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1、(10)申请公布号 CN 102477410 A (43)申请公布日 2012.05.30 CN 102477410 A *CN102477410A* (21)申请号 201110384246.X (22)申请日 2011.11.28 10-2010-0120371 2010.11.30 KR C12N 5/0775(2010.01) C12N 5/071(2010.01) C12N 5/074(2010.01) A61K 8/99(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (71)申请人 株式会社爱茉莉太平洋 地址 韩国首尔 (72)发明人 沈重铉 金知贤 赵诚雅 闵大珍 金。
2、汉坤 李泰龙 卢旻秀 申东旭 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 金世煜 苗堃 (54) 发明名称 含有双歧杆菌提取物的脂肪来源干细胞的干 细胞性增进用以及皮肤细胞增殖用组合物 (57) 摘要 为实现本发明的目的而提供一种含有双歧杆 菌提取物作为有效成分的脂肪来源干细胞的干细 胞性增进用组合物以及皮肤细胞增殖用组合物。 本发明的组合物含有双歧杆菌提取物作为有效成 分， 从而增进脂肪来源干细胞的干细胞性， 由此对 美容或整形为目的的脂肪组织的增加有用。 因此， 本发明的组合物能够增进皮肤饱满感， 促进脂肪 来源干细胞的再生， 恢复损伤的皮下脂肪的功能， 因此。
3、能够作为用于增进皮肤饱满感的美容或整形 用组合物而使用， 并且能够作为用于增进皮肤饱 满感的皮肤外用剂组合物来使用。 另外， 本发明的 组合物能够促进与表皮再生相关的皮肤表皮基底 层的角朊干细胞和过渡 - 放大细胞的增殖， 因此 能够促进皮肤细胞的再生。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种脂肪来源干细胞的干细胞性增进用组合物， 其中， 含有双歧杆菌提取物作为有 效成分。 2. 根据权利要求 1 所。
4、述的干细胞性增进用组合物， 其中， 所述脂肪来源干细胞为人的 脂肪来源干细胞。 3. 根据权利要求 1 所述的干细胞性增进用组合物， 其中， 所述组合物通过增加脂肪组 织而使皮肤增进饱满感。 4. 根据权利要求 1 所述的干细胞性增进用组合物， 其中， 所述组合物增加作为脂肪来 源干细胞标记物的 CD29、 CD44、 CD73 或 CD105 的表达量。 5. 根据权利要求 1 所述的干细胞性增进用组合物， 其中， 相对于组合物总重量， 所述组 合物含有 0.0001 10 重量的双歧杆菌提取物。 6. 一种皮肤细胞增殖用组合物， 其中， 含有双歧杆菌提取物作为有效成分。 7. 根据权利要求。
5、 6 所述的皮肤细胞增殖用组合物， 其中， 所述皮肤细胞为角朊干细胞 或过渡放大细胞。 8. 根据权利要求 6 所述的皮肤细胞增殖用组合物， 其中， 所述组合物用于使皮肤再生 或防止皮肤老化。 9. 根据权利要求 6 所述的皮肤细胞增殖用组合物， 其中， 所述组合物用于增加作为角 朊干细胞标记物的 p63 的表达量， 或用于增加作为过渡放大细胞标记物的 CD71 或整合素 6 的表达量。 10. 根据权利要求 6 所述的皮肤细胞增殖用组合物， 其中， 相对于组合物总重量， 所述 组合物含有 0.0001 10 重量的双歧杆菌提取物。 11. 一种作为用于增进皮肤饱满感的皮肤美容或整形用组合物，。
6、 其中， 含有双歧杆菌提 取物作为有效成分。 12. 根据权利要求 11 所述的美容或整形用组合物， 其中， 相对于组合物总重量， 所述组 合物含有 0.0001 10 重量的双歧杆菌提取物。 13. 一种用于增进皮肤饱满感的皮肤外用剂组合物， 其中， 含有双歧杆菌提取物作为有 效成分。 14. 根据权利要求 13 所述的皮肤外用剂组合物， 其中， 相对于组合物总重量， 所述组合 物含有 0.0001 10 重量的双歧杆菌提取物。 15. 一种通过促进皮肤细胞增殖而进行的皮肤美容方法， 其中， 包括用双歧杆菌提取物 对皮肤进行处理的步骤。 16. 根据权利要求 15 所述的通过促进皮肤细胞增殖。
7、而进行的皮肤美容方法， 其中， 所 述双歧杆菌提取物是培养双歧杆菌、 并利用匀浆器使细胞破碎而获得的提取物。 权 利 要 求 书 CN 102477410 A 2 1/11 页 3 含有双歧杆菌提取物的脂肪来源干细胞的干细胞性增进用 以及皮肤细胞增殖用组合物 技术领域 0001 本发明涉及维持并增进脂肪来源干细胞的特性的干细胞性增进用组合物以及皮 肤细胞增殖用组合物。 背景技术 0002 皮肤为构成人体的器官中最大的器官， 占我们身体体积的约 16， 面积为 1.8m2， 厚度为 2 4mm， 重量为约 3kg， 由表皮、 真皮以及皮下脂肪层构成。这种皮肤与外部环境 直接接触而起到使人体免受人。
8、体有害微生物之类的多种有害因子和紫外线等外部刺激的 影响的重要的保护膜作用， 并且是营造全身的代谢所需的生化功能的对生命维持必不可少 的器官。尤其， 存在于真皮下方的皮下脂肪层由脂肪细胞 (adipocyte) 的小叶构成， 针对 外部的热量起到保护皮肤内部的器官以及吸收冲击的缓冲作用， 将营养成分以甘油三酸酯 (Triglyceride) 的形态储存在称之为脂肪体 (Lipid droplet) 的细胞小器官中， 需要时作 为能量源来使用。但是， 随着年龄的增加， 皮肤因自然性因素和各种外部刺激而受到损伤， 尤其， 真皮中左右弹性的胶原纤维 ( 胶原蛋白 )、 弹性纤维 ( 弹性蛋白 ) 的。
9、活性以及表达降 低， 从而弹性降低的同时皮下脂肪中的脂肪生成也减少， 结果皮肤全面性地无法正常实现 各构成细胞的原本的功能。 因此， 现在广泛使用的方法为脂肪移植手术， 它是利用具有郁金 香针 (tulip needle) 形状的尖部不锋利的针的注射器， 采集自身的脂肪而移植到看上去 弹性降低的皮肤的各个部位的手术。但是， 有报告指出， 在脂肪移植手术以后， 移植体积的 40 60重新被吸收到体内， 皮肤薄且皮下脂肪少的部位上进行的脂肪移植手术中被指 出存在能够摸到细胞块等问题， 且实际上移植的脂肪的生存率和生存时间无法达到预期而 发生需要再次进行移植的情形。因此， 对能够代替存在这些问题的脂。
10、肪移植手术且能够增 加足够的皮下脂肪层的组合物的要求提高。最近， 以抑制作为皮肤弹性减少的原因的胶原 蛋白和弹性蛋白的减少为目的而开发并使用的维生素A和视黄酸等类维生素A虽然能够表 现出卓越的弹性改善效果， 但存在对皮肤只使用少量也会产生刺激的缺陷。 因此， 最近为了 解决这种原料的皮肤刺激问题而对利用更加安全且无皮肤刺激的原料的化妆品的开发的 要求升高。 0003 皮肤的基本结构由皮下脂肪组织来维持， 这种皮下脂肪组织起到左右皮肤的体积 和强度的作用， 因此增加脂肪组织的体积会成为对维持皮肤的饱满感的较好的解决方式， 由此为了维持以及增进皮肤的饱满感而需要开发没有皮肤刺激且能够增加脂肪组织的。
11、体 积的组合物。另一方面， 存在于皮肤基底层中的皮肤的角朊干细胞 (Keratinocyte stem cells， KSC)被指出在位于皮肤最外侧的表皮(epidermis)中表现出再生能力。 角朊干细胞 持续分裂而大体上生成两种细胞， 其中之一是进行自我复制 (self-renewal) 而制造的一 模一样的干细胞， 另一个是过渡放大细胞 (Transit Amplifying Cells， TA cells)。过渡 放大细胞进一步扩增并进行初期分化而成为角质形成细胞 (Keratinocyte cells)， 继续进 行分化而这些被挤到皮肤表面上。 在此过程中， 角质形成细胞引起分化(D。
12、ifferentiation) 说 明 书 CN 102477410 A 3 2/11 页 4 和角化 (Keratinazation) 而形成角质层， 并在 3 4 周后从角质层中脱落。 0004 上述角朊干细胞以及过渡 - 放大细胞一般以普通基底层细胞的约 4-7左右的极 低的量进行分布， 增加角朊干细胞的数量不比增加过渡放大细胞的数量容易， 且由于没有 分布在相对较广的区域， 因此给研究带来较大的难度。 由此， 有待开发出表现对角朊干细胞 以及过渡 - 放大细胞的增殖能力的组合物。 发明内容 0005 为了解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种没有皮肤刺激且增进能够增加脂 肪组织的脂肪。
13、来源干细胞的干细胞性， 并且能够增加皮肤饱满感的组合物。 另外， 另一目的 在于提供一种使角朊干细胞以及过渡 - 放大细胞增殖同时表现出皮肤细胞再生能力的组 合物。 0006 为实现上述目的， 提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的脂肪来源干细胞 的干细胞性增进用组合物。 0007 另外， 本发明提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的皮肤细胞增殖用组合 物。 0008 另外， 本发明提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的用于增进皮肤饱满感 的皮肤美容或整形用组合物。 0009 另外， 本发明提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的用于增进皮肤饱满感 的皮肤外用剂组合物。 0010 另外，。
14、 本发明提供包括用双歧杆菌提取物对皮肤进行处理的步骤的通过存进皮肤 细胞增殖而进行的皮肤美容方法。 0011 本发明的组合物含有双歧杆菌提取物作为有效成分， 从而增进脂肪来源干细胞的 干细胞性， 由此对美容或整形为目的的脂肪组织的增加有效。 因此， 本发明的组合物能够增 进皮肤饱满感， 促进脂肪来源干细胞的再生， 恢复损伤的皮下脂肪的功能， 从而能够作为用 于增进皮肤饱满感的美容或整形用组合物而使用， 并且能够作为用于增进皮肤饱满感的皮 肤外用剂组合物来使用。另外， 本发明的组合物能够促进与表皮再生相关的皮肤表皮基底 层的角朊干细胞和过渡 - 放大细胞的增殖， 因此能够促进皮肤细胞的再生。 附。
15、图说明 0012 图 1 为确认双歧杆菌提取物处理下的脂肪来源干细胞的细胞毒性的图表。 0013 图 2 为向脂肪来源干细胞施加氧化胁迫后， 用双歧杆菌提取物进行处理而对代表 脂肪来源干细胞的干细胞性的特征的基因的表达状态进行比较的图表。 0014 图 3 为向脂肪来源干细胞施加氧化胁迫后， 用双歧杆菌提取物进行处理而对代表 脂肪来源干细胞的干细胞性的特征的蛋白质的表达状态进行比较的图表。 0015 图 4 为确认在双歧杆菌提取物的处理下的皮肤角质形成细胞的细胞毒性的图表。 0016 图 5 为向皮肤角质形成细胞施加紫外线后， 用双歧杆菌提取物进行处理而对代表 皮肤角质形成细胞的干细胞性的特征。
16、的基因的表达状态进行比较的图表。 具体实施方式 说 明 书 CN 102477410 A 4 3/11 页 5 0017 以下， 详细说明本发明。 0018 本发明提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的脂肪来源干细胞的干细胞 性增进用组合物。上述干细胞性 (stemness) 是指带有干细胞的自我再生能力和动态平衡 且具有干细胞的活性的状态 ； 干细胞性增进是指增加干细胞的活性。 0019 双歧杆菌是制造对人体有用的代谢产物且安全到能够作为食品原料来使用的菌。 0020 本发明的双歧杆菌提取物通过培养双歧杆菌并用匀浆器使细胞破裂而获得。 该提 取物含有双歧杆菌的代谢成分、 细胞质、 细胞壁成。
17、分和多糖体等。 0021 本发明的一实施例中， 上述脂肪来源干细胞(Adipose derived stem cell ： ADSC) 是人脂肪来源干细胞 (human adipose derived stem cells， hADSCs)。 0022 本发明的一实施例中， 上述组合物使脂肪组织增加而使皮肤增加饱满感。 0023 本发明的一实施例中， 上述组合物能够增加作为脂肪来源干细胞标记物 的 分 化 群 29(Cluster of Differentiation 29 ： 以 下 称 之 为 CD29)、 分 化群 44(Cluster of Differentiation 44 ： 以。
18、下称之为 CD44)、 分化群 73(Cluster of Differentiation 73 ： 以下称之为 CD73) 或分化群 105(Cluster of Differentiation 105 ： 以下称之为 CD105) 的表达量。与阴性对照组比较， CD29、 CD44、 CD73 或 CD105 的表达 量的增加意味着脂肪来源干细胞的活性的增加。CD29 为整合素 1(integrin beta 1) 的 别称， 是脂肪来源干细胞的标记物， CD44 通过 Wnt 信号 (signaling) 活性而增加脂肪来源 干细胞的活性。CD73 是 5 - 核苷酸酶 (5-nucle。
19、otidase) 的别称， 是将核苷酸转化为核 苷的酶， 是脂肪来源干细胞的标记物， CD105 为内皮糖蛋白 (Endoglin) 的别称， 是 TGFb 的 受体的一部分， 是脂肪来源干细胞的标记物。 0024 本发明的一实施例中， 相对于组合物总重量， 上述组合物可含有 0.0001 10 重 量的双歧杆菌提取物、 可优选含有 0.0001 0.1 重量、 可更优选含有 0.0001 0.001 重量。未达到 0.0001 重量时， 效果甚微 ； 若超过 10 重量时， 存在显示细胞毒性的问 题。 0025 本发明的一实施例提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的皮肤细胞增殖 用组合物。。
20、 0026 上述皮肤细胞为角朊干细胞 (Keratinocyte Stem Cell ： 以下称之为 KSC) 或过渡 放大细胞 (Transit-Amplifying cell ： 以下称之为 TA cell)。 0027 根据上述组合物， 可通过过渡放大细胞的增殖促进来使皮肤表皮再生， 过渡放大 细胞与角朊干细胞一起， 经不断的细胞分裂来克服角质形成细胞脱落所致的表皮损失， 起 到使表皮再生的作用。因此， 上述组合物可使皮肤再生或防止皮肤老化。 0028 另外， 本发明中定义的用语 “皮肤再生” 是包括针对全面性的皮肤老化以及皮肤表 皮等上诱发的伤口等而生成新的角质形成细胞的能力的广义的概。
21、念。 0029 具体而言， 皮肤再生是指通过存在于皮肤表皮的基底层中的角朊干细胞的分裂而 生成的过渡放大细胞进一步扩增， 且进行初期分化而变成角质形成细胞， 挤到皮肤表面上 而引起分化(Differentiation)和角化(Keratinazation)的同时构成角质层的所有过程。 其中， 皮肤再生的核心过程在于存在于基底层中的角朊干细胞和该细胞的子细胞即过渡放 大细胞的增殖。发生了只有皮肤的表面部分消失的 “擦伤” 、 被挠时出现的 “裂伤” 、 火所致 的烧伤等外部的物理性、 化学性环境所致的皮肤损伤时， 为了将此尽快恢复需要存在于皮 说 明 书 CN 102477410 A 5 4/1。
22、1 页 6 肤基底层且左右皮肤再生的角朊干细胞和过渡 - 放大细胞的活跃的增殖。一般， 年少时， 即 使发生皮肤损伤不会留下疤痕， 但年老后发生皮肤损伤时会留下疤痕的原因也是因为皮肤 再生所需的角朊干细胞和过渡放大细胞的增殖的水平程度根据年龄显著降低的缘故。即， 若老化发展， 这些细胞的增殖程度会降低， 这意味着皮肤再生能力的减退， 可导致伤口等的 恢复被延迟， 或使皮肤弹性减少严重。 0030 利用上述皮肤细胞增殖用组合物， 可将增殖的皮肤细胞移植到需要角朊干细胞的 个体上。 0031 如通过下述实验例获得的结论， 本发明的发明人发现将根据本发明的含有双歧杆 菌提取物作为有效成分的皮肤细胞增。
23、殖用组合物应用在皮肤角质形成细胞时， 会有效增加 角质干细胞标记物的表达。 0032 上述角质干细胞以皮肤表皮基底层约 4-7左右的极低的量来分布， 如前面所述， 对使表皮再生起到重要作用。 因此， 通过利用根据本发明的组合物的角朊干细胞数的增加， 可以提高用于伤口恢复的皮肤再生能力， 能够防止由皮肤再生能力的减退所致的皮肤弹性 降低以及皮肤老化的加深。 0033 上述组合物能够增加表达分化群71(Cluster of Differentiation 71 ： 以下称之 为 CD71) 和整合素 6(6 integrin) 的过渡放大细胞的标记物的表达， 且上述 CD71 以及 整合素6为对过。
24、渡放大细胞具有特异性的标记物蛋白质。 上述CD71蛋白质也称之为转铁 蛋白 (Transferrin) 受体， 只存在于基底层中。具体而言， 转铁蛋白 (transferring) 蛋白 质与随着细胞血流而流动的铁成分结合， 上述 CD71 蛋白质与转铁蛋白 (transferring) 蛋 白质进行相互作用， 经过称之为受体介导转铁蛋白内吞 (receptor mediated transferrin endocytosis) 的过程， 起到向细胞内供给铁成分的作用。活性化的细胞或增殖的细胞的细 胞内需要很多铁分， 这时 CD71 蛋白质的表达会增加。 0034 上述整合素6对细胞的相互转达。
25、(cellular communication)进行介导， 能够影 响细胞移动、 增殖以及分化等多种领域的细胞功能， 且在整合素 6 没有表达时会发生严 重的皮肤水泡。 0035 蛋 白 63(protein63 ： 以 下 称 之 为 p63) 为 代 表 性 的 角 朊 干 细 胞 标 记 物 (Keratinocyte stem cell marker)， 是只在干细胞中特异性表达的蛋白质。完全没有 p63 的鼠根本就不会生成表皮， 在发生期间内死亡， 并且在将活性降低为一半时皮肤全面 发生异常， 加速老化而寿命缩短 30。在人身上发生 p63 的突变时在发生阶段中形成表 皮的外胚层 (。
26、Ectoderm) 无法正常发育而引发导致颚裂及手脚指畸形的 EEC 综合征 (EEC Syndrome ； Ectrodactyly Ectodermal dysplasia Cleft lip Syndrome)。 从上述研究可明 确， p63 对表皮干细胞的活性调节和表皮层的再生起到非常重要的作用。本发明的组合物 使作为上述角朊干细胞标记物的 p63 的表达量增加。 0036 本发明的一实施例中， 相对于组合物总重量， 上述组合物含有0.000110重量 的双歧杆菌提取物、 可优选含有 0.0001 0.1 重量、 可更优选含有 0.0001 0.001 重 量。未达到 0.0001 重。
27、量时， 其效果甚微 ； 超过 10 重量时， 存在显示细胞毒性的问题。 0037 本发明的一实施例提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的用于增进皮肤 饱满感的皮肤美容或整形用组合物。 0038 本发明的一实施例中， 相对于组合物总重量， 上述组合物含有0.000110重量 说 明 书 CN 102477410 A 6 5/11 页 7 的双歧杆菌提取物、 可优选含有0.00010.1重量、 更优选含有0.00010.001重量。 未达到 0.0001 重量时， 其效果甚微 ； 超过 10 重量时， 存在显示细胞毒性的问题。 0039 上述组合物例如可用于以下目的使用， 即通过形成乳房组织而进。
28、行的隆胸， 微细 脂肪移植术、 自身脂肪移植术等增进脸部皮肤的饱满感而去除八字皱纹、 眉宇皱纹以及维 持弹性， 但并非仅限于此。 0040 上述组合物可根据药学领域的通常方法来制成适于向患者体内给药的单位给药 型制剂来进行给药。 符合此目的的剂型优选为作为非口服给药剂型的注射剂或局部给药用 制剂等。注射用剂型优选为等渗水溶液或悬浊液。但此时能够将通常使用的填充剂、 增量 剂、 结合剂、 湿润剂、 崩解剂、 表面活性剂等稀释剂或塑形剂一同使用。 0041 这样制备的本发明的制剂可根据通常的方法经非口服， 例如向特定部位直接给 药。此时， 组合物注入利用注射器来实现。上述组合物的 1 日给药量为 。
29、1105到 1107细 胞 /kg 体重、 优选为 5105到 5106细胞 /kg 体重， 可分成 1 次或数次来给药。但是， 应理 解， 有效成分的实际给药量应根据所要分化以及增殖的脂肪细胞的量、 给药途径、 患者的体 重、 年龄以及性别等多种相关因素来确定， 因此， 上述给药量不论是在任何方面上都并非用 以对本发明范围进行限定。 0042 本发明的一实施例提供一种含有双歧杆菌提取物作为有效成分的用于增进皮肤 饱满感的皮肤外用剂组合物。 0043 本发明的一实施例中， 相对于组合物总重量， 上述组合物含有0.000110重量 的双歧杆菌提取物、 可优选含有 0.0001 0.1 重量、 可。
30、更优选含有 0.0001 0.001 重 量。未达到 0.0001 重量时， 效果甚微 ； 超过 10 重量时， 存在显示细胞毒性的问题。 0044 上述皮肤外用剂组合物可以为化妆料组合物或药物组合物。 0045 上述化妆料组合物的剂型没有特别限制， 可按需要适当进行选择。例如制备成柔 肤水、 营养化妆水、 按摩霜、 精华、 营养霜或面膜等剂型， 但并非仅限于此。 0046 上述药物组合物可以为洗剂、 软膏、 凝胶、 霜、 贴片或喷雾剂等经皮肤给药型剂型， 但并非仅限于此。 0047 就根据各剂型的皮肤外用剂组合物而言， 除了上述本发明的组合物之外的其它成 分可由本领域技术人员根据其它皮肤外用。
31、剂的剂型或使用目的等而毫无难度地进行适当 选择并进行配比， 此时， 与其它原料一同使用时可起到协同效果。 0048 另外， 本发明的组合物作为药物组合物来使用时， 可进一步含有防腐剂、 稳定剂、 可湿性粉剂或乳化促进剂、 用于渗透压调节的盐或缓冲剂等药物辅料以及其它治疗上有效 的物质， 根据通常的方法以多种口服或非口服给药形态进行剂型化。 0049 应理解， 有效成分的实际给药量应根据症状的严重度、 选择的给药途径、 对象的年 龄、 性别、 体重以及健康状态等多种相关因素来决定。 0050 通常， 有效成分的给药量为 0.001mg/kg/ 日到大约 2000mg/kg/ 日的范围。更优选 的。
32、给药量为 0.5mg/kg/ 日到 2.5mg/kg/ 日。 0051 本发明的增进脂肪来源干细胞的干细胞性的组合物适用部位包括身体的所有脂 肪组织， 不限定在特定部位上， 例如， 可包括脂肪层少的脸部。 另外， 上述脂肪组织的增加效 果有 ： 美容或整形目的的脂肪组织增加效果所致的皮肤饱满感增加效果、 皮肤弹性提高效 果、 皮肤皱纹改善效果、 皮肤再生效果以及皮肤老化防止效果等， 但并非限定于此。 说 明 书 CN 102477410 A 7 6/11 页 8 0052 本发明的一实施例提供包括对皮肤以双歧杆菌提取物进行处理的步骤的通过促 进皮肤细胞增殖而进行的皮肤美容方法。 上述双歧杆菌提。
33、取物为培养双歧杆菌而用匀浆器 使细胞破裂而获得的提取物。 0053 上述皮肤细胞增殖还可以在生物体外部进行， 并可将增殖的皮肤细胞移植到需要 角质干细胞个体中。 0054 以下， 通过下述实施例以及实验例来对本发明进行更具体的说明， 但这仅仅是用 于例示本发明， 本发明的范围不被此限定。 0055 实验例 1 研究双歧杆菌提取物在人脂肪来源干细胞以及皮肤角质形成细胞中 的细胞毒性 0056 将 脂 肪 来 源 干 细 胞 在 75cm2T-flask 中 进 行 传 代 培 养， 在 CO2培 养 箱 (CO2 Incubator) 中以 37， 5 CO2的条件下进行培养。一般在第二次或第三。
34、次中进行了细胞 的传代培养 (passage)。 0057 将人脂肪来源干细胞 (human adipose derived stem cells， hADSCs) 从龙沙公 司 (Lonza， Inc.Walkersville， MD， USA) 购入， 并根据龙沙公司的说明书来进行培养。为了 研究双歧杆菌提取物的细胞毒性， 以 0.0001 10的浓度进行处理， 并利用 CCK-8 试剂盒 (Dojindo)确认了细胞毒性程度。 双歧杆菌是购入CLR-Chemisches Laboratorium Dr.Kurt Richter GmbH公司的Repair Complex CLRTM PF。
35、原料而使用(INCI nameBifida Ferment Lysate)。从图 1 的结果可知， 在以 0.001的浓度处理时无细胞毒性， 且达到了约 10左 右的细胞分裂增进效果。 0058 将皮肤角质形成细胞在 75cm2T-flask 中进行传代培养， 在 CO2培养箱 (CO2 Incubator) 中以 37， 5 CO2的条件下进行培养。一般在第二次或第三次中进行了细胞 的传代培养 (passage)。 0059 人的皮肤角质形成细胞 (keratinocyte) 从龙沙公司 (Lonza， Inc.Walkersville， MD， USA) 购入， 并根据龙沙公司的说明书来进。
36、行培养。为了研究双歧杆菌提取物的细胞毒 性， 以 0.0001 10的浓度进行处理， 并利用 CCK-8 试剂盒 (Dojindo) 确认了细胞毒性程 度。从图 4 的结果可知， 在 0.0001 0.1的浓度范围内无细胞毒性， 且得到约 10左右 的细胞分裂增进效果。 0060 实验例2测定双歧杆菌提取物对于脂肪来源干细胞以及皮肤干细胞/过渡-放 大细胞标记物基因的表达水平的效果 0061 脂肪来源干细胞的氧化胁迫是用过氧化氢 (H2O2) 以 200uM 浓度进行了 24 小时处 理， 为了研究脂肪来源干细胞的干细胞性增进效果， 将 5双歧杆菌提取物添加到培养基 内。对于皮肤角质形成细胞而。
37、言， 以 100mJ/cm2的 UVB 照射后， 处理了双歧杆菌提取物。 0062 用 2ml 磷酸盐缓冲液 (Phosphate Buffered Saline， PBS) 洗涤细胞之后， 然后， 使用总 RNA 提取试剂 (Trizol reagent， Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 分离了细胞内的 RNA。 将分离后的RNA用凯杰公司的RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt， QIAGEN， Valencia， CA) 再次提纯后， 使用安捷伦公司的 2100 型生物分析仪 (Agilent 2100BioAnalyzer， Agilent Tec。
38、hnologies， Santa Clara， CA， USA) 确认了 RNA 的质量 (quality)。利用英杰公司的逆 转录酶试剂盒 (Superscript Reverse Transcriptase(RT)kit， Invitrogen， Carlsbad， CA) 从上述 RNA 合成了 cDNA， 将此通过实时逆转录聚合酶链反应 (real time-reverse 说 明 书 CN 102477410 A 8 7/11 页 9 transcription polymerase chain reaction， Q-RT-PCR) 进行了定量分析。 0063 脂肪来源干细胞中 C。
39、D29、 44、 73、 105 基因的表达图案变化是利用应用生物系统公 司的 TaqMan 基因表达系统 (TaqMan gene expression assay kit， Applied Biosystems， Foster City， CA)(CD29基因引物 ： Hs00559595_m1， CD44基因引物 ： Hs01075861_m1， CD73基 因引物 ： Hs01573922_m1， CD105 基因引物 ： Hs00923996_m1) 进行了评价， 并将其结果显示在 图 2 中。 0064 皮肤角质形成细胞中基因的表达图案变化是利用应用生物系统公司的 TaqMan 基。
40、 因表达系统 (TaqMan gene expression assay kit， Applied Biosystems， Foster City， CA)(整合素6基因引物 ： Hs01041011_m1， CD71基因引物 ： Hs00951083_m1， p63基因引物 ： Hs00978340_m1) 进行了评价， 并将其结果显示在图 5 中。确认了各基因的表达量比阴性对 照组增加了约 2.5 4 倍左右。这样的增加在统计学上具有显著性， 且该统计是利用双侧 t 检验进行了验证， 表示了当 p 值在 0.05 以下时具有显著的差异。 0065 实验例 3 通过流式细胞分析来进行的脂肪来。
41、源干细胞的测定 0066 将人脂肪来源干细胞以 0.25胰蛋白酶 (Trypsin-EDTA) 从 75cm2Ti 瓶中进行分 离后， 以 1500rpm 使细胞沉淀 5 分钟后， 去掉培养液后， 加入 3ml 封闭液 ： 封闭缓冲液、 2 胎牛血清 (Fetal calf serum ： FCS) 及 2牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin(BSA) KGM-2)， 使细胞悬浊。 0067 使细胞 ( 约 106个细胞 ) 在 4适应15 分钟后， 将附着有 PE-Cy( 藻红蛋 白 - 花菁 (phycoerythrin-cyanine) 的 CD29 抗体 (Cat 。
42、No.559882)(BD Pharmingen， CA， US) 各以 100 1 加入， 在 4下反应 45 分钟。另一方面， 作为阴性对照组来使用的细胞中 将 PE-Cy5 mouse IgG1k 同种型 (Cat No.555750) 也以 100 1 加入， 在 4下反应 45 分 钟。 0068 反应结束后用 3ml 洗涤缓冲液 (2 Bovine Serum Albumin(BSA)KGM-2) 洗涤 2 次后， 使细胞悬浊。此后用 FACSCalibur(BD Bioscience， San Jose， CA， U.S) 观察脂肪来 源干细胞中表达 CD29 的细胞的数量的变化。
43、， 将其表示于图 3、 表 1 中。 0069 表 1 0070 0071 参照图 3、 表 1 可知， 相比阴性对照组， CD29 增加了 19。 0072 以下例示本发明的组合物的剂型例以及制剂例。 0073 剂型例 1 柔肤水 0074 利用表 2 中显示的组成， 通过通常的制备方法制备了含有上述双歧杆菌的柔肤水 剂型。 0075 表 2 说 明 书 CN 102477410 A 9 8/11 页 10 0076 成分 含量 ( 重量 ) 甜菜碱 3.0 纳托胶 3.0 纤维素胶 0.005 乙醇 10.0 聚氧乙烯氢化蓖麻油 0.2 醋酸维生素 E 2.0 双歧杆菌提取物 10 防腐剂。
44、 微量 色素 微量 香料 微量 纯净水 余量 0077 剂型例 2 营养化妆水 0078 利用表 3 所示的组成， 通过通常的制备方法制备了含有上述双歧杆菌的营养化妆 水剂型。 0079 表 3 说 明 书 CN 102477410 A 10 9/11 页 11 0080 0081 剂型例 3 霜 0082 利用表 4 所示的组成， 通过通常的制备方法制备了含有上述双歧杆菌的霜剂型。 0083 表 4 说 明 书 CN 102477410 A 11 10/11 页 12 0084 0085 制剂例 1 片剂 0086 将根据本发明的双歧杆菌提取物 100mg、 乳糖 400mg、 玉米淀粉 4。
45、00mg 以及硬脂酸 镁 2mg 进行混合后， 根据通常的片剂的制备方法进行压片而制备出了片剂。 0087 制剂例 2 胶囊剂 0088 将根据本发明的双歧杆菌提取物 100mg、 乳糖 400mg、 玉米淀粉 400mg 以及硬脂酸 镁 2mg 进行混合后， 根据通常的胶囊剂的制备方法填充到明胶胶囊中而制备出了胶囊剂。 说 明 书 CN 102477410 A 12 11/11 页 13 0089 以上对本发明的特定部分进行了详细叙述， 本领域技术人员应知悉这种具体的技 术仅仅是优选的实施例而已， 这并不会对本发明的范围进行限定。 因此， 本发明的实质上的 范围由权利要求及其等同物来定义。 说 明 书 CN 102477410 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102477410 A 14 2/3 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102477410 A 15 3/3 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 102477410 A 16 。