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1、(10)申请公布号 CN 102649977 A (43)申请公布日 2012.08.29 CN 102649977 A *CN102649977A* (21)申请号 201210129986.3 (22)申请日 2012.04.27 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 南京艾迪康医学检验所有限公司 地址 211100 江苏省南京市江宁区天印大道 671 号卫生应急指挥中心 3-4 楼 (72)发明人 方国伟 周晓犊 王淑一 徐建成 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 黎双华 (54) 发明名称 用于检测白血病 BCR/ABL(m-bc。
2、r) 融合基因 相对表达量的试剂盒 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 用 于 检 测 白 血 病 BCR/ ABL(m-bcr) 融合基因相对表达量的试剂盒， 包括红细胞裂解液、 TRIzol、 氯仿、 无水乙醇、 ReverTraAceqPCRRTKit、 检测体系 PCR 反应液、 阳性对照品和阴性对照品， 其特征在于 ： 检测 体 系 PCR 反 应 液 包 括 THUNDERBIRDqPCRMIX、 检 测 目 的 基 因 用 上 下 游 引 物 m-bcr-F， m-bcr-R，探 针 m-bcr-Probe，检 测 内 参 基 因 Abl 用 引 物 为 abl-F， abl。
3、-R， 探 针 abl-Probe ； 其中，m-bcr-F:GGCGCCTTCCATGGAGAC ； m - b c r - R : T C C T T G G A G T T C C A A C G A ； m - b cr-Probe:TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTG AA ； abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ； abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC ； abl-Probe:FAM- ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)。
4、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 用于检测白血病 BCR/ABL(m-bcr) 融合基因相对表达量的试剂盒， 包括红细胞裂解 液、 TRIzol、 氯仿、 无水乙醇、 ReverTra Ace qPCR RT Kit、 检测体系PCR反应液、 阳性对照品 和阴性对照品， 其特征在于 ： 检测体系 PCR 反应液包括 THUNDERBIRD qPCR MIX、 检测目的基因用上下游引物 m-bcr-F， m-bcr-R， 探针 m-bcr-Probe， 检测内参基因 Abl 用引物为 abl。
5、-F， abl-R， 探针 abl-Probe ； 其中， m-bcr-F: GGCGCCTTCCATGGAGAC m-bcr-R: TCCTTGGAGTTCCAACGA m-bcr-Probe: TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于所述阳性对照品分别为含有 BCR/ ABL(m-bcr) 基因的溶液 ； 所述阴性对照品为无 BCR/A。
6、BL(m-bcr) 基因的溶液。 权 利 要 求 书 CN 102649977 A 2 1/5 页 3 用于检测白血病 BCR/ABL(m-bcr) 融合基因相对表达量的 试剂盒 技术领域 0001 本发明属生命科学和生物技术领域， 特别是一种基因检测试剂盒， 采用探针实时 荧光定量 PCR 技术， 能够对人类急性淋巴细胞白血病 (ALL)、 急性粒细胞白血病 (AML) 以及 少数慢性粒细胞白血病(CML)患者体内BCR/ABL(m-bcr)融合基因表达水平进行检测， 可有 效的节约检测时间， 提高检测精度。 背景技术 0002 白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。 其克隆中的白血病。
7、细胞失去进 一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。 在骨髓和其他造血组织中白血病细胞 大量增生积聚并浸润其他器官和组织， 同时使正常造血受抑制， 临床表现为贫血、 出血、 感 染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程， 白血病可分为急性和慢性 两大类。急性白血病病情进展迅速， 自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系 列归属分为急性髓系白血病 (AML) 和急性淋巴细胞白血病 (ALL) 两大类。而慢性白血病的 发生是由于有功能的已分化成熟细胞过度增生， 因此慢性白血病是一种由于信号传导不良 或细胞增殖失控所至的疾患， 而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性。
8、白血病 (CML)、 慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)。由于白血病类型不同， 治疗方案及预后亦不尽相同， 因此诊断成立后， 应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理， 至今仍未完全明了。 已知病因有感染因素、 电离辐射、 化学物质， 遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病 病因是以上各种因素相互作用的结果。 0003 近十余年来慢性粒细胞白血病 (CML) 的分子生物学研究不断有新的进展， 其 中之一就是陆续报道了二十余例 BCR(breakpoint cluster region) 基因上的断裂 点 不 在 M-bcr(majorbreakpoint duster region) 而 。
9、位 于 m-ber(minor breakpoint dusterregion)、 表达相对分子质量为 190000 BCR/ABL 融合蛋白的 CML(P190 CML)。P190 CML 是一个罕见的 CML 分子亚型。除了 20 -50的 Ph+ALL 表达与 CML 一样的 P210 以外， 50 -80的 PML-ALL 患者 BCR 基因中的断裂点不在 M-bcr 内， 而位于其 5 端上游至少 30 kb 处， 即长 70 kb 的第 1 内含子 3 端的一半序列上， 这一长 35 kb 的区域， 最初又确定了两 个片段 ： bcr-2 和 bcr-3， 其中 bcr-3 位于 。
10、bcr-2 的 5 端上游 16kb， 现该两个片段已统称为 m-bcr 或 mbcrl， 融合方式为 ela2 连接， 转录成 7.5 kb 或 7.0 kb 的 mRNA， 翻译成相对分子 质量为 190 000 或 185 000 的蛋白产物 P190bcr-ab1或 P185bcr-ab1。由于早期仅发现 ALL 和急 性髓系白血病 (AML) 表达 P190， 因此 m-bcr 被称为 ALL 型断裂点 (ALL-type breakpoint)， P190 被认为是特有的 (ALL-specific， 称为 Ph+bcr-ALL 或 P190 ALL) 或急性白血病相关的 (AL-。
11、associated)。P190CML 发现后不久， 即有报道 P210 CML 患者进入加速期、 急变期时也 可出现 P190， 提示 P190 可能与 P210 CML 疾病进展有关。后又发现 70以上慢性期 P210 CML 患者初诊时也可检测到数量不等的 P190。因而， 导致产生 P190 的 BCR-ABL 连接类型并 非是 Ph+AL 特有的。但是 P190 比 P210 的致癌能力更高， 表达更倾向于导致 AL 表型是无疑 说 明 书 CN 102649977 A 3 2/5 页 4 的。因此， 从 CML 中筛选出 P190 个体对于后期的治疗显得尤为重要。 0004 在实际。
12、应用中， 用于检测 BCR/ABL(m-bcr) 融合基因表达水平的方法主要为荧光 原位杂交， 尽管该法较为直观， 但是试验过程过于繁琐， 需要的试剂种类繁多， 费时费力， 且 试验结果需要经验丰富的专家来判读， 结果判读存在较大的主观性， 因而一定程度上限制 了该法的应用。 0005 实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性， 而且能对PCR进行实时检测， 可 准确反映患者体内 BCR/ABL(m-bcr) 的表达情况， 节约了大量的检测时间， 还避免了残留污 染的发生。常见的方法有 SYBR GreenI 染料法， 双探针杂交法以及 Taqman 技术等。其中 SYBR GreenI 。
13、由于是非饱和染料， 特异性不如双探针杂交法以及 Taqman 法， 必须通过观察 溶解曲线来判断其特异性 ； 而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光 PCR 技术结合 Taqman 探针法应用于 BCR/ABL(m-bcr) 的基因检测。 发明内容 0006 鉴于现有技术中检测BCR/ABL(m-bcr)的不足， 本发明设计了检测内参/目的基因 用引物、 探针序列， 用荧光定量PCR技术检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量。 通过调整两个基因的引物探针浓度及比例， 优化 PCR 的反应体系和反应条件， 开发了一种 用于检测白血病 BCR/ABL(m-bcr)。
14、 融合基因相对表达量的试剂盒。 0007 用于检测白血病 BCR/ABL(m-bcr) 融合基因相对表达量的试剂盒， 包括红细胞裂 解液、 TRIzol、 氯仿、 无水乙醇、 ReverTra Ace qPCR RT Kit、 检测体系PCR反应液、 阳性对照 品和阴性对照品， 其特征在于 ： 0008 检测体系 PCR 反应液包括 THUNDERBIRD qPCR MIX、 检测目的基因用上下游引 物 m-bcr-F， m-bcr-R， 探针 m-bcr-Probe， 检测内参基因 Abl 用引物为 abl-F， abl-R， 探针 abl-Probe ； 其中， 0009 m-bcr-F 。
15、： GGCGCCTTCCATGGAGAC 0010 m-bcr-R ： TCCTTGGAGTTCCAACGA 0011 m-bcr-Probe ： TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA 0012 abl-F ： GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG 0013 abl-R ： ATGATATAGAACGGGGGCTC 0014 abl-Probe ： FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。 0015 所述阳性对照品分别为含有 BCR/ABL(m-bcr) 基因的溶液 ； 所述阴性对照品为无 BCR/ABL(m-bcr) 基因的溶液。 0016 其中的 R。
16、everTra Ace qPCR RT Kit 为 TOYOBO 公司生产的 qPCR 用 cDNA 试剂盒产 品。 0017 THUNDERBIRD qPCR MIX为TOYOBO公司生产的定量PCR试剂， 产品规格为QPS-101。 0018 使用本发明的试剂盒， 将实时荧光 PCR 技术结合采用 Tapman 探针， 可以对 BCR/ ABL(b3a2， b2a2) 融合基因的表达水平进行检测， 检测精度高， 而且操作简单， 可降低检测成 本， 节约检测时间。采用双标准曲线法， 通过构建 BCR/ABL(m-bcr) 和内参基因 abl 的标准 定量曲线， 精确定量样本的内参基因拷贝数和。
17、 BCR/ABL(m-bcr) 拷贝数， 相比于以往的免疫 组化方法和现今的 CT 法， 该试剂盒具有精度高， 结果便于判读等优点。加之该试剂盒将 说 明 书 CN 102649977 A 4 3/5 页 5 反应体系所需的引物、 探针进行合理配比和优化， 使实验条件达到最佳， 从而省去了繁琐的 条件摸索环节， 大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好， 灵敏度高， 操作简便。有 助于临床上急性淋巴细胞白血病 (ALL)、 急性粒细胞白血病 (AML) 早期预防、 早期诊断的辅 助性指标 ； 还可对于疑似进入慢性粒细胞白血病 (CML) 加速期、 急变期的高危人群进行较 为准确的筛查。 附图。
18、说明 0019 图 1 ： 阳性结果示意图。 0020 图 2 ： 阴性结果示意图。 具体实施方式 0021 实施例 1 0022 本发明的用于检测白血病 BCR/ABL(m-bcr) 融合基因相对表达量的试剂盒， 包括 ： 0023 红细胞裂解液 ； 0024 TRIzol ； 0025 氯仿 ； 0026 无水乙醇 ； 0027 ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO 公司 ) ； 0028 检测体系 PCR 反应液 ： THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(2)、 BCR/ABL(m-bcr) 上、 下游引物各0.8uM、 BCR/ABL(m-bc。
19、r)探针0.4uM ； abl上、 下游引物各0.8uM、 abl-prob e(探 针 )0.4uM ； 其中 ： 0029 m-bcr-F ： GGCGCCTTCCATGGAGAC 0030 m-bcr-R ： TCCTTGGAGTTCCAACGA 0031 m-bcr-Probe ： TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA 0032 abl-F ： GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG 0033 abl-R ： ATGATATAGAACGGGGGCTC 0034 abl-Probe ： FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。 0035 阳性对照品 。
20、： 分别含 BCR/ABL(m-bcr) 基因组溶液 ； 0036 阴性对照品 ： 不含 BCR/ABL(m-bcr) 基因组溶液。 0037 实施例 2 0038 本发明试剂盒的使用方法 ： 0039 (1) 抽提血液中的组织 RNA ： 在洁净的 1.5ml 的离心管中加入 1ml 红细胞裂解液， 取抗凝血 0.5ml 混匀。室温静置 10min ； 5000rpm 离心 5min， 弃上清， 收集底部的细胞 ； 再次 加入 0.5ml 红细胞裂解液， 5000rpm 离心 5min， 弃上清， 收集底部的细胞 ； 向细胞中加入 1ml TRIzol， 反复吹打直至沉淀完全溶解， 室温静止。
21、5min ； 加入0.2ml氯仿， 震荡均匀 ； 14000rpm 4离心 10min， 吸取上清层转移至另一新的离心管中 ； 加入等体积的异丙醇， 上下充分混 匀， 室温静置10min ； 14000rpm 4离心10min， 弃上清， 加入75乙醇1ml， 轻轻上下颠倒洗 涤管壁 ； 14000rpm 4离心 5min， 弃乙醇 ； 室温干燥 10-15min， 加入 20ulRNase-free 水溶 解沉淀。 说 明 书 CN 102649977 A 5 4/5 页 6 0040 (2) 参考 TOYOBO 公司的 Rever Tra Ace qPCR RT Kit 试剂盒说明书， 将。
22、 RNA 反转 为 cDNA。 0041 (3)试剂配置 ： 按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul， 每人份23ul分装 ： 0042 X 23ul 反应液 (8 份内参 ( 标准曲线 )+8 份目的基因 ( 标准曲线 )+n 份标本 +1 份阳性对照 +1 份阴性对照 +1 份空白对照 ) ； 0043 (4) 加样 ： 加入检测体系 PCR 反应液中 2ulcDNA ； 阳性对照和阴性对照直接加 2ul 阳性对照品和阴性对照品 ； 空白对照加 2ul 生理盐水或不加任何物质。 0044 (5) 检测 ： 检测在实时荧光 PCR 仪上进行， 可用仪器包括 ABI7300， 7500。
23、( 美国 Applied Biosystems 公司 ) 等。反应条件 ： 95预变性 1min ； 95 15s， 58 35sec 40 个 循环， 荧光信号于 58 35sec 时采集。 0045 (6) 结果判断 ： 将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上， 系统根据标准曲线 和 CT 值自动计算出拷贝数。 0046 1) 内参阳性时， 检测结果才认为有效 ； 0047 2) 阳性判断标准 ： ， Ct 36， 为阳性 ； 35 Ct 38， 为疑似阳性， 需要再次验证 ； Ct 38， 为阴性。 0048 实施例 3 0049 采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本 0050 取送检的。
24、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、 急性粒细胞白血病 (AML) 以及少数慢性粒 细胞白血病(CML)患者抗凝血标本共50例， 按实施例2所述方法提取基因组RNA、 配制试剂 并检测。 0051 每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。 同时做阳性， 阴性， 空白对照， 内参基因 / 目的基因的标准曲线各一份。一台 96 孔的荧光 PCR 仪可同时检测 38 份样品， 每个样本 2 次重复， 一份阳性对照， 一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为 100 分钟。 0052 实验结果与特检实验室的报告结果相比较， 确定样品检测的准确率。部分阳性结 果如下表 ： 0053 说 明 书 CN 10。
25、2649977 A 6 5/5 页 7 0054 表1为本次实验结果和PCR实验室结果的对比， 从上表可以看出， 18例样本全部与 特检的检测结果相符， 符合率达到100。 说明本发明检测试剂盒与特检利用常规荧光定量 方法相比， 不但检测结果准确性高， 而且缩短了检测时间， 提高了检测效率。 0055 实施例 4 临床样品检测 0056 取待检的临床样品 2 份， 按实施例 2 所述方法提取基因组、 配制试剂并检测。 0057 每份样品加入检测体系 PCR 反应液中 2ul。同时做阳性， 阴性， 空白对照各一份。 用荧光 PCR 仪检测， 时间为 100 分钟。 0058 样品 1 的检测结果。
26、图如图 1 所示， 内参基因 abl 的扩增信号显示被检样本基因组 提取成功， 检测结果有效， 样品 1 的 P190CT 值 36 之前有扩增信号， 所以样品 1 为 P190 阳 性。 0059 样品 2 的检测结果图如图 2 所示， 内参基因 abl 的扩增信号显示被检样本基因组 提取成功， 检测结果有效， 样品 2 的 P190CT 值 38 之后无扩增信号， 所以样品 2 为 P190 阴 性。 说 明 书 CN 102649977 A 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 南京艾迪康医学检验所有限公司 用于检测白血病 BCR/ABL(m-bcr) 融合基因相对表达量。
27、的试剂盒 6 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 1 ggcgccttcc atggagac 18 2 18 DNA 人工序列 2 tccttggagt tccaacga 18 3 24 DNA 人工序列 3 tttgagcctc agggtctgag tgaa 24 序 列 表 CN 102649977 A 8 2/2 页 9 4 21 DNA 人工序列 4 gccgtgaaga ccttgaagga g 21 5 20 DNA 人工序列 5 atgatataga acgggggctc 20 6 20 DNA 人工序列 6 acctggtgca gctccttggg 20 序 列 表 CN 102649977 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102649977 A 10 。