉末相比，不使用甘油的粉末观察到了显著较高的生物体活力。不使用甘油并使用0.9％等渗盐水对95∶5(亮氨酸∶耻垢分枝杆菌)混合物进行喷雾干燥时，相对于不使用甘油且不使用盐的95∶5(亮氨酸∶耻垢分枝杆菌)，观察到很低的细胞活力(图8)，说明从被喷雾干燥的溶液中去除渗透压活性物质对于在喷雾干燥过程中保护微生物的重要性。
这些结果确证了实施例6的预测，即在细胞物质悬液的干燥过程中，冷冻保护剂或盐的存在可能对细胞膜造成显著的应力，导致活力下降，后者可以推测是干燥过程中细胞死亡所致。
实施例8：耻垢分枝杆菌活力高的喷雾干燥的粉末中细胞含量增加
为了举例说明喷雾干燥的细胞保留高活力可导致喷雾干燥粉末中游离水含量降低并从而导致细胞含量升高，如实施例7中那样，通过混合90％、50％、40％、30％、20％和10％的4mg/mL亮氨酸溶液和10％、50％、60％、70％、80％和90％的3x109CFU/mL耻垢分枝杆菌悬液一不使用甘油且不使用盐，制备了400ml的溶液。同样，在即将到达喷嘴之前将溶液在线混合。在20℃、69％湿度的环境条件下，以入口温度150℃、出口温度55℃、流速8mL/min对溶液进行喷雾干燥。平均微粒大小估计为50-60微米。
图9显示喷雾干燥操作的活力结果。和前面的实施例一样，活力随赋形剂浓度的降低而下降，证明高水平的赋形剂对于良好的细胞活力是必需的。但与前面的实施例不同的是，用低达50％的赋形剂浓度获得了活力良好的细微干粉末。这似乎表明，当细胞完整性得以维持时，和/或当不使用像甘油那样在室温仍保持液态的添加剂时，较低浓度的赋形剂(低于90％)可能提供良好的结果。活力以含潮霉素的7H9琼脂平板上的菌落形成单位数计算，显示的是每个比例四个重复测定的结果。
这些结果显示，除去冷冻保护剂，导致在降低的赋形剂浓度条件下的细胞活力增加。
实施例9：含耻垢分枝杆菌的喷雾干燥粉末的保存期稳定性
为了举例说明在没有冷冻的条件下，细胞活力可以在干燥后维持一段时间，将实施例8中用50∶50和95∶5亮氨酸∶耻垢分枝杆菌制备的粉末置于4℃、25℃和40℃的批量储存条件下，并以含潮霉素的7H9琼脂平板上的菌落形成单位数计算活力。
图10和11显示了作为时间函数的两种粉末的活力结果。活力维持了数月，其中前3个月中活力损失最剧烈，在更长的期间内则活力稳定。储存在4℃条件下的粉末在3个月内保持了超过十分之一的原活力。储存在25℃条件的粉末维持了高于对投递而言最优的106阈值的活力，而储存在40℃条件的粉末维持活力达2个月。50∶50粉末和95∶5粉末之间活力随时间的差异可能是由于细菌浓度不同所致，细菌浓度影响粉末中的含水量。
实施例10：使用单磷脂A的稳定性效果
确定了亲脂性物质单磷脂A(MpLA)对喷雾干燥的耻垢分枝杆菌的稳定性的效果。进行实验以确定是否可以把油性外壳用作保留细菌内的内部水分的手段，以增加其在更长时间点上的活力。用95％的4g/ml亮氨酸溶液和5％的耻垢分枝杆菌悬液，以及0.25％MpLA，如上面所述喷雾干燥耻垢分枝杆菌。以124℃的入口温度和45℃的出口温度对该溶液喷雾干燥。环境温度为31.6℃和34％相对湿度。这些条件得到了66％的质量得率。
如图12A和12B所示，与没有MpLA处理的细菌相比，用MpLA处理的细菌能够在16周的期间内维持活力。在长达1年的储存之后仍测量到活力。
实施例11：多种表面活性剂的效果
为了举例说明可以使用多种分散剂得到上述的结果且不影响活力，使用0.05％泰洛沙泊(前述实施例中使用的分散剂)和0.05％及0.1％PluronicTM-F68制备了95∶5和50∶50的耻垢分枝杆菌制剂。这些实验的结果显示于图13中。与使用泰洛沙泊制备的粉末相比，使用这些PluronicTM-F68没有显著影响所得粉末的活力。
实施例12：含牛分枝杆菌BCG的喷雾干燥粉末的保存期稳定性
为了举例说明我们的结论对疫苗生物体的适用性，我们用牛分枝杆菌BCG进行了类似的实验。我们使用与实施例3相同的方法，不用盐或冷冻保护剂，制备了95∶5亮氨酸∶牛分枝杆菌BCG的粉末，并将干燥后的物料置于4℃、25℃和40℃的批量储存条件下，以7H9琼脂平板上的菌落形成单位数计算活力。图14显示到3个月为止作为时间函数的两种粉末的活力结果。储存在4℃条件下的粉末在3个月的储存过程中大体维持了它们的原活力。储存在25℃条件下的粉末维持了相似的活力，在3个月时有一些损失。这些活力结果与图9和10所示的耻垢分枝杆菌细菌的结果相似。
实施例13：哺乳动物细胞的喷雾干燥
为了证明亮氨酸浓度高而膜渗透应力最小的制剂可进一步适用于非细菌细胞，我们用培养的NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞和原代采集的大鼠心脏成纤维细胞进行了实验。
我们制备了3种制剂：我们用4毫克亮氨酸每毫升蒸馏水来悬浮每毫升1百万个成纤维细胞，其中亮氨酸溶液/细胞溶液的体积/体积比为30/70、50/50和70/30。我们用实施例3中对耻垢分枝杆菌所用的相似条件将这些制剂喷雾干燥。
所有实验均表明，原代采集的大鼠心脏成纤维细胞和NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞经受喷雾干燥过程的存活能力大致相等。较高浓度的亮氨酸似乎导致喷雾干燥时较高的活力；但是，鉴于成纤维细胞的细胞膜比细菌的膜刚性低，对细胞内渗透压活性物质(osmolytically active substances)产生的渗透应力更为敏感，通过在PBS(表3)或“Tyrode”溶液(表4)中喷雾干燥细胞获得了更高的活力和更低的净渗透应力。将细胞和亮氨酸悬浮在PBS或Tyrode中并如上喷雾干燥，其中亮氨酸溶液/细胞溶液的体积/体积比为30/70、50/50和70/30。在后一种情况下，在喷雾干燥后回收了活NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞，并在喷雾干燥后1个月观察到了活NIH 3T3胚胎小鼠成纤维细胞，如图15中所示。
表3.磷酸盐缓冲盐水(PBS)配方
组分 浓度(mg/L)
磷酸二氢钾 144
氯化钠 9000
磷酸氢二钠 795
表4.Tyrode哺乳动物细胞外电解质溶液配方
组分 浓度(mg/L)
氯化钙 265
D-葡萄糖 901
HEPES 1192
氯化镁 203
氯化钾 403
氯化钠 7889
磷酸钠 40
喷雾干燥后，从70/30、50/50和30/70制剂回收活的NIT 3T3胚胎小鼠成纤维细胞和原代采集的大鼠成纤维细胞并铺板。图16和17显示喷雾干燥后第3天和第8天的铺板细胞。这些图显示较高的赋形剂浓度(亮氨酸浓度)在干燥时产生较高的活细胞数。
其它实施方案
已经描述了本发明的数个实施方案。但是，应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的同时，可以作出各种修改。因此，其它实施方案落入所附权利要求的范围。