用于防御辐射损伤的方法和含有天然叶酸的组合物.pdf

公开了保护对象免受电离辐射有害影响的方法。该方法包括向对象施用有效量的至少一种还原叶酸。还公开了含有第一种辐射防护剂和第二种辐射防护剂的辐射防护组合物，其中第一种辐射防护剂是还原叶酸。还公开了保护对象免受紫外线辐射有害影响的方法。

权利要求书
1.  一种保护对象免受电离辐射有害影响的方法，所述方法包括：
向对象施用有效量的至少一种还原叶酸。

2.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸选自四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸、5，10-亚甲基-四氢叶酸、5，10-次甲基-四氢叶酸、5-亚胺甲基-四氢叶酸、7，8-二氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

3.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸选自(6S)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6R)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

4.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸选自消旋四氢叶酸、消旋5-甲基-四氢叶酸、消旋5-甲酰基-四氢叶酸、消旋10-甲酰基-四氢叶酸、消旋5，10-亚甲基-四氢叶酸、消旋5，10-次甲基-四氢叶酸、消旋5-亚胺甲基-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

5.  根据权利要求1的方法，其中的对象正暴露于有害水平的电离辐射。

6.  根据权利要求1的方法，其中的对象处在暴露于有害水平的电离辐射风险之下。

7.  根据权利要求1的方法，其中的电离辐射是γ辐射。

8.  根据权利要求1的方法，其中的电离辐射是X-射线辐射。

9.  根据权利要求1的方法，其中的电离辐射是宇宙辐射。

10.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸口服给药。

11.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸以缓释制剂口服给药。

12.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸静脉内给药。

13.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸以含有还原叶酸的组合物给药。

14.  根据权利要求13的方法，其中组合物进一步含有一种或多种其它生物活性物质。

15.  根据权利要求14的方法，其中一种或多种其它生物活性物质含有辐射防护剂。

16.  根据权利要求15的方法，其中辐射防护剂是碘盐。

17.  根据权利要求16的方法，其中碘盐是碘化钾。

18.  根据权利要求15的方法，其中辐射防护剂是类固醇辐射防护剂。

19.  根据权利要求18的方法，其中类固醇辐射防护剂是雄烯二醇。

20.  根据权利要求13的方法，其中除了还原叶酸外，组合物进一步包括一种或多种其它维生素。

21.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸在有效建立和/或维持还原叶酸稳态血浆水平大于20纳摩尔的条件下给药。

22.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸在有效建立和/或维持还原叶酸稳态血浆水平大于约30纳摩尔的条件下给药。

23.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸以日剂量约0.45微摩尔至约15微摩尔给药。

24.  根据权利要求1的方法，其中还原叶酸以含有约0.45微摩尔至约2毫摩尔的剂量给药。

25.  一种辐射防护组合物，含有：
第一种辐射防护剂，所述第一种辐射防护剂是还原叶酸；和
第二种辐射防护剂。

26.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中还原叶酸选自四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸、5，10-亚甲基-四氢叶酸、5，10-次甲基-四氢叶酸、5-亚胺甲基-四氢叶酸、7，8-二氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

27.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中还原叶酸选自(6S)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6R)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

28.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中还原叶酸选自消旋四氢叶酸、消旋5-甲基-四氢叶酸、消旋5-甲酰基-四氢叶酸、消旋10-甲酰基-四氢叶酸、消旋5，10-亚甲基-四氢叶酸、消旋5，10-次甲基-四氢叶酸、消旋5-亚胺甲基-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

29.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中第二种辐射防护剂是碘盐。

30.  根据权利要求29的辐射防护组合物，其中碘盐是碘化钾。

31.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中第二种辐射防护剂是类固醇辐射防护剂。

32.  根据权利要求31的辐射防护组合物，其中类固醇辐射防护剂是雄烯二醇。

33.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中组合物基本上不含维生素B12。

34.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中组合物含有约0.45微摩尔至约2毫摩尔的还原叶酸。

35.  根据权利要求25的辐射防护组合物，其中第二种辐射防护剂是碘化钾，并且其中组合物含有约1毫克至约500毫克的碘化钾。

36.  根据权利要求35的辐射防护组合物，其中组合物含有约0.45微摩尔至约2毫摩尔的还原叶酸。

37.  一种保护对象免受紫外线辐射有害影响的方法，所述方法包括：
向对象施用含有有效量的至少一种还原叶酸的组合物，其中所述组合物基本上不含维生素B12。

38.  根据权利要求37的方法，其中还原叶酸选自四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸、5，10-亚甲基-四氢叶酸、5，10-次甲基-四氢叶酸、5-亚胺甲基-四氢叶酸、7，8-二氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

39.  根据权利要求37的方法，其中还原叶酸选自(6S)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6R)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

40.  根据权利要求37的方法，其中还原叶酸选自消旋四氢叶酸、消旋5-甲基-四氢叶酸、消旋5-甲酰基-四氢叶酸、消旋10-甲酰基-四氢叶酸、消旋5，10-亚甲基-四氢叶酸、消旋5，10-次甲基-四氢叶酸、消旋5-亚胺甲基-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。

41.  根据权利要求37的方法，其中所述组合物不含有维生素B12或其中所述组合物含有维生素B12的量等于或小于为对象推荐的维生素B12每日允许量的300％。

42.  根据权利要求37的方法，其中所述组合物不含有维生素B12或其中所述组合物含有维生素B12的量等于或小于为对象推荐的维生素B12每日允许量的200％。

43.  根据权利要求37的方法，其中所述组合物不含有维生素B12或其中所述组合物含有维生素B12的量等于或小于为对象推荐的维生素B12每日允许量。

44.  根据权利要求37的方法，其中该组合物口服给药。

45.  根据权利要求37的方法，其中该组合物局部给药。

46.  根据权利要求37的方法，其中组合物是缓释组合物，并且其中组合物口服给药。

说明书用于防御辐射损伤的方法和含有天然叶酸的组合物
本申请要求2005年6月21日提交的美国临时专利申请序列号60/692,401的优先权，在此将该临时申请引入作为参考。
发明领域
本发明一般性涉及用于保护对象免受辐射损伤的方法和组合物，更具体涉及使用天然叶酸保护对象免受由电离辐射和紫外线辐射造成的损伤的方法和组合物。
发明背景
人和其他动物都长年暴露于不同来源的辐射中。许多类型的辐射，例如紫外线、x-射线和γ-射线会导致分子和细胞水平的损伤。日光中的可见光，尤其是紫外光A和B被内源性和外源性物质吸收后，所述物质则能够裂解和/或氧化蛋白质、脂质和DNA，从而促进光敏反应。另一方面，电离辐射会促进颇具反应性的溶剂化电子的生成，进而促进羟基自由基的生成。
生物可通过修复损伤或在反应性物质产生损伤前将其消除来抵抗放射的有害作用。然而，暴露于辐射的后果可以是相当严重的。
例如，从事涉及暴露(或可能暴露)于辐射的职业例如如核能或核武器工业的人员，可能受到职业剂量的电离辐射。即使没有灾变事件，核能工业的工作人员也比普通公众遭受到更高水平的辐射。
军事人员，例如驻守以核反应堆作为动力的船只的军人和需要在被放射性尘埃污染的区域作业的士兵，冒着与暴露于电离辐射相似的风险。职业性暴露也可能发生在被招来处理涉及核反应堆和放射性物质的灾变事件的抢救及紧急救护人员中。
核武器爆炸(或是经验性的，作为战争的结果，和/或作为恐怖活动的结果)；核废料储存设施、核燃料加工和再加工中心的锕系元素的排放；号称“肮脏炸弹”的爆炸；天然存在的放射性物质，如氡气或铀；放射治疗；诊断性x-射线；宇宙射线；以及高海拔飞行和/或太空旅行引起的其它暴露于电离辐射等，也可能导致暴露于电离辐射。
慢性剂量是指随着时间推移所接受的低水平(如100-5000毫雷姆)渐增的或持续辐射的剂量。慢性剂量的例子包括每年的全身剂量为约5000毫雷姆，这是在核电厂工作的成年人通常所接受的剂量。相对照的是，据建议，普通人每年的接受量不应高于100毫雷姆。慢性剂量会产生长期的细胞毒性和遗传效应，例如，表现为日后射线诱发的癌症发展的风险增加。流行病学研究发现，每毫雷姆的全身辐射剂量将使预计死于癌症的终生风险增加0.04％。
虽然抗辐射服和其他防护工具可有效减少辐射照射，然而这些工具昂贵而笨重，并且通常不向公众发售。此外，使用防辐射服不能切实和/或有效地抵抗渐增或持续的辐射剂量。因此，需要提供全身防护抵抗可预期的或不慎暴露于电离辐射，例如因职业或环境照射而发生。
由于以上所有原因，一直需要防御辐射损伤的方法和组合物，本发明正是针对解决这方面的需要。
发明概述
本发明一方面涉及一种保护对象免受电离辐射的有害影响的方法。该方法包括向对象施用有效量的至少一种还原叶酸。
本发明还涉及一种辐射防护组合物，该组合物包括第一种辐射防护剂和第二种辐射防护剂，其中第一种抗辐射剂是还原叶酸。
本发明还涉及一种保护对象免受紫外线辐射有害影响的方法。该方法包括向对象施用一种含有有效量的至少一种还原叶酸的组合物，并且所述组合物基本上不含维生素B12。

附图简述
图1为表示5-甲基四氢叶酸(“5-MTHF”)抑制叶酸光降解作用的图。样本采集于光照期间的不同时间，用HPLC分析，分析条件为在Luna苯基-己基5μm(25×0.46cm)柱(Phenomenex)中，用pH2.8的磷酸铵(以铵计20mM)/乙腈(17∶1)以1.5ml/分钟的流速洗脱，用Waters 996光电二极管阵列分光计进行紫外吸收检测。方形表示5-MTHF浓度，圆形表示叶酸浓度。
图2A-2C是显示玫瑰红(Rose Bengal)对5-MTHF光降解作用的图。图2A中，25μM、pH7.4的5-MTHF用40W钨丝灯泡的光照射，所述光在100％O2(圆形)、空气(正方形)或氩气中的1.8％O2(三角形)中有5μM玫瑰红和900U超氧化物歧化酶(“SDO”)存在下，通过Wratten#16凝胶滤光器。图2B中，25μM、pH7.4的5-MTHF用40W钨丝灯泡的光照射，所述光在存在100％O2以及存在10μM玫瑰红和不含叠氮化物(三角形)、含有0.5mM叠氮化物(正方形)、或5mM叠氮化物(圆形)的SOD下，通过Wratten#16凝胶滤光器。图2C中，25μM、pH7.4的5-MTHF用40W钨丝灯泡的光照射，所述光在存在100％O2以及存在10μM孟加拉玫瑰红和不含抗坏血酸(菱形)、含有0.2mM抗坏血酸(三角形)、1mM抗坏血酸(正方形)或2mM抗坏血酸(圆形)的SOD下，通过Wratten#16凝胶滤光器。
图3为凝胶电泳试验图谱，显示5-MTHF抑制蝶呤-6羧酸(“PCA”)催化的UVA介导的DNA损伤。图的上部中，超螺旋质粒DNA，PBR322(0.1g)在仅存在50μM PCA下或在PCA和如实施例4中所述的连续加入的5-MTHF的共同存在下，暴露于UVA80分钟。图的下部中，超螺旋质粒DNA，PBR322(0.1g)在仅存在50μM叶酸、或叶酸和50μM5-MTHF共同存在、或仅存在5-MTHF的条件下，暴露于UVA80分钟。上述各种情形中，反应混合物(10μl)然后用琼脂糖凝胶电泳处理。显示超螺旋型(S)、缺口环型(松环)(R)和线型(L)的位置。
图4说明了5-MTHF光-抗氧活性的可能机制。当单态氧由于直接与光活化的玫瑰红(“RB”)反应而浓度低时，5-MTHF在低氧下以加快的速度耗尽。在导致单态氧形成增多的高氧水平中，5-MTHF耗尽减慢。
发明详述
本发明在其一个方面涉及一种保护对象免受电离辐射有害影响的方法。该方法包括向对象施用有效量的至少一种还原叶酸。
在此所用的“对象”是指可以由防御电离辐射的一种或多种有害影响中受益的任何生物体。适合的对象的实例包括动物，如哺乳动物、家样动物、野生动物、牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、山羊、母牛、牛、绵羊、猪、马、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、老虎、熊、狮、鸟、有袋类动物等。在此所用的“对象”也意味着包括人类，如男人、女人、成年人、年轻人和儿童。为了加以说明，合适的对象意味着包括正遭受暴露于有害等级或潜在有害等级的电离辐射中的人类或其他对象；以及处于遭受暴露于有害等级或潜在有害等级的电离辐射的风险中的人类或其他对象。本文中，“电离辐射的有害等级”是指大于纯粹背景水平的电离辐射的任何等级。“电离辐射的有害等级”是指包括大于约1000毫雷姆的急性辐射剂量，如大于约2000毫雷姆，大于约3000毫雷姆，大于约4000毫雷姆，大于约5000毫雷姆，大于约10,000毫雷姆，大于约20,000毫雷姆，大于约50,000毫雷姆，大于约100,000毫雷姆，大于约200,000毫雷姆，和/或大于约500,000毫雷姆。“电离辐射的有害等级”意味着还包括连续的、间歇性的或其他形式的慢性辐射剂量，总计大于每年约100毫雷姆，例如大于每年约200毫雷姆，大于每年约300毫雷姆，大于每年约400毫雷姆，大于每年约500毫雷姆，大于每年约600毫雷姆，大于每年约700毫雷姆，大于每年约800毫雷姆，大于每年约900毫雷姆，大于每年约1000毫雷姆，大于每年约2000毫雷姆，大于每年约3000毫雷姆，大于每年约4000毫雷姆，大于每年约5000毫雷姆，和/或大于每年约10,000毫雷姆。合适的人类对象包括受雇于或参观核电设施(如核电厂、核燃料加工或再加工设施、核燃料储存设施等等)的人；在核电设施(如核电厂、核燃料加工或再加工设施、核燃料储存设施等等)附近生活、工作、上学或度过大量时间的人；驻守或参观核动力潜艇和其他类型的核动力船只的人；驻守或参观核动力潜艇和其他类型的核动力船只的人；在核武器尘埃污染地区生活或经营的平民；在核武器尘埃污染地区作业的军人；处理核事故的紧急事故处理人员；在被恐怖分子释放的放射性物质污染的地区生活或作业的平民、军人和紧急事故处理人员；在具有高浓度氡气的建筑物中生活、工作、上学或度过大量时间的人；宇航员和其他太空旅行者；经常在高海拔飞行的人，如飞行员、航空服务人员等；罹患核酸修复酶缺陷的人；等等。还有或是或者，对象可以是叶酸缺乏的人，或对象可以是叶酸不缺乏的人。用于本文，如果对象的还原叶酸稳态血浆水平低于对象的正常水平，对象被看作叶酸缺乏。对人类对象而言，为了本发明的目的，如果人类对象的还原叶酸稳态血浆水平低于20纳摩尔，则人类对象被看作叶酸缺乏。反之，为了本发明的目的，如果人类对象的还原叶酸稳态血浆水平等于或大于20纳摩尔，则人类对象被看作叶酸不缺乏。
在此所用的“电离辐射”意思是包括，例如，x-射线、γ射线、宇宙射线、β粒子、α粒子、高能重核子、高能质子、高速电子、正电子和太阳粒子。各种活动都可能造成暴露于电离辐射，如高海拔飞行、太空旅行、放射治疗、事故等造成的暴露。
电离辐射内容中所用的“保护”是指任何可测量或其他可观察的一种或多种电离辐射有害影响的降低。所述有害影响的降低可直接确定，如通过监测DNA或其他分子的变化，或间接的，通过定性或定量评价电离辐射照射所造成的对象的症状。如前所述，保护并不需要是、并且在许多情况下也不能是完全(100％)降低电离辐射的有害影响。为了说明，任何降低电离辐射的任一(或二或三或更多)有害影响都被视为“保护”对象免受电离辐射的有害影响。所述降低可根据有害影响的严重性、有害影响的持续时间，或两者来观察；以及，如前所述，其可定性或定量。
按照本发明方法可保护对象免受的电离辐射的有害影响的实例包括：放射病、脱发(斑秃)、虚弱、疲倦、恶心、呕吐、腹泻、皮肤烧伤、消化道出血、粘膜出血、消化道糜烂、口腔粘膜糜烂、遗传缺陷、造血和/或免疫活性细胞破坏、不育、骨髓癌和其它癌症类型、早衰、死亡、肝脏的静脉闭塞疾病、脑血管的慢性血管增生、白内障和肺炎。
可在对象暴露于电离辐射之前和/或期间施用还原叶酸，这取决于(部分取决于)电离辐射暴露的性质。例如，暴露为慢性的(或暴露的风险在较长一段时间内升高)的情况下，可定期施用还原叶酸，如每天一次、每天多次(如每天两次、每天三次、每天四次、每天六次等)，或持续施用(如用缓释制剂施用还原叶酸的情况)。可施用还原叶酸以保持血浆浓度在需要保护的时间段中大于稳态水平。为了本发明的目的，稳态水平是当空腹和事先任何叶酸补充约24小时后测量的血液的血浆中还原叶酸的浓度。不需要测量每个人的血浆水平，而是，他们可在一组对象的药代动力学数据的基础上预测。
据认为，还原叶酸的保护效果在其血浆浓度达到最高时达到最佳。出现最高血浆浓度的时间(Tmax)可取决于还原叶酸施用的制剂和剂量。例如，溶液剂达到Tmax通常为0.5-2.0小时(如0.5-1.0小时之间)，而其他制剂可能有更长的Tmax。举例说明，如果辐射照射预期发生在已知的未来时间，可取的施用(或推荐施用)还原叶酸的时间应比预期的照射时间提前约Tmax(溶液剂为0.5-2.0小时)。更提前施用(即比预期的照射时间提前得Tmax长)或更推后施用(即比预期的照射时间提前得比Tmax短)也能产生一定水平的保护作用，虽然该保护作用不是最佳水平。如前所述和以下将讨论的内容，推荐施用的时间比预期照射的时间早至少Tmax是有利的，在对象暴露于电离辐射期间继续按时施用还原叶酸(如每天一次或多次)达一段时间也是有利的。连续多剂量或缓释制剂可用于延长还原叶酸血浆水平超过稳态水平的时间。静脉给药可用于实现更快增加还原叶酸的血浆浓度。对人类对象而言，还原叶酸可被施用从而达到和/或维持对象还原叶酸的血浆浓度值大于20纳摩尔，如大于约30纳摩尔，大于40纳摩尔，大于约50纳摩尔，大于60纳摩尔，大于约70纳摩尔，大于约80纳摩尔，大于约90纳摩尔，大于约100纳摩尔，大于约150纳摩尔，大于约200纳摩尔，大于约250纳摩尔，大于约300纳摩尔，大于约350纳摩尔，大于约400纳摩尔，大于约450纳摩尔，大于约500纳摩尔，大于约600纳摩尔，大于约700纳摩尔，大于约800纳摩尔，大于约900纳摩尔，大于约1微摩尔，大于约2微摩尔，大于约5微摩尔，大于约10微摩尔，大于约20微摩尔，大于约30微摩尔，大于约40微摩尔，大于约50微摩尔等等。
在本发明方法的另一实施方案中，给对象按时施用还原叶酸(如每天)，使对象的还原叶酸稳态血浆水平值升高至大于对象可能被认为叶酸缺乏的值。例如，对人类对象而言，可给人类对象按时施用还原叶酸(如每天)，使人类对象的还原叶酸稳态血浆水平值增加到大于20纳摩尔，如大于约30纳摩尔，大于40纳摩尔，大于约50纳摩尔，大于60纳摩尔，大于约70纳摩尔，大于约80纳摩尔，大于约90纳摩尔，大于约100纳摩尔，大于约120纳摩尔，大于约140纳摩尔，大于约160纳摩尔，大于约180纳摩尔，大于约200纳摩尔等等。通过使对象的还原叶酸稳态血浆水平升高至高于本领域中被认为缺乏的值，本发明的方法可用于保护对象免受不能预期的电离辐射暴露。
如前所述，还原叶酸可在对象暴露于电离辐射之前和/或期间施用，取决于(部分取决于)电离辐射暴露的性质。可以理解的是，暴露于涉及放射性物质的电离辐射中的对象可能成为被放射性物质污染(如通过吸入放射性气体、摄入放射性物质、污染皮肤或衣物、吸收放射性碘等)，因此在对象离开或移除电离辐射原发来源(如核事故现场，核袭击现场，恐怖分子辐射/核爆炸现场等)后的一段时间，对象可能将继续暴露于电离辐射(或可有继续暴露于电离辐射的风险)。在对象离开或移除电离辐射原发来源后，而对象却由于被放射物质污染而继续暴露于电离辐射中(或者对象处于所述继续暴露的风险下)，对象施用还原叶酸应被视作在对象暴露于电离辐射“期间”施用。
如前所述，本发明的方法涉及给对象施用至少一种还原叶酸。合适的还原叶酸包括：四氢叶酸、5-甲基-四氢叶酸、5-甲酰基-四氢叶酸、10-甲酰基-四氢叶酸、5，10-亚甲基-四氢叶酸、5，10-次甲基-四氢叶酸、5-亚胺甲基-四氢叶酸、7，8-二氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。这些可作为其天然异构体施用：(6S)-四氢叶酸、5-甲基-(6S)-四氢叶酸、5-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6R)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6R)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6S)-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。上述天然异构体也可与相应的非天然异构体共同施用((6R)-四氢叶酸、5-甲基-(6R)-四氢叶酸、5-甲酰基-(6R)-四氢叶酸、10-甲酰基-(6S)-四氢叶酸、5，10-亚甲基-(6S)-四氢叶酸、5，10-次甲基-(6S)-四氢叶酸、5-亚胺甲基-(6R)-四氢叶酸、及其聚谷氨酰衍生物)，或者它们可单独施用(即基本上无相应的非天然异构体)。举例说明，合适的还原叶酸包括消旋四氢叶酸、消旋5-甲基-四氢叶酸、消旋5-甲酰基-四氢叶酸、消旋10-甲酰基-四氢叶酸、消旋5，10-亚甲基-四氢叶酸、消旋5，10-次甲基-四氢叶酸、消旋5-亚胺甲基-四氢叶酸及其聚谷氨酰衍生物。
如前所述，还原叶酸可联合施用(如5-甲酰基-四氢叶酸和5-甲基-四氢叶酸的混合物)，“还原叶酸”意味着也包括这样的混合物。“还原叶酸”还意味着包括聚谷氨酰衍生物；以及还原叶酸的谷氨酸侧链的单烷基、双烷基、单苯甲基和/或双苯甲基酯。据认为，还原叶酸的谷氨酸侧链的单烷基、双烷基、单苯甲基和/或双苯甲基酯特别适用于外用制剂。
还原叶酸可为游离酸的形式或盐的形式，在此所用的“还原叶酸”也意味着包括游离酸和盐的形式。合适的盐形式的实例包括盐酸盐、钠盐、钾盐和镁盐。作为另一个实例，还原叶酸可以是钙盐的形式。还原叶酸的盐形式和晶体结构有些影响还原叶酸的稳定性和溶解性，这可根据具体制剂的需要而优化。合适的盐形式也包括其中反离子为有机铵碱的盐。最终组合物的pH也可根据使用的特定还原叶酸和制剂中的其他组分(如果有)的稳定性而优化，这是营养加工和叶酸化合物领域所公知的。
还原叶酸可单独给药或以组合物给药，组合物中含有除还原叶酸以外的一种或多种其他组分。合适的剂型的实例包括肠道(如口服、胃内、或经幽门)、肠外(肌肉、静脉、腹膜内、直肠、阴道、及皮下)、外用与眼用剂型。
举例说明，还原叶酸可以补充剂的形式口服给药。如丸剂、片剂、咀嚼片、胶囊、粉剂、糖浆、悬浮液、溶液剂、和软嚼剂均是施用防御电离辐射的还原叶酸的适当形式。也可使用长效、缓释和肠溶制剂。口服给药补充剂的合适剂型包括片剂、分散粉末、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、糖浆剂和酏剂。片剂的惰性稀释剂和载体包括，例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖和滑石。片剂也可含有粒化剂和崩解剂，如淀粉和褐藻酸；粘合剂，如淀粉，明胶，和阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁，硬脂酸和滑石。片剂可以不包衣或通过已知技术包衣以便延迟崩解和吸收。可用于胶囊的惰性稀释剂和载体包括，例如，碳酸钙、磷酸钙和高岭土。悬浮液、糖浆剂和酏剂可含有常规赋形剂，如甲基纤维素、西黄蓍胶、藻酸钠；润湿剂，如卵磷脂和聚氧乙烯硬脂酸酯；和防腐剂，如对-羟基苯甲酸乙酯。在口服给药的剂型中还可存在其他惰性成分。
如前所述，口服剂型可含有惰性材料，如填充剂、粘合剂、稳定剂、甜味剂，包括营养性甜味剂(如蔗糖、山梨醇和其他多元醇)和非营养性甜味剂(如糖精、阿斯巴甜、安赛蜜K)、着色剂、调味剂、缓冲剂、盐、包衣剂等等补充剂和药用制剂领域技术人员所公知的。另外或是或者，口服剂型也可含有一种或多种其它(即，除还原叶酸之外)的生物活性物质。可存在于组合物中的所述其它生物活性物质的实例包括：其它维生素和/或营养剂(如叶酸；维生素B1；维生素B2；维生素B3；维生素B5；维生素B6；维生素B12；维生素C；维生素A和其前体，如β-胡萝卜素；维生素D；维生素E，包括维生素E异构形式和衍生物；维生素K；生物素；泛酸；蛋氨酸；胆碱；牛磺酸；肉毒碱；乙酰肉毒碱；糖；脂质；氨基酸，如谷氨酰胺、精氨酸和蛋氨酸；和蛋白质)，还原剂和抗氧化剂、辐射保护剂(如碘化物，如碘化钾和其它碘盐；甾族辐射保护剂，尤其指已知用于增强免疫系统保护性响应的类固醇和类固醇衍生物，如DHEA、5-雄烯二醇和其它雄烯二醇以及雄烯三醇及其衍生物)，硫醇(如谷胱甘肽、谷胱甘肽提升前体、谷氨酰胺、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、α-硫辛酸、胱氨酸-甘氨酸、胱氨、S-烯丙基半胱氨酸亚砜、氨乙基异硫脲、巯乙基胍、2-巯丙酰甘氨酸)、硒盐、硒化酵母、硒代蛋氨酸、辅酶Q10、氨磷汀、N-叔-丁基羟胺和其他N-羟胺衍生物、褪黑激素、超氧化物歧化酶、其衍生物和模拟-金属络合物、螯合剂、植物化学物质、多酚、天然产物的提取物包括药草、中药、印度草药制品、茶叶提取物、二硫酚硫酮、十字花科植物、类黄酮、姜黄素、甲基黄嘌呤、银杏叶提取物和矿物质(如硼、钙、磷、铬、铜、锰、镁、镍、钠、钼、钾、铁、硒、硅、钒、和锌)。进一步举例说明，本发明组合物中可使用的其它生物活性物质包括必需营养物质，如那些已经汇编在许多发表的资料来源中的，包括Shils等编著的Modern Nutrition in Health and Disease，第八版，Philadelphia：Lea and Febiger(1994)，在此将其引入作为参考。
为了说明，在本发明方法的一个具体实施例中，还原叶酸以组合物的形式给药，该组合物中含有还原叶酸和一种或多种辐射防护剂。辐射防护剂的实例包括碘盐，如可有效减少从环境中吸收放射性碘的量的碘化钾。虽然补充低水平的碘盐可在一定程度上提供防御甲状腺摄入放射性碘，但是日剂量为约1mg至约500mg(如每天约8mg至约260mg的KI，约16mg至约130mg)被认为特别有效。关于使用KI减少由环境吸收放射性碘的细节提出于，例如美国卫生和人类服务部，食品和药品管理局，药物评价和研究中心(U.S.Department of Health andHuman Services，Food and Drug Administration，Center for DrugEvaluation and Research(CDER))(Rockville，Maryland)的″Guidance：Potassium Iodide as a Thyroid Blocking Agent in Radiation Emergencies″：(2001年12月)，在此将其引入作为参考。进一步说明，辐射防护剂可以是类固醇辐射防护剂，如雄烯二醇。如本领域技术人员所理解的，含有还原叶酸和其他辐射防护剂(即除了辐射防护性还原叶酸之外)的组合物中，可以进一步含有其他组分，如惰性材料和/或生物活性物质，例如组合物除了还原叶酸还含有一种或多种其他维生素的情况。举例说明，在某些实施方案中，所述组合物进一步含有维生素B12，而在其它实施方案中，所述组合物则基本上不含维生素B12。在本文内容中所用的“基本上不含维生素B12”是指组合物中的维生素B12的水平不足以对该组合物发挥的防御电离辐射有害影响的效果时产生可观的作用。举例说明，在本文保护对象免受电离辐射有害影响的组合物中，组合物不含维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的300％的维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的200％的维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许剂量的维生素B12；含有浓度小于0.1mg/ml维生素的B12；含有浓度小于0.08mg/ml的维生素B12；含有浓度小于0.05mg/ml的维生素B12；含有含量小于20μg(干重)的维生素B12；含有含量小于15μg(干重)的维生素B12；含有含量小于10μg(干重)的维生素B12；和/或含有含量小于8μg(干重)的维生素B12；和/或含有含量小于6μg(干重)维生素B12，上述组合物都被视为“基本上不含维生素B12”。在此所用“推荐每日允许量”是指美国的推荐每日允许量，维生素B12为6μg/天。
还原叶酸也可作为用一种或多种还原叶酸强化的食品口服。食品可以是单一成分食物，例如水果和水果汁(如橘子汁)、乳制品(如牛奶)、蔬菜(如菠菜)、其他这样的单一成分食物。食品也可以是由两种或多种单组分食物制成的多组分食物。通常，食品含有不同浓度的内源性还原叶酸。根据所需加工的性质，强化通常最好在任何特定的破坏性步骤后进行，这是食品强化领域所公知的。由于食品中存在的内源性还原叶酸含量可能不同，通过例如分析一批产品样本来定量确定食物或食物制品中还原叶酸的最终含量(摩尔量)是有利的。许多分析方法(如微生物生长依赖、基于叶酸结合蛋白的分析、HPLC和GC)可用于测量食物、食物制品和补充剂中的还原叶酸含量。
无论向人类对象口服施用的还原叶酸的形式是补充剂的形式、强化食品的形式、还是食物制品的形式，每剂施用的还原叶酸单位剂量的总量可在约0.45微摩尔至约2毫摩尔的范围内(如果还原叶酸为异构体混合物，则以天然异构体组分计)，如从0.45微摩尔至2毫摩尔，从约0.9微摩尔至约2毫摩尔，从0.9微摩尔至2毫摩尔，从约1.8微摩尔至约2毫摩尔，从1.8微摩尔至2毫摩尔，从约0.45微摩尔至约1毫摩尔，从约0.9微摩尔至约1毫摩尔，从约1.8微摩尔至约1毫摩尔，从约0.45微摩尔至约0.5毫摩尔，从约0.9微摩尔至约0.5毫摩尔，从约1.8微摩尔至约0.5毫摩尔，从约0.45微摩尔至约100微摩尔，从约0.9微摩尔至约100微摩尔，和/或从约1.8微摩尔至约100微摩尔。
如前所述，口服给药可单剂量、多剂量或持续进行。当然，单剂量中还原叶酸的量将部分取决于剂量给药方案和在一定时间内要给对象施用的还原叶酸的总量(如每天)。防御慢性暴露于电离辐射的合适的日剂量范围为：从约0.45微摩尔至约15微摩尔，从约0.9微摩尔至约15微摩尔，从0.9微摩尔至15微摩尔，从约1微摩尔至约15微摩尔，从约2微摩尔至约12微摩尔，从约3微摩尔至约10微摩尔，从约5微摩尔至约8微摩尔等等。
适于肠胃外给药的剂型包括溶液剂、悬浮液、分散剂、乳剂等等。也可以制成无菌固体组合物的形式，其可在使用前即刻溶解或悬浮在无菌注射用介质中。其也可含有本领域公知的悬浮剂和分散剂。肠胃外给药的例子为肌肉、静脉、直肠和皮下给药。
如前所述，还原叶酸可以通过口服和胃肠外给药之外的途径施用。例如，还原叶酸可用适于眼部给药的滴剂、膏剂、或凝胶溶液或悬浮液对眼睛给药。还原叶酸也可局部给药，例如常用的外用乳膏、洗剂、喷雾或凝胶基质。如本技术领域公知的，外用制剂可得益于加入促进皮肤渗透的给药体系(如脂质体等)。举例说明，外用剂型可制成每平方米覆盖面积含有约0.05微摩尔至约1毫摩尔，例如0.05微摩尔至1毫摩尔，约0.1微摩尔至约0.5毫摩尔，从约0.5微摩尔至约0.1毫摩尔(如果还原叶酸为异构体混合物，则以天然异构体组分计)。优选外用制剂预先施用至对象预期暴露的皮肤区域。加用可用于维持还原叶酸长时间的存在，或加用可用于明显暴露于水的事件中。
关于以上描述的组合物配制的进一步详述，如用于外用、胃肠或胃肠外给药的组合物可参见例如，Handbook of PharmaceuticalExcipients，第三版(2000)，American Pharmaceutical Association；TheTheory and Practice of Industrial Pharmacy，第三版，Lachman等人.1986；Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets Volume Edition，Christopher T(编著)，1995；and Remington′s Pharmaceutical Sciences，2000，在此将其引入作为参考。
可以理解的是，实际上优选的本发明还原叶酸给药量将根据特定的还原叶酸、特定的配制的组合物和给药方式而变化。本领域技术人员可考虑可能会改变还原叶酸效用的许多因素(如体重、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、对象情况、联合用药、反应敏感性和严重性、以及对象所暴露的电离辐射的类型、强度和时间)。在最大耐受剂量内，给药可以连续或定期进行。本领域技术人员用常规的给药剂量试验，可以确定给定条件下的最佳给药速度。
本发明另一方面涉及保护对象免受紫外线辐射有害影响的方法。该方法包括向对象施用一种组合物，该组合物包括有效量的至少一种还原叶酸，并基本上不含维生素B12。
如前所述，在此所用“对象”是指任何可以从防御紫外线辐射的一种或多种有害影响中受益的生物体。适合的对象的实例包括动物，如哺乳动物、家养动物、野生动物、牛科动物、马科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、山羊、母牛、牛、羊、猪、马、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、虎、熊、狮、鸟、有袋类动物等等。在此所用的“对象”也意味着包括人类，如男人、女人、成年人、青年人和儿童。为了说明，合适的对象意味着包括正暴露于有害等级或潜在有害等级的紫外线辐射中的人类和其他对象；以及处于暴露于有害等级或潜在有害等级的紫外线辐射的风险中的人类或其他对象(如应会长时间户外工作或呆在户外的个人和暴露于人工紫外线辐射源如日晒床的个人)。另外或是或者，对象可以是叶酸缺乏的人，或者对象可以是叶酸不缺乏的人。用在这里，如果对象的还原叶酸稳态血浆水平低于对象的正常水平，则对象被看作叶酸缺乏。对人类对象而言，为了本发明的目的，如果人类对象的还原叶酸稳态血浆水平低于20纳摩尔，人类对象被看作叶酸缺乏。反之，为了本发明的目的，如果人类对象的还原叶酸稳态血浆水平等于或大于20纳摩尔，人类对象被看作叶酸不缺乏。
在此所用的“紫外线辐射”是指包括例如UV-A辐射、UV-B辐射、UV-C辐射、真空UV辐射、和以上两种或多种紫外线辐射的联合。
本文紫外线辐射中所用的“保护”指任何可测量或可其他方式观察的一种或多种紫外线辐射有害影响的降低。所述有害影响的降低可直接测定，如通过检测DNA或其他分子的变化，或间接测定，通过定性或定量评价紫外线辐射暴露所造成的对象的症状。如前所述，保护不需要且在许多情况下也不能是紫外线辐射的有害影响的彻底(100％)降低。为了举例说明，任何降低紫外线辐射的任一(或二或三或更多)有害影响都被视为“保护”对象免受紫外线辐射的有害影响。所述降低可根据有害影响的严重性、有害影响的时程，或两者来观察；以及，如前所述，这可以是定性或定量的。
对象可通过本发明方法防御的紫外线辐射的有害影响的例子包括：皮肤的光老化、皮肤皱纹、DNA损伤和其他类型的细胞损伤、增加癌前皮肤病变的风险和发生率、增加癌变的风险和发生率、增加黑素瘤和其他类型癌症的风险和发生率、以及死亡。
可在对象暴露于紫外线辐射之前和/或期间施用天然叶酸，这取决于(部分取决于)紫外线辐射暴露的性质。例如，暴露是慢性的(或暴露的风险在一段长时间内升高)的情况下，可定期施用还原叶酸，如每天一次、每天多次(如每天两次、每天三次、每天四次、每天六次等)，或连续施用(如用缓释制剂施用还原叶酸的情况)。可施用还原叶酸，以在需要保护的时间段期间，保持血浆浓度大于稳态水平。如上所述，为了本发明的目的，稳态水平是当空腹和事先任何叶酸补充约24小时后测量的血液血浆中还原叶酸的浓度。血浆水平不需要每个人都测量，而是，它们可在一组对象的药代动力学数据基础上预测。
据认为，还原叶酸在其血浆浓度达到最高后的时间里，其保护效果达到最佳。达到最高浓度的时间(Tmax)可取决于还原叶酸施用的剂型和剂量。例如，溶液剂通常在0.5-2.0小时(如0.5-1.0小时)之间达到Tmax，而其他剂型可能有更长的Tmax。举例说明，在暴露于紫外线辐射预期发生在已知的未来时间的情况下，可取的是比预期的暴露时间提前约Tmax(溶液剂为0.5-2.0小时)施用(或推荐施用)还原叶酸。更提前施用(如比预期的紫外线暴露时间提前得比Tmax长)或更推后施用(如比预期的紫外线暴露时间提前得比Tmax短)也能产生一定水平的保护，虽然该保护水平可能不是最佳的。如前所述和以下将进一步讨论的内容，推荐比预期的紫外线暴露时间提前至少Tmax施用是有利的，在对象暴露于紫外线辐射期间，持续按时施用还原叶酸(如每天一次或多次)也是有利的。连续多剂量或缓释制剂可用于延长还原叶酸血浆水平大于稳态水平的时间。作为进一步说明，对人类对象而言，还原叶酸可对人类对象施用，从而使对象还原叶酸的血浆水平达到和/或维持在大于20纳摩尔的值，如大于约30纳摩尔，大于约40纳摩尔，大于约50纳摩尔，大于60纳摩尔，大于约70纳摩尔，大于约80纳摩尔，大于约90纳摩尔，大于约100纳摩尔，大于约150纳摩尔，大于约200纳摩尔，大于约250纳摩尔，大于约300纳摩尔，大于约350纳摩尔，大于约400纳摩尔，大于约450纳摩尔，大于约500纳摩尔，大于约600纳摩尔，大于约700纳摩尔，大于约800纳摩尔，大于约900纳摩尔，大于约1微摩尔等等。
在本发明方法的另一实施方案中，给对象按时施用还原叶酸(如每天)，使对象的还原叶酸稳态血浆水平升高至大于对象可能被认为叶酸缺乏的值。例如，对人类对象而言，可给人类对象按时施用还原叶酸(如每天)，使人类对象的还原叶酸稳态血浆水平值大于20纳摩尔，如大于约30纳摩尔，大于约40纳摩尔，大于约50纳摩尔，大于约60纳摩尔，大于约70纳摩尔，大于约80纳摩尔，大于约90纳摩尔，大于约100纳摩尔，大于约120纳摩尔，大于约140纳摩尔，大于约160纳摩尔，大于约180纳摩尔，大于约200纳摩尔等等。通过使对象的还原叶酸稳态血浆水平升高到高于本领域被认为缺乏的水平，本发明的方法可用于保护对象免受不能预期的紫外线辐射暴露。
如前所述，本发明的方法涉及给对象施用至少一种还原叶酸。合适的还原叶酸包括在保护对象免受电离辐射部分中所有上述讨论的，以及两种或多种还原叶酸混合物；聚谷氨酰衍生物；以及还原叶酸谷氨酸侧链的单烷基、双烷基、单苯甲基和/或双苯甲基酯。还原叶酸可为游离酸的形式或盐的形式，在此所用“还原叶酸”也包含游离酸和盐的形式。合适的盐形式的例子包括盐酸盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。还原叶酸的盐形式和晶体结构有些影响了还原叶酸的稳定性和溶解性，这可根据特定剂型的需要而优化。合适的盐形式也包括其中相反离子为有机铵碱的盐。最终组合物的pH也可根据使用的特定还原叶酸和制剂中的其他组分(如果有)的稳定性而优化，这是营养加工和叶酸化合物领域所公知的。
如前所述，用于保护对象免受紫外线辐射有害影响的本方法使用基本上不含维生素B12的组合物进行。在此所用的“基本上不含维生素B12”是指维生素B12在组合物中的存在水平不足以对组合物发挥的防御紫外线辐射有害影响的产生明显的作用。举例说明，在本文保护对象免受紫外线辐射有害影响的组合物中，组合物不含维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的300％的维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的250％的维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的200％的维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的150％的维生素B12；含有含量等于或小于对象的维生素B12推荐每日允许量的维生素B12；含有浓度小于0.1mg/ml的维生素B12；含有浓度小于0.08mg/ml的维生素B12；含有浓度小于0.05mg/ml的维生素B12；含有含量小于20μg(干重)的维生素B12；含有含量小于15μg(干重)的维生素B12；含有含量小于10μg(干重)的维生素B12；和/或含有含量小于8μg(干重)的维生素B12；和/或含有含量小于6μg(干重)的维生素B12，上述组合物都被视为“基本上不含维生素B12”。如上所述，在此所用的“推荐每日允许量”是指美国的推荐每日允许剂量，维生素B12为6μg/天。
还原叶酸可单独给药，或以除还原叶酸以外还含有一种或多种其它组分的组合物给药。合适的剂型的例子包括肠内(如口服、胃内、或经幽门给药)、肠外(肌肉、静脉、腹腔、直肠、阴道、及皮下)、外用与眼用剂型。
举例说明，还原叶酸可以用补充剂的形式口服给药。如丸剂、片剂、咀嚼片、胶囊、粉剂、糖浆、悬浮液、溶液剂、和软嚼剂均是施用防御紫外线辐射的还原叶酸的适当形式。也可使用长效、缓释和肠溶制剂。口服给药补充剂的合适的剂型包括片剂、分散粉末、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、糖浆和酏剂。片剂的惰性稀释剂和载体包括，例如，碳酸钙、碳酸钠、乳糖和滑石。片剂也可含有粒化剂和崩解剂，如淀粉和褐藻酸；粘合剂，如淀粉，明胶，和阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁，硬脂酸和滑石。片剂可以不包衣或通过已知技术包衣以便延迟崩解和吸收。可用于胶囊的惰性稀释剂和载体包括，例如，碳酸钙、磷酸钙和高岭土。悬浮液、糖浆和酏剂可含有常规赋形剂，如甲基纤维素、西黄蓍胶、藻酸钠；润湿剂，如卵磷脂和聚氧乙烯硬脂酸酯；和防腐剂，如对-羟基苯甲酸乙酯。口服给药的型剂中也可含有其他惰性成分。
如前所述，口服给药剂型可含有惰性材料，如填充剂、粘合剂、稳定剂、甜味剂，包括营养性甜味剂(如蔗糖、山梨醇和其他多元醇)和非营养性甜味剂(如糖精、阿斯巴甜、安赛蜜K)、着色剂、调味剂、缓冲剂、盐、包衣剂等等补充剂和药用制剂领域技术人员所公知的。另外或是或者，口服剂型也可含有一种或多种其它(即，除还原叶酸之外)生物活性物质。可存在于组合物中的所述其它生物活性物质的实例包括：其它维生素和/或营养剂(如叶酸；维生素B1；维生素B2；维生素B3；维生素B5；维生素B6；维生素C；维生素A和其前体，如β-胡萝卜素；维生素D；维生素E包括维生素E异构体和衍生物；维生素K；生物素；泛酸；蛋氨酸；胆碱；牛磺酸；肉毒碱；乙酰肉毒碱；糖；脂质；氨基酸，如谷氨酰胺、精氨酸和蛋氨酸；和蛋白质)，还原剂和抗氧化剂、硫醇(如谷胱甘肽和谷胱甘肽提升前体、谷氨酰胺、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、α-硫辛酸、胱氨酸-甘氨酸、胱氨、S-烯丙基半胱氨酸亚砜、氨乙基异硫脲、巯乙基胍、2-巯丙酰甘氨酸)、硒盐、硒化酵母、硒代蛋氨酸、辅酶Q10、氨磷汀、N-叔-丁基羟胺和其他N-羟胺衍生物、褪黑激素、超氧化物歧化酶、其衍生物和模拟-金属络合物、螯合剂、植物化学物质、多酚、类固醇和类固醇衍生物(尤其是已知可用于增强免疫系统的防护响应的，例如，DHEA、5-雄烯二醇、雄烯二醇和雄烯三醇和其衍生物)、天然产物的提取物包括草药、中药、印度草药制剂、茶叶提取物、二硫酚硫酮、十字花科蔬菜、类黄酮、姜黄素、甲基黄嘌呤、银杏叶提取物和矿物质(如硼、钙、磷、铬、铜、锰、镁、镍、钠、钼、钾、铁、硒、硅、钒、和锌)。进一步说明，本发明紫外线防护方法中可使用的其它生物活性物质包括必需营养物质，如已经被汇编在大量公开发表的资料来源中的那些，包括Shils等编著的Modern Nutrition in Health and Disease，第八版，Philadelphia：Leaand Febiger(1994)，在此将其引入作为参考。
还原叶酸也可作为用一种或多种还原叶酸强化的食品口服。食品可以是单一成分食物，例如水果和水果汁(如橘子汁)，乳制品(如牛奶)，蔬菜(如菠菜)，其他这类单一成分食物。食品也可以是由两种或多种单组分食物制成的多组分制品。通常，食品含有不同浓度的内源性还原叶酸。根据所需加工的性质，强化通常最好在任何特定的破坏性步骤后进行，这是食品强化领域所公知的。由于食品中内源性还原叶酸含量可能不同，通过例如分析一批产品的样本定量确定食物或食物制品中还原叶酸的最终含量(摩尔量)是有利的。许多分析方法(如微生物生长依赖、基于叶酸结合蛋白的分析、HPLC和GC)可用于测量食物、食物制品和补充剂中的还原叶酸含量。
无论向人类对象口服施用的还原叶酸的形式是补充剂的形式、强化食品的形式、还是食物制品的形式，每剂所施用的还原叶酸总量可在约0.45微摩尔至约50毫摩尔的范围内(如果还原叶酸为异构体混合物，则以天然异构体组分计)，如从0.45微摩尔至50微摩尔，从约0.9微摩尔至约50微摩尔，从0.9微摩尔至50微摩尔，从约1.8微摩尔至约50微摩尔，从1.8微摩尔至50微摩尔，从约0.45微摩尔至约25微摩尔，从约0.9微摩尔至约25微摩尔，从约1.8微摩尔至约25微摩尔，从约0.45微摩尔至约10微摩尔，从约0.9微摩尔至约10微摩尔，从约1.8微摩尔至约10微摩尔，从约0.45微摩尔至约5微摩尔，从约0.9微摩尔至约5微摩尔，从约1.8微摩尔至约5微摩尔，从约0.45微摩尔至约2微摩尔，从约0.9微摩尔至约2微摩尔，和/或从约1.8微摩尔至约2微摩尔。
如前所述，口服给药可用单剂量、多剂量或持续进行。当然，单剂量中还原叶酸的量将部分取决于剂量给药方案和在一定时间内给对象使用的还原叶酸总量(如每天)。防御慢性暴露于紫外线辐射的合适的日剂量为：从约0.45微摩尔至约15微摩尔，从约0.9微摩尔至约15微摩尔，从0.9微摩尔至15微摩尔，从约1微摩尔至约15微摩尔，从约2微摩尔至约12微摩尔，从约3微摩尔至约10微摩尔，从约5微摩尔至约8微摩尔等等。
适于肠胃外给药的剂型包括溶液剂、悬浮液、分散剂、乳剂等等。也可以制成无菌固体组合物，其可在使用前即刻溶解或分散于无菌注射用介质中。其可含有本领域公知的悬浮剂和分散剂。肠胃外给药的例子为肌肉、静脉内、直肠和皮下给药。
如前所述，还原叶酸可以通过口服和胃肠外途径之外的途径施用。例如，还原叶酸可以适于眼部给药的滴剂、膏剂、或凝胶溶液或悬浮的形式对眼睛给药。还原叶酸也可局部给药，例如常用的外用乳膏、洗剂、喷雾或凝胶基质。如本技术领域众所周知的，外用制剂可得益于加入促进皮肤渗透的给药体系(如脂质体等)。还原叶酸的外用制剂也可含有一种或多种本领域公知的遮阳剂或防晒剂。例如，外用剂型可制成每平方米覆盖面积含有约0.05微摩尔至约1毫摩尔，例如0.05微摩尔至1毫摩尔，约0.1微摩尔至约0.5毫摩尔，从约0.5微摩尔至约0.1毫摩尔(如果还原叶酸为异构体混合物，则以天然异构体组分计)。优选外用制剂预先施用至对象预期要暴露的皮肤区域。加用可用于维持还原叶酸的长时间存在，或者加用可用于明显暴露于水的事件。
有关以上描述的组合物配制的进一步详述，如用于外用、胃肠或胃肠外给药的组合物可参见例如，Handbook of PharmaceuticalExcipients，第三版(2000)，American Pharmaceutical Association；TheTheory and Practice of Industrial Pharmacy，第三版，Lachman等人1986；Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets Volume Edition，ChristopherT(编著)，1995；and Remington′s Pharmaceutical Sciences，2000，在此将其引入作为参考。
可以理解的是，实际上优选的本发明还原叶酸给药量根据特定的还原叶酸、特定配制的组合物和给药的方式而变化。本领域技术人员可考虑可能会改变还原叶酸效用的许多因素(如体重、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、对象情况、联合用药、反应的敏感性和严重性、对象所暴露的电离辐射的类型、强度和时间)。在最大耐受剂量范围内，给药可以持续或定期进行。本领域技术人员可用常规的给药剂量试验确定给定条件下的最佳给药速度。
本发由以下非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1-还原叶酸对X-射线破坏荧光素的影响
在不同浓度5-甲基四氢叶酸或5-甲酰基-四氢叶酸存在下，检测对X-射线引起的荧光素(以纳摩尔浓度存在于pH7.0的10mM磷酸缓冲剂中)衰减的预防作用。装满反应混合物的塑料管(1.5ml)浸没在水槽中，与水槽面的距离固定，使其受X-射线辐射8分钟，照射总量为25Gy。用Perkin Elmer LS 50B荧光计测量荧光素的残余荧光。浓度为约20微摩尔至30微摩尔的上述叶酸对由荧光素破坏引起的荧光损失提供了50％的保护。
实施例2-还原叶酸对X-射线破坏DNA的影响
超螺旋质粒DNA，PBR322稀释在带有不同浓度的5-甲基四氢叶酸或5-甲酰基-四氢叶酸的10mM pH 7.0的磷酸缓冲液中。装满反应混合物的塑料管(1.5ml)浸没在水槽中，与水槽面的距离固定，使其受X-射线辐射1.6分钟，照射总量为5Gy。通过琼脂糖凝胶电泳、溴乙啶染色和Fuji FLA 5000荧光图象仪定量扫描，从松环型和线型DNA中分离出残余的超螺旋DNA。浓度为约30微摩尔至40微摩尔的上述叶酸对超螺旋DNA的损失(即由链断裂引起)提供了50％的保护。
实施例3-5-甲基四氢叶酸抑制DNA中的光敏反应和链断裂
在该研究中，我们监测了在存在或不存在光敏剂的条件下暴露于UVA、UVB或可见光的5-甲基四氢叶酸(“5-MTHT”)，检测了其对质粒DNA光裂解的影响。发现5-MTHT单独被照射时稳定，而当激发态光敏剂猝灭、单态氧被清除时，5-MTHT在光敏作用中被耗尽。即使浓度低于10μM，5-MTHT也可在光激发的蝶呤-6羧酸(“PCA”)存在下，防止叶酸的光降解和质粒DNA的链断裂。
在该研究中，我们也重新检测了叶酸的光化学性质。叶酸的蝶啶光产物最初被认为是6-甲酰基蝶呤(6-FP)。近来更多的研究也证明了其它的对-氨基苯甲酰谷氨酸，并表明6-FP将进一步降解生成PCA。通过HPLC监测光解反应，我们证实了叶酸用UVA照射首先生成了对-氨基苯甲酰谷氨酸和6-FP，其又进一步氧化为PCA。用UVB照射也发现有相似的结果。
在相同条件下测定5-甲基四氢叶酸的情况。我们发现用UVA或UVB照射，5-MTHT的降解仅与没有光时的程度相同；如1小时内自动氧化＜5％。在5-MTHT存在条件下监测叶酸的光衰变作用时，5-MTHF以牺牲的方式抑制了叶酸的光解作用。如图1所示，叶酸可保持至5-MTHF衰变得浓度低于1μM。
使用玫瑰红研究特征性光敏作用中5-MTHF的反应。由于照射过的玫瑰红除了生成单态氧还可生成超氧化物自由基(Lee等人，Photochem.Photobiol.，45：79-86(1987)，在此将其引入作为参考)，反应混合物中含有超氧化物岐化酶。如图2A所示，发现在可见光敏化的玫瑰红存在条件下，5-MTHF被耗尽，得到与自动氧化作用生成的相同产物。为了区分5-MTHF与激活态玫瑰红的反应相对于单态氧的条件，在不同氧浓度下进行了试验。如图2A进一步所示，当氧浓度升高时，5-MTHF耗尽的速度减慢。然而，在反应中剧烈喷射氩气，将耗尽速度减慢到低于用100％氧时得到的程度。
为了确定耗尽是否至少部分是通过单态氧介导的，在用100％O2的相同实验条件下(但存在逐渐升高浓度的叠氮化合物)测定了5-MTHF的损失。如图2B所示，用5mM的叠氮化物使5-MTHF耗尽的初始速度降低了约80％，表明与单态氧有关。如图2B进一步所示，浓度0.5mM的叠氮化物使5-MTHF耗尽的速度降低约50％。在存在有效的单态氧产生剂50μM PCA的条件下(Thomas等人，Photochem.Photobiol.Sci.，2：245-250(2003)，将其引入作为参考)，最初浓度为25M的5-MTHF被UVA照射15分钟后完全耗尽。
如图2C所示，发现高氧水平下玫瑰红引起的光敏反应中5-MTHF的损失速度在mM水平抗坏血酸钠存在条件下减慢。5-MTHF的损失速度随时间的增加与抗坏血酸盐的减少相平行。现有HPLC方法的检测限不能测量5-MTHF损失的初始速度。在10μM PCA存在下，于UVA照射条件下，1mM抗坏血酸盐可在整个反应中基本维持25μM5-MTHF。
虽然DNA不是UVA辐射的发色团，但是它可被光敏剂引起的氧化反应损伤(Fiel等人，Cancer Res.，41：3543-3545(1981)和Blazek等人，Photochem.Photobiol.，49：607-613(1989)，在此引入作为参考)。如图3(图上部)所示，在50μM叶酸或50μM PCA存在条件下，超螺旋质粒-DNA暴露于UVA 80分钟会产生高百分率的链断裂。正如之前的报道，UV照射本身对超螺旋质粒没有损伤作用(同样如图3上部所示)(Hirakawa等人，Arch.Biochem.Biophys.，410：261-268(2003)，在此引入作为参考)。同样，50μM的叶酸或PCA当在黑暗中与质粒共孵化80分钟也没有作用。
如前所述，5-MTHF在参与光敏化反应时被耗尽。为了帮助维持其浓度，向反应混合物中以1.1μl/分钟泵入含有50μM叶酸或50μMPCA的0.25mM 5-MTHF，在UV照射期间的不同时间用HPLC分析其残余浓度。在两种情况下，5-MTHF尽管不断加入，但由最初的10μM降至反应最终的0.25μM，仍抑制了UVA介导的DNA损伤，(图3，图下部)。10mM叠氮化钠也在相同条件下提供完全的保护，证明该损伤主要是由单态氧介导的。
直接由UVA引起的天然叶酸光降解作用在不存在光敏剂的情况下不会出现。这可以解释为5-MTHF在330nm以上缺乏明显的吸收。有趣的是，UVB辐射也不会影响5-MTHF的稳定性，其与其在290nm处的吸收重叠。在5-MTHF与UVB的相互反应中，不可能生成单态氧；否则5-MTHF耗尽的速度比其在黑暗中的自氧化作用快。激发态5-MTHF可能经历了比其与分子氧相互作用更快的荧光引起的非辐射衰变和/或释放能量。
在高浓度O2中5-MTHF在玫瑰红反应中的损失减慢(如图2A所示)表明，除了激发态光敏剂的猝灭之外，5-MTHF还与单态氧反应，尽管速度较慢。这在图4中示出。在竞争性反应中，在高浓度O2中5-MTHF比叠氮化合物清除单态氧的作用强约20倍(图2B)。由于叠氮化合物在水中与单态氧反应的速率常数为4.8×108M-1sec-1(Miskoski等人，Photochem.Photobiol.，57：447-452(1993)，在此引入作为参考)，因此5-MTHF与单态氧的反应看来接近扩散限。5mM叠氮化合物不能完全抑制5-MTHF的耗尽，这可能是由于5-MTHF与光活化玫瑰红的残余反应。即使用100％氧(如～1.4mM)使反应饱和，可能也不足以驱使反应完全进入以单态氧途径(如图4描述)。
之前已有报道，DNA链断裂的产生与光敏化反应中单态氧的形成有关(Fiel等人Cancer Res.，41：3543-3545(1981)；Ravanat等人，J.Photochem.Photobiol.B，63：88-102(2001)；Ito等人，Biol.Chem.，378：1307-1312(1997)；Ravanat等人，J.Biol.Chem.，276：40601-40604(2001)；和Devasagayam等人，Biochemistry，30：6283-6289(1991)，在此引入作为参考)。单态氧由PCA和6-FP生成，并推测参与了叶酸的光衰变(Thomas等人，Photochem.Photobiol.Sci.，2：245-250(2003)，在此引入作为参考)。这可用于解释观察到的叶酸光衰变的加快。在本研究中，我们证实了PCA作为光敏剂并催化了UVA照射过程中DNA链断裂的形成，正如Hirakawa等，Arch.Biochem.Biophys.，410：261-268(2003)的报道，在此将其引入作为参考。与Hirakawa提出的电子传递机制(I型)相比，叠氮化合物抑制PCA介导的光敏反应中DNA损伤的发现提示，单态氧也可能与叶酸和其光产物的损伤作用有关。
许多内源性的光敏剂可能会导致光损伤(Fiel等，Cancer Res.，41：3543-3545(1981)；Fiel等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，107：1067-1074(1982)；和Mahns等，Free Radical Res.，37：391-397(2003)，在此将其引入作为参考)。在食入大于200μg叶酸的个体血浆中检测到未代谢的叶酸(Kelly等，Am.J.Clin.Nutr.，65：1790-1795(1997)，在此将其引入作为参考)。由于目前还不知道皮肤中未代谢的叶酸的组织水平，叶酸在光敏反应中所起的作用还有待确定。
如图2C所示，发现生理浓度的抗坏血酸盐减慢了光敏作用介导的5-MTHF耗尽。由于单态氧与抗坏血酸盐在水中反应的二级速率常数为8.3×106M-1sec-1(Chou等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，115：932-937(1983)，在此将其引入作为参考)，2mM抗坏血酸的假一阶速率为1.7×104sec-1。这比单态氧的自发衰变速度慢超过10倍(Studer等，J.Am.Chem.Soc.，111：7643-7644(1989)，在此将其引入作为参考)。此外，之前已有报道抗坏血酸盐对能存活的负载玫瑰红的THP-1细胞中蛋白质衍生的过氧化物的生成没有影响(Wright等，Free.Radic.Biol.Med.，34：637-647(2003)，在此将其引入作为参考)。因此，该浓度的抗坏血酸盐不能通过直接消除单态氧或直接猝灭玫瑰红对5-MTHF产生显著的保护。抗坏血酸盐可通过减少5-MTHF光降解反应中最初的中间体(最可能是自由基阳离子)而使其恢复。由于在第一次HPLC分析时，有很大一部分抗坏血酸盐迅速转化为脱氢抗坏血酸盐，图2C显示的结果低估了抗坏血酸最初维持5-MTHF的能力。
Branda和Eaton报道的研究中(Branda等，Science，201：625-626(1978)，在此引入作为参考)检测了UV照射和光疗法对用甲氧沙林治疗的银屑病患者血浆中叶酸浓度的影响，并证明了UV对叶酸有显著的光解作用。基于该研究和流行病学数据，提出了神经管缺损和UV照射之间可能存在因果关系(Van Rootselaar，Med.Hypotheses，41：78-82(1993)和Jablonski，Med.Hypotheses，52：581-582(1999)，在此将其引入作为参考)。然而，还不能清楚的确定体内叶酸光解作用和临床叶酸缺乏之间的联系。我们的结果提示在他们研究中所观察到的叶酸光解可能是由血浆中的光敏剂介导的，而不是由5-MTHF固有的光不稳定性介导。根据皮肤和/或血浆中的光敏剂和可能的抗坏血酸盐情况，长时间暴露于阳光可能影响叶酸库。对5-MTHF衰变产物性质的初步研究表明其依然含有对-氨基苯甲酰谷氨酸侧链。由于对人尿样叶酸代谢物的早期研究仅仅寻求对-氨基苯甲酰谷氨酸及其N-乙酰化形式的存在，而没有检测5-MTHF经氧化或光解衰变的减少。
总之，本结果表明，与叶酸不同，5-MTHF不是直接通过UV光解，也不会引起质粒DNA的裂解。5-MTHF可能在敏化反应中对DNA提供保护，很有可能是通过猝灭激发态光敏剂和清除单态氧(如图4的总结)。我们的结果提示μM浓度的天然叶酸、5-MTHF可在光敏作用发生时保护生物分子。此外，抗坏血酸可通过维持叶酸库抵抗光降解提供协同作用。
有关实施例3的试验操作的其它细节将在以下的实施例4中描述。
实施例4-表明5-甲基四氢叶酸抑制DNA光敏作用反应和链断裂的有关研究的试验细节
采用以下实验材料和方法。叠氮化钠(＞99％)购自Fluka。叶酸(98％+8％H2O)、抗坏血酸钠和超氧化物岐化酶(“SOD”)购自Sigma，(St.Louis，Missouri)。5-甲基-6S-四氢叶酸钙盐得自Eprova(瑞士)。超螺旋质粒DNA，PBR322(4361碱基对，分子量2.83×106道尔顿)得自Fermentas。蝶呤-6-羧酸和6-甲酰基-蝶呤购自Schirck′s Laboratories(Jona，瑞士)。玫瑰红(95％钠盐)购自Aldrich，载BLUEJUICETM凝胶缓冲剂和SYBR Safe DNA凝胶染剂购自Invitrogen。
在以下条件下进行UVA和UVB照射。样品距15W UVA灯，Sylvania 350BL(λmax＝365nm，820W/cm2)或15W UVB灯，UVP(λmax＝302nm，820W/cm2)(均购自UVP，Inc.，USA)30cm暴露于UV光。灯安装置于XX暴露台在UVPXX-15型灯固定器上。
为了使溶液深度约为3mm，空24-孔板中使用0.5ml反应体积。为了防止在UVA照射期间的蒸发，样品用MICROAMPTM光学胶粘膜(ABI)覆盖，使330nm以上的投射率大于80％。UVB反应用石英窗覆盖。所有的反应进行的条件为周围温度、在10mM pH7.41的磷酸钾(测于10mM和21℃)中、与空气平衡、存在100μM二乙三胺五乙酸以避免外来的氧化还原活性金属离子的作用、先进行Fenton反应并避免羟基自由基引起的损伤。
按以下方法检测DNA链断裂。由于单链断裂，超螺旋质粒DNA转化为缺口环状(松环)，随后由于双链断裂转化为线型。用琼脂糖凝胶电泳可以分离这三种类型。超螺旋DNA移动比线型远，而线型的移动则比大于松环型远。
0.1μg质粒DNA，PBR322和叶酸，5-MTHF或PCA的混合物于10mM pH7.4的磷酸钾中在上述UVA辐射条件下孵育80分钟，总照射量为4J/cm2。为了部分维持5-MTHF的浓度，在磁力搅拌下用Harvard注射泵以1.1μl/分钟的速度向反应混合物中连续加入0.25mM溶液。
然后10μl反应混合物的样品在加入2μl 10X载凝胶缓冲剂后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳用的琼脂糖凝胶通过将0.9％琼脂糖溶解于含有1mM EDTA的45mM三硼酸盐缓冲剂(pH8.3)制备。电泳在4V/cm下运行1小时。凝胶用1μg/ml SYBR Safe染剂孵育，DNA带用Fuji FLA-5000磷光体图象系统扫描。
与光激发的蝶呤-6-羧酸或叶酸的反应按以下方法进行。样品在24-孔板中在0.5ml的反应体积中用UVA光照射，所述反应体积在10mMpH7.42的磷酸钾缓冲剂中，含有5-MTHF和叶酸或PCA，含有或不含有抗坏血酸钠。反应在周围温度下、前述条件的大气氧气下进行。样品由注射器提取，并直接注入HPLC。
与玫瑰红的光化学反应按以下方式进行。置于隔膜塞住的玻璃试管中的样品用40W钨灯通过Wratten#16凝胶过滤器的光照射，距离为12cm。反应用空气平衡，或用100％或1.8％氩气中的O2喷射，或完全用100％氩气，照射在周围温度下进行。样品由注射器穿过隔膜提取，并直接注入HPLC。
用HPLC分析的5-MTHF光降解按以下步骤进行。样品提取自不同的曝光时间，用HPLC分析，分析条件为在Luna苯基-己基5μm(25×0.46cm)柱(Phenomenex)中，以磷酸铵(以铵计20mM)，Ph2.8/乙腈(17∶1)在流速1.5ml/分钟的条件下洗脱，用Waters 996，光电二极管阵列分光计进行紫外吸收检测。
实施例5-用于防御慢性暴露于电离辐射的含有还原叶酸的典型日用复合维生素片制剂
用于防御慢性暴露于电离辐射的含有还原叶酸的典型日用复合维生素片制剂可含有：碳酸钙、5-MTHF钙盐0.4至7mg(如4mg)、抗坏血酸12至300mg(如60mg)、明胶、维生素E醋酸酯5至150I.U.(如30I.U.)、淀粉、烟酰胺4至100mg(如20mg)、羟丙甲基纤维素、泛酸钙2至50mg(如10mg)、硅酸钙羟丙基纤维素、吡哆醇盐酸盐0.4至10mg(如2mg)、核黄素0.35至8.5mg(如1.7mg)、单硝酸硫铵0.3至7.5mg(如1.5mg)、β胡萝卜素&维生素A醋酸酯1000至25000I.U.(如5000I.U.)、六偏磷酸钠、硬脂酸镁、维生素D 80至2000I.U.(如400I.U.)、维生素B121至30μg(如6g)和卵磷脂。
实施例6-用于防御慢性暴露于紫外线辐射的含有还原叶酸的典型日用复合维生素片制剂
用于防御慢性暴露于紫外线辐射的含有还原叶酸的典型日用复合维生素片制剂可含有：碳酸钙、5-MTHF钙盐0.4至7mg(如4mg)、抗坏血酸12至300mg(如60mg)、明胶、维生素E醋酸酯5至150I.U.(如30I.U.)、淀粉、烟酰胺4至100mg(如20mg)、羟丙甲基纤维素、泛酸钙2至50mg(如10mg)、硅酸钙羟丙基纤维素、吡哆醇盐酸盐0.4至10mg(如2mg)、核黄素0.35至8.5mg(如1.7mg)、单硝酸硫铵0.3至7.5mg(如1.5mg)、β胡萝卜素&维生素A醋酸酯1000至25000I.U.(如5000I.U.)、六偏磷酸钠、硬脂酸镁、维生素D 80至2000I.U.(如400I.U.)、维生素B121至19μg(如6g)和卵磷脂。
尽管为了说明的目的而详细描述了本发明，可以理解的是所述细节仅为了该目的；本领域技术人员可以在不背离本发明内涵和范围的条件下进行变化，本发明的内涵和范围受所负权利要求的限定。