一种用于测定GLP-1及其功能类似物生物活性的细胞株及其应用技术领域
本发明涉及一种表达胰高血糖素样肽-1受体蛋白的基因工程细胞株的建立，以及基于此细胞株受到胰高血糖素样肽-1及其功能类似物刺激后cAMP水平的变化来测定胰高血糖素样肽-1及其功能类似物生物活性的检测方法，属于药物生物活性检测技术领域。
背景技术
胰高血糖素样肽-1（Glucogan like Peptide-1, GLP-1）作用于胰岛β细胞胰高血糖素样肽-1受体（Glucogan like Peptide-1 Receptor，GLP-1R），促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。研究证明，GLP-1可通过多种机制明显地改善2型糖尿病动物模型或患者的血糖情况，这为2型糖尿病的治疗提供了一个非常好的前景。
促胰岛素分泌肽（Exendin-4）是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥（Gila monster）唾液发现的一种多肽物质，氨基酸序列的53%与人类血液中调控血糖的GLP-1同源。Exendin-4同样是GLP-1R激动剂，与GLP-1功能相似，具有促进胰腺分泌胰岛素，促进机体对血糖的利用、减少肝糖原分解、通过减缓胃肠道的蠕动使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液内出现的高峰，达到降低血糖作用。此外，它还有通过作用于中枢神经系统控制食欲等多种生理功能。由于Exendin-4不被二肽基肽酶－IV降解，其稳定性明显高于GLP-1。由美国Lilly公司和Amylin公司研制的Exendin-4(Byetta? )，2005年获得了美国FDA批准用于治疗2型糖尿病全新类型的药物。在生理条件下，Byetta?和GLP-1作用相似，它刺激胰岛素分泌的作用受血糖浓度的调节，血糖浓度降低时其刺激作用减轻或消失，因而不会出现胰岛素持续分泌而发生低血糖的现象，并有明显减少2型糖尿病肥胖患者体重的作用。然而，Exendin-4在人体内的半衰期为数小时，患者还是需要每天注射Byetta?两次，使用上仍然相当不方便。目前正在研究具有长效治疗效果的GLP-1、Exendin-4药物。治疗糖尿病的长效蛋白质药物在保持降糖活性的同时可以延长药物在体内的半衰期，不仅可以减少注射频率，方便患者使用，同时还可达到降低治疗费用之目的。
建立有效的GLP-1及其功能类似物生物活性的测定方法，是评价新药药效的关键措施之一。目前，国内GLP-1及其功能类似物活性检测依然依赖于传统的动物测定方法。其检测方法存在实验动物不易获得，操作复杂，数据重复性差，检测方法难于标准化等缺点。本发明采用基因工程技术，构建了一个能稳定表达GLP-1R的基因工程人胚肾HEK293细胞株（GLP-1R/HEK293），建立了基于检测GLP-1R/HEK293细胞株在受到外来刺激后细胞中环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP）含量的变化来测定外来刺激中GLP-1、Exendin-4及其功能类似物生物活性的检测方法，检测方法易标准化，重复性好，具有成本低、方便、准确的特点，因而具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于在体外测定GLP-1及其功能类似物生物活性的基因工程细胞株GLP-1R/HEK293。GLP-1R/HEK293细胞株的工作原理是：GLP-1R/HEK293细胞株能在细胞膜上稳定表达GLP-1R蛋白，该受体蛋白受到GLP-1及其功能类似物的作用时，GLP-1R/HEK293细胞内的cAMP含量会迅速升高，cAMP升高的水平与刺激物中GLP-1及其类似物的生物活性呈正相关。通过与GLP-1标准品生物活性的比较，测定未知样品中的GLP-1及其类似物的生物活性。
为构建能稳定表达GLP-1R的HEK293细胞株，本发明是通过以下技术方案来实现。
本发明的技术方案：一株GLP-1R/HEK293细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5909，用胰高血糖素样肽-1受体，简写为GLP-1R，转染人胚肾HEK293细胞，获得的一株GLP-1R/HEK293细胞株。
所述GLP-1R/HEK293细胞株的应用，转染了GLP-1R基因条件下，在受体激动剂刺激下能诱导GLP-1R/HEK 293细胞胞内第二信使cAMP含量增加，转染的GLP-1R基因能够稳定表达；
所述受体激动剂为GLP-1及其类似物，cAMP含量增加与受体激动剂的活性呈正相关，测定GLP-1R/HEK293细胞内的cAMP含量，即为测定受体激动剂的生物活性。
所述GLP-1R/HEK293细胞株的应用，GLP-1及其类似物为GLP-1、GLP-1耦联物及其融合蛋白；Exendin-4、Exendin-4耦联物及其融合蛋白。
本发明提供了一种采用PCR方法制备了编码人GLP-1R的基因片段方法。具体地，根据编码人GLP-1R基因开放阅读框的DNA序列SEQ ID NO:1，设计一对基因特异性引物：引物GLP-1R1，其核苷酸序列与SEQ ID NO:3为100%的同源，其5’端带有Hind III的限制性内切酶位点；引物GLP-1R2与SEQ ID NO:4有100%的同源性，其5’端带有Xho I的限制性内切酶位点。使用引物GLP-1R1、GLP-1R2，经PCR方法从质粒pReceiver-M02 DNA中扩增出编码GLP-1R蛋白的DNA片段，该片段的核苷酸序列与SEQ ID NO:1有100%的同源性，其编码的GLP-1R蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2 有100%的同源性。本发明还将PCR扩增到的编码人GLP-1R蛋白的DNA片段亚克隆到TA克隆载体pGEM-T 载体中进行DNA序列分析，以证实PCR扩增产物DNA序列的准确性。
本发明提供一种构建在真核细胞中表达人GLP-1R蛋白的重组表达质粒的构建方法。所述的重组表达质粒构建所使用的真核表达质粒是pcDNA3.1（+）(购于Invitrogen公司)，其特点是在真核细胞中能自我复制，并表达G418抗性。但是，亦可以是其它种类的真核表达质粒GLP-1R，不仅局限于质粒pcDNA3.1（+）。所述的用于表达人GLP-1R蛋白的基因与SEQ ID NO:1 有100%的同源性。所述的质粒pcDNA3.1（+）与SEQ ID NO:5有100%的同源性。具体构建方法如下：采用限制性内切酶Hind III和Xho I（购自上海生工）对含有GLP-1R基因的重组质粒GLP-1R/pGEM-T和真核表达质粒pcDNA3.1进行限制性酶切，分别制备5’端带有Hind III，3’端带有Xho I酶切位点的GLP-1R基因片段与线性化的pcDNA3.1（+）。采用胶回收方法制备纯化的GLP-1R基因片段与线性化的pcDNA3.1（+）的酶切产物。将酶切纯化的GLP-1R片段DNA与酶切纯化的质粒pcDNA3.1（+）DNA按3:1混合，在T4 DNA连结酶的作用下进行连结，构建重组表达质粒GLP-1R/pcDNA3.1(+)，其核苷酸序列应与SEQ ID NO:6 有100%的同源性。采用PCR扩增方法鉴定转化子细菌中是否含有含GLP-1R基因片段的重组表达质粒GLP-1R/pcDNA3.1(+)。采用限制性内切酶Hind III和Xho I对重组表达质粒GLP-1R/pcDNA3.1(+)进行双酶切分析，并将重组质粒送Invitrogen公司进行DNA序列分析，以证明重组表达质粒中GLP-1R基因的方向与序列的正确性。
本发明提供一种表达GLP-1R蛋白的真核细胞株构建方法。
具体地，将人胚肾HEK293细胞（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所购得）在转染前一天铺6孔板，待细胞生长至80%的融合度时，将线性化的GLP-1R/pcDNA3.1(+)重组质粒与Fugene 6转染试剂（购于Roche公司）混合，然后加入到HEK293培养孔中进行基因转染，用含G418的培养基筛选，筛选能在含高浓度G418培养基中生长的重组细胞株。
本发明还提供一种鉴定GLP-1R是否表达在HEK293细胞表面的方法。具体地，采用FITC标记的兔抗GLP-1R抗体对转染的HEK293细胞进行染色，同时以FITC标记的兔IgG抗体作为同型对照。采用流式细胞分析方法检测转染的细胞表面是否有GLP-1R蛋白存在。
本发明提供一种半量RT-PCR检测重组工程细胞株GLP-1R/HEK293中GLP-1R基因表达稳定性的方法。具体地，收集不同传代时间的GLP-1R/HEK293细胞，抽提RNA，采用RT-PCR测定该细胞中GLP-1R的表达时产生的mRNA含量。同时以管家基因GAPDH为内参对照，序列为SEQ ID NO:7。观察不同传代时间GLP-1R/HEK293细胞中GLP-1R表达水平是否发生变化。结果显示GLP-1R蛋白可以稳定地表达在重组基因工程细胞GLP-1R/HEK293表面。
本发明提供一种GLP-1R/HEK293细胞GLP-1R活性的测定方法。
具体地，使用GLP-1及其功能类似物刺激正在生长中的GLP-1R/HEK293细胞，采用Promega公司的生物发光检测试剂盒，测定受到激动剂刺激的GLP-1R/HEK293细胞中环磷酸腺苷（cAMP)水平的变化来观察GLP-1R/ HEK293细胞膜上表达的GLP-1R是否具有生物活性功能。如果GLP-1R/ HEK293细胞膜上表达的GLP-1R具有生物活性，其受到GLP-1等激动剂的刺激后，HEK293细胞的生理代谢活性增强，消耗的能量增加。细胞内的三磷酸腺嘌呤(ATP)转化为cAMP，亦就是说GLP-1R激活后，细胞内的cAMP水平会明显升高，而不表达GLP-1R的HEK293受到GLP-1等激动剂的刺激后，细胞内的cAMP水平不发生明显的改变。
本发明还提供一种基于基因工程细胞株GLP-1R/HEK293的cAMP水平变化测定GLP-1及其功能类似物生物活性的测定方法。具体地，称取不同活性单位的GLP-1标准物，分别用于刺激生长中的GLP-1R/HEK293细胞，测定各活性单位GLP-1刺激GLP-1R/HEK293细胞后产生的cAMP的数量。以GLP-1的活性为横坐标，以cAMP的数量为纵坐标，作标准曲线。同时，测定未知样品刺激GLP-1R/HEK293细胞产生的cAMP的数量，以此cAMP的数量查标准曲线，从而可确定未知样品中GLP-1及其功能类似物的生物活性。
本发明的有益效果：建立了基于检测GLP-1R/HEK293细胞株在受到外来刺激后细胞中cAMP含量的变化来测定外来刺激中GLP-1及其功能类似物生物活性的检测方法，检测方法易标准化，重复性好，具有成本低、方便、准确的特点，因而具有良好的应用前景。
生物材料样品保藏：一株GLP-1R/HEK293细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京 中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.5909，保藏日期2012年3月22日。
附图说明
图1重组真核表达载体GLP-1R/pcDNA3.1(+)的酶切鉴定结果。1、1kb DNA Marker；2、重组质粒GLP-1R/pcDNA3.1(+)；3 重组质粒GLP-1R/pcDNA3.1(+)/Hind III+Xho I酶切产物。
图2 流式细胞仪分析克隆细胞表面GLP-1R的表达情况结果。流式细胞仪分析6个克隆细胞表面GLP-1R的表达情况，图2显示的是2号克隆细胞表面有GLP-1R蛋白的表达。（a）阴性对照组为未转染细胞、2号克隆细胞中未加抗体所检测到的荧光强度；阴性抗体组为未转染细胞、2号克隆细胞中均未加GLP-1R抗体、加入了FITC标记的兔IgG抗体染色的转染细胞为抗体对照所检测到的荧光强度；（b）抗GLP-1R组为未转染细胞、2号克隆细胞中均加GLP-1R抗体所检测到的荧光强度；合并组为为未转染细胞、2号克隆细胞的上述三种所检测到的荧光强度放在一起观察。结果显示抗GLP-1R组的2号克隆细胞所检测到的荧光强度明显增加（其横坐标向右移），证明抗GLP-1R组的2号克隆细胞有GLP-1R蛋白的表达。
图3 RT-PCR半定量检测转染基因GLP-1R的稳定性结果。1、100bp Marker；2、10天样本；3、20天样本；4、40天样本；5、60天样本；6、阴性样本。
图4 GLP-1R/HEK293细胞、HEK293细胞分别经GLP-1刺激后活性反应曲线结果。
图5 GLP-1R/HEK293细胞经GLP-1、Exendin-4刺激后活性反应曲线结果。
图6 GLP-1R/HEK293细胞经Exendin-4-HSA、HSA刺激后活性反应曲线结果。
具体实施方式
实施例1: 重组GLP-1R/pcDNA3.1(+)真核表达质粒的构建
1.1 GLP-1R基因的扩增与鉴定
根据编码人GLP-1R蛋白开放阅读框cDNA序列（SEQ ID NO:1）设计一对基因特异性引物：
GLP-1R1: 5′-AAAAGCTTATGGCCGGCGCCCCCGG-3′（SEQ ID NO:3）；
Hind III
GLP-1R2: 5′-TTCTCGAGTCAGCTGCAGGAGGCCTG-3’ （SEQ ID NO:4）
Xho I
引物GLP-1R1的5’端带有Hind III的限制性内切酶位点，GLP-1R2的5’端带有Xho I的限制性内切酶位点。以 GLP-1R编码基因（pReceiver-M02质粒DNA，江苏省血吸虫病防治研究所科研部提供)为模板，进行PCR扩增。具体条件如下：在0.2 mL的PCR管中，加入pReceiver-M02质粒DNA 1 μL；10×Taq Buffer，10μL；MgCl2(2.5mM) 10μL；dNTP Mixture(10Mm)，2μL；GLP-1R1 2μL , GLP-1R2 2μL；ddH2O，72.0μL。混匀后99℃加热变性10 min，将PCR管置于冰上冷却后，加入Taq DNA Polymerase，1.0μL（3U）。混匀，短暂离心。然后，把PCR管放到PCR仪孔中，根据下列反应条件进行扩增：94℃，30 sec；55℃，20 sec，72℃，90 sec，共30个循环；最后，72℃，5min。所产生的PCR反应产物使用琼脂糖电泳方法进行分析，在紫外灯下观察电泳情况。采用低融点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收分子量约1392bp的 GLP-1R基因的DNA条带。将GLP-1R基因的DNA片段与pGEM-T克隆载体连接，构建GLP-1R/pGEM-T重组质粒，连结产物转化DH5α感受态细菌，经含Ampicilin的LB平板筛选获得含GLP-1R/pGEM-T重组质粒的菌株。用质粒DNA纯化试剂盒（Promega公司）纯化获得重组GLP-1R 基因质粒DNA。
1.2 GLP-1R重组真核表达质粒的构建
本实验采用真核表达质粒pcDNA3.1(+)为表达载体，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒，将GLP-1R基因插入pcDNA3.1(+)构建成GLP-1R重组真核表达质粒。
先对表达载体质粒pcDNA3.1(+)，进行Hind III，Xho I双酶切。具体条件如下。表达载体质粒pcDNA3.1(+) 10μL；Hind III 1μL，Xho I 1μL，10×Tango 缓冲液 5μL，ddH2O 33μL，总体积为50μL。37℃恒温水浴锅内反应3小时，通过琼脂糖凝胶电泳回收线性化的Xho I质粒DNA。GLP-1R/pGEM-T质粒作同样的双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收分子量约1392 bp的GLP-1R基因片段。
将回收的GLP-1R DNA与上述双酶切的表达质粒pcDNA3.1(+) DNA连接构建重组表达质粒GLP-1R/pcDNA3.1(+)。连接体系一般为10μL，双酶切的pcDNA3.1(+)质粒载体与双酶切GLP-1R DNA的摩尔比为1︰2-10，10×T4 DNA ligase 缓冲液1μL，T4 DNA ligase 1μL，加无菌水至总体积为10μL。连接混合物在16℃恒温水浴锅内反应16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。阳性克隆的鉴定是通过含Ampicilin的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒。将重组质粒DNA用Hind III、Xho I内切酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，结果显示，重组质粒被切割成一条分子量约5.4Kb载体DNA条带和一条分子量约1392bp的GLP-1R基因条带，证明GLP-1R被正确地插入到表达质粒pcDNA3.1(+)中（图1）。
实施例2：表达GLP-1R蛋白基因工程细胞株的构建与鉴定
2. 1 重组GLP-1R/pcDNA3.1(+)质粒转染HEK293细胞
HEK293细胞在转染前一天接种于六孔板中(4×105细胞/孔)，每孔含100μL DMEM培养基(无抗生素)，培养18~24h至80%细胞密度。将线性化重组质粒2μg，与3μL FuGene 6混合后进行细胞转染。
待转染24h后，将转染细胞按1:10传代至新鲜的含300 μg/mL G418的培养液中(G418起始浓度由预实验确定)，放37℃、5%CO2孵箱中培养。每两天换一次液，培养48~72 h后可观察到大部份细胞死亡。将存活细胞转移到另外一个六孔板中，逐渐加大G418的浓度(最大浓度达1200μg/mL)继续进行筛选，获得表达GLP-1R蛋白基因单细胞克隆。
2.2 重组细胞株表面表达GLP-1R的鉴定
2.2.1 流式分析法验证重组细胞株表面GLP-1R蛋白的表达
用抗GLP-1R抗体检测HEK293细胞表面是否有GLP-1R表达。具体方法如下：取2×105个转染细胞，加入2μL FITC标记的兔抗GLP-1R蛋白抗体染色，同时以FITC标记的兔IgG抗体染色的转染细胞为抗体对照，以不加抗体的转染细胞为阴性对照。经过流式细胞仪检测，验证克隆细胞的表面有GLP-1R蛋白的表达（图2）。获得表达GLP-1R蛋白的单细胞克隆按常规细胞冻方法，存置于液氮中进行长期冻存。
2.2.2 重组GLP-1R/ HEK293细胞株GLP-1R表达的稳定性观察
采用半量RT-PCR方法，对培养不同时间的GLP-1R/HEK293细胞中GLP-1R表达的表达水平进行检测，同时以管家基因GAPDH为内标对照，观察GLP-1R/HEK293细胞中GLP-1R基因的表达稳定性。具体方法如下：培养 GLP-1R/HEK293细胞，每2天传代一次，分别在第10天、20天、40天和60天，按QIAGEN公司RNA抽提试剂盒说明书分别提取培养不同时间的重组细胞的总RNA。半定量RT-PCR检测GLP-1R的表达情况，结果表明，培养不同时间（10天-60天之间）的细胞中GLP-1R的表达水平基本保持稳定。（图3）。
实施例3: GLP-1R/HEK293细胞表达GLP-1受体活性分析
当重组基因工程GLP-1R/HEK293细胞表达的GLP-1受体蛋白具有生理活性时，在其受激动剂GLP-1或其功能类似物的刺激时，GLP-1R/HEK293细胞的生理代谢活动增强，表现为细胞内cAMP含量增加。因此，通过测定受到GLP-1等激动剂刺激后GLP-1R/HEK293细胞内cAMP含量的变化，即可判定GLP-1R/HEK293细胞表达的GLP-1R蛋白是否具有生理活性。具体方法如下：
GLP-1R/HEK293细胞按100μL/孔(30,000细胞/孔)培养与96孔培养板，用DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养24小时。第二天撤去完全培养基，加入基础培养基培养过夜（15小时左右）。移弃基础培养基，加入待测定样本GLP-1，37℃，5% CO2条件下培养1小时。用cAMP试剂检测盒（购于AB公司）测定上述GLP-1刺激GLP-1R/HEK293细胞后胞内的cAMP含量。结果表明，GLP-1R/HEK293细胞的cAMP含量显著增加，而未转染GLP-1R基因的HEK293细胞未有任何剂量效应趋势（图4）。以上实验结果证实重组GLP-1R/HEK293细胞表达的GLP-1R蛋白具有天然GLP-1R蛋白相似的生理活性，且具有特异性。
实施例4：胰高血糖素样肽-1及其功能类似物生物学活性测定方法
称取不同浓度的GLP-1及其功能类似物Exendin-4，用实施例3方法分别用于刺激生长中的GLP-1R/HEK293细胞，测定各样本刺激GLP-1R/HEK293细胞后产生的cAMP的数量。以样本浓度为横坐标，以cAMP的数量为纵坐标，作曲线。结果显示，经Exendin-4、GLP-1刺激后胞内的cAMP含量曲线呈典型的反 “S” 型（图5），不同浓度的GLP-1、Exendin-4刺激GLP-1R/HEK293细胞产生的cAMP含量存在剂量效应相关性，并通过标准曲线可以测定未知样品刺激GLP-1R/HEK293细胞产生的cAMP的数量，以此cAMP的数量查标准曲线，从而可确定未知样品中GLP-1及其功能类似物的生物活性。以上实验结果进一步表明重组GLP-1R/HEK293细胞用于测定GLP-1及其功能类似物的生物活性具有特异性，据此可以提供一种基于基因工程细胞株GLP-1R/HEK293的cAMP水平变化测定GLP-1及其功能类似物生物活性的测定方法。
实施例5：促胰岛素分泌肽-1及其功能类似物生物学活性测定方法
称取不同浓度的Exendin-4功能类似物长效Exendin-4-HSA融合蛋白和人血清白蛋白（HSA），用实施例3方法分别用于刺激生长中的GLP-1R/HEK293细胞，测定各样本刺激GLP-1R/HEK293细胞后产生的cAMP的数量。以样本浓度为横坐标，以cAMP的数量为纵坐标作曲线。结果显示，经不同浓度的Exendin-4-HSA融合蛋白刺激GLP-1R/HEK293细胞产生的cAMP含量存在剂量效应相关性，而人血清白蛋白未有任何剂量效应趋势（图6）。以上实验结果进一步表明重组GLP-1R/HEK293细胞用于测定GLP-1及其功能类似的生物活性具有特异性，据此可以提供一种基于基因工程细胞株GLP-1R/HEK293的cAMP水平变化测定GLP-1及其功能类似物生物活性的测定方法。
<160> 9
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> GLP-1R
<400> 1
atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg 60
gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg tccctctggg agacggtgca gaaatggcga 120
gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg actgaggatc cacctcctgc cacagacttg 180
ttctgcaacc ggaccttcga tgaatacgcc tgctggccag atggggagcc aggctcgttc 240
gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg 300
taccggttct gcacagctga aggcctctgg ctgcagaagg acaactccag cctgccctgg 360
agggacttgt cggagtgcga ggagtccaag cgaggggaga gaagctcccc ggaggagcag 420
ctcctgttcc tctacatcat ctacacggtg ggctacgcac tctccttctc tgctctggtt 480
atcgcctctg cgatcctcct cggcttcaga cacctgcact gcaccaggaa ctacatccac 540
ctgaacctgt ttgcatcctt catcctgcga gcattgtccg tcttcatcaa ggacgcagcc 600
ctgaagtgga tgtatagcac agccgcccag cagcaccagt gggatgggct cctctcctac 660
caggactctc tgagctgccg cctggtgttt ctgctcatgc agtactgtgt ggcggccaat 720
tactactggc tcttggtgga gggcgtgtac ctgtacacac tgctggcctt ctcggtctta 780
tctgagcaat ggatcttcag gctctacgtg agcataggct ggggtgttcc cctgctgttt 840
gttgtcccct ggggcattgt caagtacctc tatgaggacg agggctgctg gaccaggaac 900
tccaacatga actactggct cattatccgg ctgcccattc tctttgccat tggggtgaac 960
ttcctcatct ttgttcgggt catctgcatc gtggtatcca aactgaaggc caatctcatg 1020
tgcaagacag acatcaaatg cagacttgcc aagtccacgc tgacactcat ccccctgctg 1080
gggactcatg aggtcatctt tgcctttgtg atggacgagc acgcccgggg gaccctgcgc 1140
ttcatcaagc tgtttacaga gctctccttc acctccttcc aggggctgat ggtggccata 1200
ttatactgct ttgtcaacaa tgaggtccag ctggaatttc ggaagagctg ggagcgctgg 1260
cggcttgagc acttgcacat ccagagggac agcagcatga agcccctcaa gtgtcccacc 1320
agcagcctga gcagtggagc cacggcgggc agcagcatgt acacagccac ttgccaggcc 1380
tcctgcagct ga 1392
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 464
<212> 氨基酸
<213> GLP-1R
<400> 2
Met Ala Gly Ala Pro Gly Pro Leu Arg Leu Ala Leu Leu Leu Leu
5 10 15
Gly Met Val Gly Arg Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val
20 25 30
Ser Leu Trp Glu Thr Val Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln
35 40 45
Cys Gln Arg Ser Leu Thr Glu Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu
50 55 60
Phe Cys Asn Arg Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly
65 70 75
Glu Pro Gly Ser Phe Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro
80 85 90
Trp Ala Ser Ser Val Pro Gln Gly His Val Tyr Arg Phe Cys Thr
95 100 105
Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro Trp
110 115 120
Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu Ser Lys Arg Gly Glu Arg Ser
125 130 135
Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu Tyr Ile Ile Tyr Thr Val
140 145 150
Gly Tyr Ala Leu Ser Phe Ser Ala Leu Val Ile Ala Ser Ala Ile
155 160 165
Leu Leu Gly Phe Arg His Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr Ile His
170 175 180
Leu Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg Ala Leu Ser Val Phe
185 190 195
Ile Lys Asp Ala Ala Leu Lys Trp Met Tyr Ser Thr Ala Ala Gln
200 205 210
Gln His Gln Trp Asp Gly Leu Leu Ser Tyr Gln Asp Ser Leu Ser
215 220 225
Cys Arg Leu Val Phe Leu Leu Met Gln Tyr Cys Val Ala Ala Asn
230 235 240
Tyr Tyr Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Thr Leu Leu
245 250 255
Ala Phe Ser Val Leu Ser Glu Gln Trp Ile Phe Arg Leu Tyr Val
260 265 270
Ser Ile Gly Trp Gly Val Pro Leu Leu Phe Val Val Pro Trp Gly
275 280 285
Ile Val Lys Tyr Leu Tyr Glu Asp Glu Gly Cys Trp Thr Arg Asn
290 295 300
Ser Asn Met Asn Tyr Trp Leu Ile Ile Arg Leu Pro Ile Leu Phe
305 310 315
Ala Ile Gly Val Asn Phe Leu Ile Phe Val Arg Val Ile Cys Ile
320 325 330
Val Val Ser Lys Leu Lys Ala Asn Leu Met Cys Lys Thr Asp Ile
335 340 345
Lys Cys Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu
350 355 360
Gly Thr His Glu Val Ile Phe Ala Phe Val Met Asp Glu His Ala
365 370 375
Arg Gly Thr Leu Arg Phe Ile Lys Leu Phe Thr Glu Leu Ser Phe
380 385 390
Thr Ser Phe Gln Gly Leu Met Val Ala Ile Leu Tyr Cys Phe Val
395 400 405
Asn Asn Glu Val Gln Leu Glu Phe Arg Lys Ser Trp Glu Arg Trp
410 415 420
Arg Leu Glu His Leu His Ile Gln Arg Asp Ser Ser Met Lys Pro
425 430 435
Leu Lys Cys Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Gly Ala Thr Ala Gly
440 445 450
Ser Ser Met Tyr Thr Ala Thr Cys Gln Ala Ser Cys Ser ***
455 460 464
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 25
<212> DNA
<213> GLP-1R1
<400> 3
aaaagcttat ggccggcgcc cccgg
<210> SEQ ID NO: 4
<211> 26
<212> DNA
<213> GLP-1R2
<400> 4
ttctcgagtc agctgcagga ggcctg
<210> SEQ ID NO: 5
<211> 5428
<212> DNA
<213> PcDNA3.1（+）
<400> 5
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1020
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1080
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1140
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1200
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 1260
gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta 1320
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 1380
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 1440
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 1500
aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 1560
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 1620
acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 1680
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg 1740
tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 1800
tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 1860
gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 1920
tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 1980
ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 2040
gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg 2100
gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 2160
caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 2220
tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 2280
tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt 2340
ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 2400
gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 2460
ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 2520
ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 2580
aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 2640
aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 2700
gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 2760
gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 2820
ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 2880
ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct 2940
ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac 3000
cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat 3060
cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc 3120
ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 3180
actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc 3240
gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 3300
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 3360
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3420
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3480
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 3540
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 3600
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 3660
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 3720
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 3780
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 3840
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 3900
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 3960
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 4020
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 4080
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 4140
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 4200
cgctggtagc ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 4260
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 4320
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 4380
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 4440
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 4500
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 4560
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 4620
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 4680
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 4740
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 4800
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 4860
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 4920
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 4980
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 5040
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 5100
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 5160
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 5220
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 5280
ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 5340
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 5400
atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 5428
<210> SEQ ID NO: 6
<211> 6752
<212> DNA
<213> GLP-1R/PcDNA3.1(+)
<400> 6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttatgg ccggcgcccc cggcccgctg cgccttgcgc tgctgctgct 960
cgggatggtg ggcagggccg gcccccgccc ccagggtgcc actgtgtccc tctgggagac 1020
ggtgcagaaa tggcgagaat accgacgcca gtgccagcgc tccctgactg aggatccacc 1080
tcctgccaca gacttgttct gcaaccggac cttcgatgaa tacgcctgct ggccagatgg 1140
ggagccaggc tcgttcgtga atgtcagctg cccctggtac ctgccctggg ccagcagtgt 1200
gccgcagggc cacgtgtacc ggttctgcac agctgaaggc ctctggctgc agaaggacaa 1260
ctccagcctg ccctggaggg acttgtcgga gtgcgaggag tccaagcgag gggagagaag 1320
ctccccggag gagcagctcc tgttcctcta catcatctac acggtgggct acgcactctc 1380
cttctctgct ctggttatcg cctctgcgat cctcctcggc ttcagacacc tgcactgcac 1440
caggaactac atccacctga acctgtttgc atccttcatc ctgcgagcat tgtccgtctt 1500
catcaaggac gcagccctga agtggatgta tagcacagcc gcccagcagc accagtggga 1560
tgggctcctc tcctaccagg actctctgag ctgccgcctg gtgtttctgc tcatgcagta 1620
ctgtgtggcg gccaattact actggctctt ggtggagggc gtgtacctgt acacactgct 1680
ggccttctcg gtcttatctg agcaatggat cttcaggctc tacgtgagca taggctgggg 1740
tgttcccctg ctgtttgttg tcccctgggg cattgtcaag tacctctatg aggacgaggg 1800
ctgctggacc aggaactcca acatgaacta ctggctcatt atccggctgc ccattctctt 1860
tgccattggg gtgaacttcc tcatctttgt tcgggtcatc tgcatcgtgg tatccaaact 1920
gaaggccaat ctcatgtgca agacagacat caaatgcaga cttgccaagt ccacgctgac 1980
actcatcccc ctgctgggga ctcatgaggt catctttgcc tttgtgatgg acgagcacgc 2040
ccgggggacc ctgcgcttca tcaagctgtt tacagagctc tccttcacct ccttccaggg 2100
gctgatggtg gccatattat actgctttgt caacaatgag gtccagctgg aatttcggaa 2160
gagctgggag cgctggcggc ttgagcactt gcacatccag agggacagca gcatgaagcc 2220
cctcaagtgt cccaccagca gcctgagcag tggagccacg gcgggcagca gcatgtacac 2280
agccacttgc caggcctcct gcagctgact cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg 2340
atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 2400
ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 2460
atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 2520
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc 2580
tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc 2640
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 2700
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 2760
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 2820
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 2880
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 2940
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 3000
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg 3060
aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 3120
agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 3180
agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 3240
cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 3300
ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga 3360
ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc cgggagcttg tatatccatt 3420
ttcggatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg 3480
cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 3540
acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 3600
tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 3660
tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 3720
ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 3780
gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 3840
ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 3900
atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 3960
gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 4020
catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 4080
gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 4140
attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 4200
gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga 4260
ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt 4320
ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga 4380
tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg 4440
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 4500
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta 4560
taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 4620
attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 4680
ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 4740
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 4800
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 4860
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 4920
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 4980
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 5040
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 5100
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 5160
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 5220
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 5280
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 5340
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 5400
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 5460
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 5520
ccaccgctgg tagcggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 5580
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 5640
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 5700
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 5760
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 5820
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 5880
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 5940
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 6000
taattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 6060
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 6120
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 6180
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 6240
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 6300
ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 6360
gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 6420
ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 6480
cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 6540
ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 6600
aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 6660
gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 6720
gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc 6752
<210> SEQ ID NO: 7
<211> 1002
<212> DNA
<213> GAPDH
<400> 7
atggtgaagg tcggtgtgaa cggatttggc cgtattgggc gcctggtcac cagggctgcc 60
atttgcagtg gcaaagtgga gattgttgcc atcaacgacc ccttcattga cctcaactac 120
atggtctaca tgttccagta tgactccact cacggcaaat tcaacggcac agtcaaggcc 180
gagaatggga agcttgtcat caacgggaag cccatcacca tcttccagga gcgagacccc 240
actaacatca aatggggtga ggccggtgct gagtatgtcg tggagtctac tggtgtcttc 300
accaccatgg agaaggccgg ggcccacttg aagggtggag ccaaaagggt catcatctcc 360
gccccttctg ccgatgcccc catgtttgtg atgggtgtga accacgagaa atatgacaac 420
tcactcaaga ttgtcagcaa tgcatcctgc accaccaact gcttagcccc cctggccaag 480
gtcatccatg acaactttgg cattgtggaa gggctcatga ccacagtcca tgccatcact 540
gccacccaga agactgtgga tggcccctct ggaaagctgt ggcgtgatgg ccgtggggct 600
gcccagaaca tcatccctgc atccactggt gctgccaagg ctgtgggcaa ggtcatccca 660
gagctgaacg ggaagctcac tggcatggcc ttccgtgttc ctacccccaa tgtgtccgtc 720
gtggatctga cgtgccgcct ggagaaacct gccaagtatg atgacatcaa gaaggtggtg 780
aagcaggcat ctgagggccc actgaagggc atcttgggct acactgagga ccaggttgtc 840
tcctgcgact tcaacagcaa ctcccactct tccaccttcg atgccggggc tggcattgct 900
ctcaatgaca actttgtcaa gctcatttcc tggtatgaca atgaatacgg ctacagcaac 960
agggtggtgg acctcatggc ctacatggcc tccaaggagt aa 1002
<210> SEQ ID NO: 8
<211> 18
<212> DNA
<213> GAPDH1
<400> 8
5’-TCAACGGCAC AGTCAAGG-3’
<210> SEQ ID NO: 9
<211> 18
<212> DNA
<213> GAPDH2
<400> 9
5’-ACCAGTGGAT GCAGGGAT-3’