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1、(10)申请公布号 CN 102482661 A (43)申请公布日 2012.05.30 CN 102482661 A *CN102482661A* (21)申请号 201080031045.5 (22)申请日 2010.06.15 09165058.0 2009.07.09 EP C12N 9/86(2006.01) C12N 9/96(2006.01) (71)申请人 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 地址 荷兰代夫特 (72)发明人 威廉比杰勒威尔德 鲁道夫范德波尔 洛兰德克里斯琴沃林格 (74)专利代理机构 北京东方亿思知识产权代理 有限责任公司 11258 代理人 肖善强 (54) 。
2、发明名称 经稳定化的酶组合物 (57) 摘要 本发明涉及包含酶和辛醇的组合物。 另外， 本 发明涉及包含过渡金属离子的组合物。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.01.09 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2010/058410 2010.06.15 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/003703 EN 2011.01.13 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 包含酶和辛醇。
3、的组合物， 其中辛醇的量为按总组合物重量计 0.1到 5。 2. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其中所述辛醇是 1- 辛醇。 3. 根据权利要求 1 到 2 中任一项所述的组合物， 其中所述酶是乙内酰脲酶。 4. 根据权利要求 3 所述的组合物， 其还包含氨甲酰基水解酶。 5. 根据权利要求 3 到 4 中任一项所述的组合物， 其还包含消旋酶。 6. 根据权利要求 1 到 5 中任一项所述的组合物， 其还包含过渡金属离子。 7. 根据权利要求 6 所述的组合物， 其中所述过渡金属是钴或锰。 8. 用于生产包含酶和辛醇的下述组合物的方法， 其中辛醇的量为按总组合物重量计 0.1到 5， 所述。
4、方法包括在生产所述酶之后添加辛醇。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中所述辛醇是 1- 辛醇。 权 利 要 求 书 CN 102482661 A 2 1/12 页 3 经稳定化的酶组合物 发明领域 0001 本发明涉及包含酶和辛醇的组合物。另外， 本发明涉及包含过渡金属离子的组合 物。 0002 发明背景 0003 展示许多不同官能团的酶的复杂化学结构不仅给予了酶在催化大范围转化时前 所未有的特异性和反应性， 并且是酶属于相对易变的化合物的原因。 显然， 这一现象导致了 下述事实 ： 用于优化酶稳定性的研究持续进行， 导致对一般性问题产生了大量的通常是特 异性的解答。 0004 酶可以。
5、通过酶三维结构的解折叠 (unfolding) 或通过化学降解而去稳定化 (destablized)。去稳定化可由于与极性溶剂、 微生物攻击、 电解质、 表面活性剂、 温度和极 端 pH 的接触而容易地发生。为了补偿储藏阶段期间酶活性的损失， 配制者可在液体酶组合 物中使用过量的酶。然而， 这是一种不受欢迎的解决方案， 因为酶是相对昂贵的配制物成 分。该问题可以通过添加稳定剂来克服。用于使酶稳定化的材料包括多种有机和无机化合 物， 例如多元醇， 羧酸， 羧酸盐， 羧酸酯， 和糖 ； 钙盐 ； 硼化合物， 及其多种组合。也可以使用 蛋白质提取物， 通过抑制酶而使酶稳定化。 0005 然而， 由于。
6、存在大量多种酶， 所以仍然需要、 并且将来也需要对酶去稳定化这一问 题的替代性解决方案。 0006 发明详述 0007 本发明的第一方面中公开了包含酶和辛醇的组合物。 这样的组合物令人惊讶地展 示出与不含辛醇的相同混合物相比增强的稳定性。优选地， 所述辛醇是 1- 辛醇， 但同分异 构体例如 2- 辛醇、 3- 辛醇、 2- 甲基 -1- 庚醇、 3- 甲基 -1- 庚醇也展示出类似的特性。组合 物中优选的辛醇量是占总组合物重量的 0.05到 15， 更优选地占总组合物重量的 0.1 到 5。 0008 在本发明第一方面的一个实施方案中， 酶是乙内酰脲消旋酶。具有乙内酰脲消 旋酶活性的多肽 (。
7、 也称作乙内酰脲消旋酶 ) 是本领域已知的。它们已在多种生物中被 发现， 例如 WO 01/23582 描述了来自 Arthrobacter aurescens(DSM 3747) 的乙内酰脲 消旋酶， JP 04271784 描述了来自 Pseudomonas NS 672 的乙内酰脲消旋酶 (Watabe et al.， J.Bact.174， 3461-3466(1992)。还描述了 Sinorhizobium meliloti( 保藏号 CAC 47181， Capela et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.98， 9877-9882(2001) 中， Microba。
8、cterium liquefaciens( 保藏号 CAD 32593， EP 1188826) 中， 和 Agrobacterium tumefaciens 菌株 C58( 保藏号 AAL 45498、 AAK 88746 和 AAK 90298， Las Heras-Vazquez et al.， Biochem. Biophys.Res.Commun.303， 541-547(2003)， Wood et al.， Science 294， 2317-2323(2001) 和 Hinkle et al.， NCBI database， Complete Genome Sequence o。
9、f Agrobacterium tumefaciens C58(Rhizobium radiobacter C58)， the Causative Agent of Crown Gall Disease in Plants.Direct Submission， submitted August 14， 2001) 中的乙内酰脲消旋 酶。显示乙内酰脲消旋酶并且不具有底物抑制的经分离的多肽已在 WO 2003/100050 中描 说 明 书 CN 102482661 A 3 2/12 页 4 述。通常， 乙内酰脲消旋酶意味着存在多于一种酶， 例如乙内酰脲酶和消旋酶。已经发现本 发明还适用于包含其他。
10、酶例如氨甲酰基水解酶 (carbamoylases) 的混合物。 0009 在第二个实施方案中， 本发明提供了包含酶、 辛醇和过渡金属离子的组合物。 酶和 金属的组合本身是已知的。 事实上， 某类酶(即金属酶)仅能在存在金属时发挥功能。 金属 酶是含有金属离子辅因子的酶的总称。事实上， 所有酶中约四分之一到三分之一需要金属 来发挥它们的功能。金属离子通常通过属于多肽链中氨基酸和 / 或掺入酶内的大环配体的 氮、 氧或硫原子来配位。 金属离子的存在允许金属酶发挥功能， 例如通过氨基酸中存在的有 限的官能团集合不容易进行的氧化还原反应(.Messerschmidt et al.， (2001)Ha。
11、ndbook of Metalloproteins ； Wiley， ISBN 0-471-62743-7)。通常， 这些金属 ( 例如过渡金属 ) 的量非 常低， 从而在配制物中的浓度不超过 1-100mol/kg。事实上， 更高的浓度对酶而言通常是 有毒的。惊讶地发现， 某些相对高浓度的过渡金属对酶具有稳定化效应。因此， 在包含酶的 组合物中， 范围从 2mmol/kg 到 100mmol/kg 的过渡金属离子浓度导致增强的酶稳定性。优 选地， 所述过渡金属以范围从 2.5mmol/kg 到 50mmol/kg， 更优选地从 3mmol/kg 到 25mmol/ kg 的浓度存在。优选地，。
12、 本发明的过渡金属是钴或锰。 0010 在本发明的上下文中， 术语过渡金属(有时也称作过渡元素)是指下述元素， 其原 子具有不完全的 d 亚壳层， 或能够产生具有不完全的 d 亚壳层的阳离子。该定义对应于元 素周期表的第 3 族到第 11 族。 0011 本发明的第二个方面中提供了用于制备包含酶和辛醇的组合物的方法， 所述方法 包括在生产所述酶后添加辛醇。所述生产可以是发酵过程， 任选地之后进行一个或多个下 游加工步骤， 例如浓缩， 例如通过蒸发、 渗滤 (diafiltration)、 冻干、 微量过滤、 超滤和技术 人员已知的相似或其他技术进行。 附图说明 0012 图 1 展示了辛醇和锰。
13、 (Mn2+) 的存在对来自 Escherichia coli RV308 的 L- 乙内酰 脲酶随时间的残余活性的影响。Y- 轴表示以为单位的相对于起始活性 ( 设定为 100 ) 的残余活性。X- 轴表示孵育时间 (g)。图例 ： 空白 ( 未添加 Mn2+或辛醇 ) ； 1mM Mn2+； 5mM Mn2+； 10mM Mn2+； 辛醇 ； 辛醇+1mM Mn2+； 辛醇+5mM Mn2+； 辛醇 +10mM Mn2+。可以看出， 辛醇的添加导致与空白样品相比残余活性的提高。与 1mM、 5mM 和 10mM Mn2+( 它们自身也对酶活性的稳定化具有影响 ) 的组合进一步增强了辛醇的积。
14、 极贡献。 实施例 0013 材料和方法 0014 除非另有说明， 使用的所有分子技术基本上根据 Maniatis et al.(J.Sambrook， E.F.Fritsch， T.Maniatis.Molecular Cloning 2nd edition.CSH Press) 进行。 0015 用于将 pKECaroP-hyu1 构建体转化进 Escherichia coli RV308 的流程 0016 在冰上融化 Escherichia coli RV308 小份试样 (200l， 超感受态 ) 0017 添加 15l LR 反应混合物 ( 见上文 ) 0018 在冰上孵育 30 分。
15、钟 说 明 书 CN 102482661 A 4 3/12 页 5 0019 42热激 1 分钟 0020 在冰上将细胞冷却 2 分钟 0021 添加 1ml LB 培养基 (5g/l NaCl、 5g/l 酵母提取物、 10g/l 胰蛋白胨 ) 0022 在 37孵育 1 小时 0023 涂布在补充有卡那霉素的 LB 琼脂平板上 (5g/l NaCl、 5g/l 酵母提取物、 10g/l 胰蛋白胨、 15g/l 琼脂、 50mg/l 卡那霉素 ) 0024 在 28下孵育 24 小时 0025 分离单个菌落 0026 用于在 Escherichia coli RV308 中表达 Hyu 基因。
16、的流程 0027 使用来自转化 ( 见上文 ) 的单个克隆接种补充有 0.05g/l 卡那霉素和分别为 1mM MnCl2或 CoCl2的 5ml 2xTY 培养基 (10g/l 酵母提取物、 16g/l 胰胨、 5g/l NaCl)。将培养 物在 28和 150rpm 下孵育 24 小时， 然后用于接种补充有 0.05g/l 卡那霉素和分别为 1mM MnCl2或 CoCl2的 100ml2xTY 培养基。将培养物在前述条件下再次孵育 24-28 小时， 随后通 过离心(20分钟， 5000rpm， 4)收获。 将细胞沉淀物重悬于5ml Tris-HCl(100mM， pH7)中， 再次离心。
17、 (20 分钟， 5000rpm， 4 )， 并将细胞冷冻于 -20下。 0028 分析方法 0029 乙内酰脲酶活性测定法 0030 单位定义 ： 一个乙内酰脲酶活性单位被定义为在 pH8.0 和 40下每分钟生产 1mol N- 氨甲酰基苯丙氨酸的酶的量。 0031 底物 ： 130mM TRIS/HCl 缓冲液 pH8.0 中的 100mM D/L- 苯丙氨酸乙内酰脲悬浮液， 其还含有 1.43mM MnCl2。 0032 样品预处理 ： 将一克样品悬浮于还含有 1.43mM MnCl2的 10mL 130mM TRIS/HCl 缓 冲液 pH8.0 中。混合后用相同的缓冲液将悬浮液稀释。
18、至约 0.9U/mL。使用前将样品保持在 冰上。该方法的线性范围是从 0.16 到 1.62U/mL。 0033 测定法 ： 将 2.1mL 底物悬浮液置于反应管中， 随后在 40水浴中预加热 10 分钟。 通过添加 100L 样品并混合来起始反应。通过用 100L 缓冲液代替样品来孵育底物， 使 底物空白被包括在内。30 分钟后如下所述终止酶促反应 ： 添加 400L 1M HCl 溶液， 之后 混合， 并随后在冰水上冷却。将反应混合物在 0.45m 滤器上过滤。将澄清的溶液转移进 HPLC 注射管中。 0034 标准 ： 1mM N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸和 L- 苯丙氨酸。 003。
19、5 反应混合物和标准的 HPLC ： 0036 柱 ：苯基 5m， 4.6X150mm， Waters 0037 检测器 ： UV220nm 0038 流速 ： 1.2mL/ 分钟 0039 注射体积 ： 20l 0040 样品架温度 ： 10 0041 柱温度 ： 室温 0042 运行时间 ： 20 分钟 0043 流动相 A ： 40mM 磷酸缓冲液 ； pH5.2/ 乙腈 (98/2(v/v) 说 明 书 CN 102482661 A 5 4/12 页 6 0044 流动相 B ： 40mM 磷酸缓冲液 ； pH5.2/ 乙腈 (70/30(v/v) 0045 梯度 ： 0046 时间 。
20、分钟 流动相 A 流动相 B 0 100 0 13 0 100 15 100 0 20 100 0 0047 驻留时间(可根据使用的HPLC系统而不同) ： 3.40分钟 ： L-苯丙氨酸 ； 5.17分钟 ： N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸 ； 9.96 分钟 ： 底物苯丙氨酸 - 乙内酰脲。 0048 计算 ： 使用下式计算对 1mM 标准 N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸和 L- 苯丙氨酸的响应 因子 (response factor) ： 0049 0050 0051 其中 ： 0052 RFN-cpa 1mM N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸的响应因子 mAU.min.L/mmol 0。
21、053 RFPhe 1mM 苯丙氨酸的响应因子 mAU.min.L/mmol 0054 峰面积 N-cpa N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸的峰面积 mAU.min 0055 峰面积 Phe苯丙氨酸的峰面积 mAU.min 0056 Vk 标准溶液的烧瓶体积 mL 0057 DfN-cpa N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸标准溶液的总稀释因子 mL 0058 DfPhe苯丙氨酸标准溶液的总稀释因子 mL 0059 WN-cpa N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸的重量 mg 0060 WPhe苯丙氨酸的重量 mg 0061 PN-cpa N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸的纯度 0062 PPhe苯丙氨酸的纯度 。
22、0063 MWN-cpa N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸的分子量 (208g/mol) 0064 MWPhe苯丙氨酸的分子量 (165.19g/mol) 0065 使用下式计算乙内酰脲酶活性 ： 0066 0067 说 明 书 CN 102482661 A 6 5/12 页 7 0068 其中 ： 0069 样品面积 N-cpa样品的 N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸峰面积 0070 空白面积 N-cpa空白的 N- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸峰面积 0071 样品面积 Phe样品的苯丙氨酸峰面积 0072 空白面积 Phe空白的苯丙氨酸峰面积 0073 Vt总反应体积 (mL) 0074 Dfsam样。
23、品的稀释因子 0075 Vsam样品体积 (mL) 0076 Vk样品的烧瓶体积 0077 t 孵育时间 ( 分钟 ) 0078 W 样品重量 (g) 0079 氨甲酰基水解酶活性测定法 0080 单位定义 ： 一个氨甲酰基水解酶活性单位被定义为在 pH8.0 和 40下， 每分钟生 产 1mol 苯丙氨酸的酶的量。 0081 底物 ： 130mM TRIS/HCl 缓冲液 pH8.0 中的 100mM N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸悬浮 液， 其还含有 1.43mM MnCl2。 0082 样品预处理 ： 将一克样品悬浮于还含有 1.43mM MnCl2的 10mL 130mM TRIS/。
24、HCl 缓 冲液 pH8.0 中。混合后用相同的缓冲液将悬浮液稀释至约 1.5U/mL。使用前将样品保持在 冰上。该活性测定法的线性范围是从 0.32 到 3.15U/mL。 0083 测定法 ： 见乙内酰脲酶测定法。 0084 标准 ： 1mM L- 苯丙氨酸。 0085 反应混合物和标准的 HPLC ： 见乙内酰脲酶测定法 0086 计算 ： 使用下式计算对 1mM L- 苯丙氨酸标准的响应因子 ： 0087 0088 其中 ： 0089 RFPhe 1mM 苯丙氨酸的响应因子 mAUxminxL/mmol 0090 峰面积 Phe峰面积苯丙氨酸 mAUxmin 0091 Vk 苯丙氨酸标。
25、准溶液的烧瓶体积 mL 0092 DfPhe苯丙氨酸标准溶液的稀释因子 0093 WPhe苯丙氨酸的重量 mg 0094 PPhe苯丙氨酸的纯度 0095 MWPhe苯丙氨酸的分子量 165.19mg/mmol 0096 使用下式计算氨甲酰基水解酶活性 ： 0097 说 明 书 CN 102482661 A 7 6/12 页 8 0098 其中 ： 0099 样品面积 Phe样品的苯丙氨酸峰面积 mAUxmin 0100 空白面积 Phe空白的苯丙氨酸峰面积 mAUxmin 0101 Vt总反应体积 mL 0102 Dfsam样品的稀释因子 0103 Vk样品的烧瓶体积 0104 Vsam样品。
26、体积 mL 0105 t 孵育时间 min 0106 W 样品重量 g 0107 消旋酶活性测定法 0108 单位定义 ： 一个消旋酶活性单位被定义为在 pH8.0 和 37下每分钟从 D- 苯丙氨 酸 - 乙内酰脲生产 1mol L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的酶的量。 0109 底物 ： 130mM TRIS/HCl 缓冲液 pH8.0 中的 10mM D- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲溶液， 其 还含有 0.1M EDTA。溶液必须在 37下制备。 0110 样品预处理 ： 将一克样品悬浮于还含有0.1M EDTA的10mL 130mMTRIS/HCl缓冲液 pH8.0 中。混合后用相同的缓冲液。
27、将悬浮液稀释至约 0.5U/mL。使用前将样品保持在冰上。 该测定法的线性范围是从 0.19 到 1.16U/mL。 0111 测定法 ： 将 2.0mL 底物溶液置于 37水浴中的反应管中。2 分钟后通过添加 100L样品并混合来起始反应。 通过用100L缓冲液代替样品来孵育底物， 使底物空白被 包括在内。30 分钟后如下所示终止酶促反应 ： 添加 400L 1M NaOH 溶液， 之后混合。将反 应混合物在 0.45m 滤器上过滤。将澄清的溶液转移进 HPLC 注射管中。 0112 标准 ： 1mM L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲和 1mM N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸。 0113 反应。
28、混合物和标准的 HPLC ： 0114 柱， w. 前置柱 ： Chirobiotic T(250mmx4.6mm I.D.， 5m)， Astec 0115 检测器 ： UV220nm 0116 流速 ： 1.5mL/ 分钟 0117 注射体积 ： 20l 0118 样品架温度 ： 10 0119 柱温度 ： 室温 0120 运行时间 ： 8 分钟， 无梯度 0121 流动相 ： 15mM 乙酸铵 pH4.1/20甲醇 0122 驻留时间(可根据使用的HPLC系统而不同) ： 5.46分钟 ： 底物D-苯丙氨酸-乙内 酰脲 ； 7.21 分钟 ： 产物 L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲。当乙内酰。
29、脲酶未被 EDTA 完全抑制时， L- 和 D- 氨甲酰基 - 苯丙氨酸的峰可分别在约 2.8 和 3.5 分钟处可见。 0123 计算 0124 使用下式计算对 1mM L- 苯丙氨酸标准的响应因子 ： 0125 说 明 书 CN 102482661 A 8 7/12 页 9 0126 其中 ： 0127 RFLPH 1mM L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的响应因子 0128 峰面积 LPH L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的峰面积 mAUxmin 0129 VkLPH L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲标准溶液的烧瓶体积 mL 0130 WLPH L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的重量 mg 0131 P。
30、LPH L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的纯度 0132 MWLPH L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的分子量 190g/mol 0133 使用下式计算对 1mM 标准 N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的响应因子 ： 0134 0135 其中 ： 0136 RFLCP 1mM N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的响应因子 0137 峰面积 LCP峰面积 N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸 mAUxmin 0138 VkLCP N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸标准的烧瓶体积 mL 0139 WLCP N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的重量 mg 0140 PLCP N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的纯度 0。
31、141 MWLCP N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的分子量 208g/mol 0142 使用下式计算消旋酶活性 ： 0143 0144 其中 ： 0145 样品面积 LPH样品的 L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的峰面积 mAUxmin 0146 空白面积 LPH经校正的空白的 L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的面积 mAUxmin 0147 样品面积 LCP样品的 N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的面积 mAUxmin 0148 空白面积 LCP空白的 N- 氨甲酰基 -L- 苯丙氨酸的峰面积 mAUxmin 0149 Vt总反应体积 mL 0150 Dfsam样品的稀释因子 0151 Vsam样。
32、品体积 mL 0152 t 孵育时间 min 0153 Vk样品的烧瓶体积 mL 0154 W 样品重量 g 0155 经校正的空白的 L- 苯丙氨酸 - 乙内酰脲的峰面积是校正样品在 HPLC 中时发生的 自发消旋化所必需的， 并且如下计算。用系列结束时和系列开始时空白的差异除以它们之 间的运行次数。 该数值代表了每次运行期间LPH的提高。 将该数值与第一空白的数值相加， 乘以样品和第一空白之间运行的量。 0156 实施例 1 说 明 书 CN 102482661 A 9 8/12 页 10 0157 构建用于在 E.coli RV308 中共同表达 L- 乙内酰脲酶、 L- 氨甲酰基水解酶。
33、和乙内 酰脲消旋酶的克隆 0158 目 的 是 获 得 来 自 Arthrobacter aurescens 的 L- 乙 内 酰 脲 酶 (HyuH)、 来 自 Bacillus stearothermophilus 的 L- 氨 甲 酰 基 水 解 酶 (HyuQ) 和 来 自 Agrobacterium radiobacter 的乙内酰脲消旋酶 (HyuA) 在宿主 Escherichia coli RV308 中的活性共同表 达， 产生用于生产 L- 氨基酸的生产菌株。 0159 这 3 种酶的序列从以下的文献已知 ： 0160 L- 乙内酰脲酶来自 Abendrodt et al.B。
34、iochemistry 41(27)， 8589-8597(2002) 0161 L- 氨甲酰基水解酶来自 Battise et al.Appl.Environ.Microbiol.63(2)， 763-766(1997) 0162 乙内酰脲消旋酶来自 EP 1506294B1。 0163 根据 WO 2008/067981 以合成方式制备操纵子， 其中乙内酰脲途径的三种基 因 (hyuH、 hyuC、 hyuA) 通过间隔物 (spacers) 彼此分离， 该间隔物含有核糖体结合位点 rbs(Shine-Delgarno序列)和用于进一步亚克隆的限制性位点。 针对在Escherichia c。
35、oli RV308 中的表达， 优化酶编码区的 DNA 序列。 0164 随后将 Hyu1 操纵子克隆进表达载体中。通过用 aroH 启动子 hyu1 操纵子 代替 trp 启动子 PenG 酰基酶表达盒， 从质粒 pKECtrp( 描述于 WO 0066751 中 ) 来衍 生表达载体 pKECaro hyu1。 0165 将 DNA 转化进超感受态 Escherichia coli RV308 细胞 ( 如材料和方法中所述 ) 中， 并从琼脂平板上分离单个克隆。将克隆在补充有卡那霉素 (5g/l NaCl、 5g/l 酵母提取 物、 10g/l 胰蛋白胨、 50mg/l 卡那霉素 ) 的 。
36、LB 培养基中培养， 并使用 Qiagen Miniprep 试剂 盒 ( 按照标准步骤 ) 分离质粒 DNA。通过限制性分析检验构建体的准确度。 0166 实施例 2 0167 对表达L-乙内酰脲酶、 L-氨甲酰基水解酶和乙内酰脲消旋酶活性的Escherichia coli RV308 进行发酵 0168 使用表 1 中所列的发酵培养基， 在 pH7.150.15 和 27.00.5下发酵如实施例 1 中所述的经转化的超级感受态 Escherichia coli RV308 细胞， 所述培养基中葡萄糖和硫 胺在所述过程期间补入。用 NH3(25 ) 控制 pH。在发酵结束 ( 约 100h)。
37、 时， 添加 1- 辛醇 (4.0g/kg) 和 MnSO4H2O(2.4g/kg)， 之后将发酵液冷却至 51。 0169 表 1 发酵培养基的组成 0170 组分 浓度 (g/kg) 酵母提取物 24.6 柠檬酸H2O 10.0 K2HPO4 8.9 FeSO47H2O 0.20 说 明 书 CN 102482661 A 10 9/12 页 11 MgSO47H2O 3.1 作为 25溶液的 CaCl2 4.6 MnSO4H2O 0.51 (NH4)2SO4 5.0 CoCl26H2O 0.006 NaMoO42H2O 0.004 H3BO3 0.004 Basildon( 消泡剂 ) 0。
38、.15 葡萄糖 10.5 硫酸新霉素 0.10 硫胺HCl 0.014 0171 实施例 3 0172 4下， 添加和不添加辛醇和锰时， L- 乙内酰脲酶、 L- 氨甲酰基水解酶和乙内酰脲 消旋酶稳定性 0173 使用来自在实施例 2 中获得的发酵液的样品， 在三个不同的孵育时间， 在不存在 和存在辛醇和 / 或 Mn2+时， 针对酶 L- 乙内酰脲酶、 L- 氨甲酰基水解酶和乙内酰脲消旋酶进 行稳定性测试。结果概括于以下综述中。 0174 0175 说 明 书 CN 102482661 A 11 10/12 页 12 0176 实施例 4 0177 4下， 添加和不添加辛醇和锰时的 L- 乙。
39、内酰脲酶稳定性 ； 发酵结束时具有 1mM Mn2+ 0178 使用来自在实施例 2 中获得的发酵液的样品， 在五个不同的孵育时间， 在不存在 和存在辛醇和 / 或 1mM Mn2+时， 针对 L- 乙内酰脲酶进行稳定性测试。结果概括于以下综述 中。 0179 0180 实施例 5 0181 4下， 添加和不添加辛醇和锰时的 L- 乙内酰脲酶稳定性 ； 发酵结束时具有 3mM Mn2+ 0182 使用来自在实施例 2 中获得的发酵液的样品， 在五个不同的孵育时间， 在不存在 和存在辛醇和 / 或 3mM Mn2+时， 针对 L- 乙内酰脲酶进行稳定性测试。结果概括于以下综述 中。 0183 0。
40、184 说 明 书 CN 102482661 A 12 11/12 页 13 0185 实施例 6 0186 L- 乙内酰脲酶、 L- 氨甲酰基水解酶和乙内酰脲消旋酶稳定性相对于时间， 温度， 和辛醇、 锰与絮凝剂的存在或不存在等变化的多级析因设计分析 (Multilevel factorial design analysis) 0187 使用来自实施例 2 中获得的发酵液的样品， 进行 L- 乙内酰脲酶、 L- 氨甲酰基水解 酶和乙内酰脲消旋酶稳定性相对于时间， 温度， 和辛醇、 Mn2+与絮凝剂的存在或不存在等变 化的多级析因设计分析 (Multilevel factorial desig。
41、n analysis)。结果概括于表 2 中。 0188 A 列 ： 随机顺序 G 列 ： 锰 (mM) 0189 B 列 ： 标准顺序 H 列 ： 絮凝剂 (g/L) 0190 C 列 ： 混合物编号 I 列 ： 乙内酰脲酶 (U/g) 0191 D 列 ： 时间 ( 天 ) J 列 ： 氨甲酰基水解酶 (U/g) 0192 E 列 ： 温度 ( ) K 列 ： 乙内酰脲消旋酶 (U/g) 0193 F 列 ： 辛醇 (g/L) 0194 从上述实验绘制 Pareto 图后可得出下述结论 ： 0195 对乙内酰脲酶而言， 辛醇和 Mn2+的添加具有强的积极的初始影响， 存在来自温度 和Mn2。
42、+之间相互作用的强的积极影响， 存在来自辛醇/絮凝剂和Mn2+/絮凝剂的相互作用的 强的消极影响。4下存在辛醇 /Mn2+时的稳定性良好。 0196 对氨甲酰基水解酶而言， Mn2+的添加具有强的积极影响， 存在来自絮凝剂的强的 消极影响。4下存在辛醇 /Mn2+时的稳定性良好。 0197 对乙内酰脲消旋酶而言， 存在来自絮凝剂的强的消极影响， 并且 4下存在辛醇 / Mn2+时的稳定性良好。 0198 表 2 对 L- 乙内酰脲酶稳定性的多级析因设计分析 0199 说 明 书 CN 102482661 A 13 12/12 页 14 说 明 书 CN 102482661 A 14 1/1 页 15 图 1 说 明 书 附 图 CN 102482661 A 15 。