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1、(10)申请公布号 CN 102276716 A (43)申请公布日 2011.12.14 CN 102276716 A *CN102276716A* (21)申请号 201110225760.9 (22)申请日 2011.08.08 C07K 14/78(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C12P 21/06(2006.01) A23L 1/305(2006.01) A61K 8/65(2006.01) (71)申请人 四川大学 地址 610065 四川省成都市一环路南一段 24 号 (72)发。
2、明人 李国英 杨波 刘文涛 (74)专利代理机构 成都科海专利事务有限责任 公司 51202 代理人 邓继轩 (54) 发明名称 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种从牛蛙皮中提取未变性天 然胶原的方法， 其特点是 ： 处理阶段用 NaOH 溶液、 H2O2溶液和脱脂剂处理洗净的牛蛙皮分别除去非 胶原蛋白、 色素和脂肪， 提取阶段以乙酸溶液和乙 酸 - 蛋白酶分别浸提得到酸溶胶原和酶溶胶原， 纯化阶段利用盐多次盐析， 最后透析冻干得到海 绵状牛蛙皮胶原。十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺 凝胶电泳图表明牛蛙皮胶原含有分子量为 30 万、 20 万和 10 万的 。
3、链、 链和 链， 其中 链为 两条， 很好地保留了胶原的三股螺旋结构。 提取过 程中除特殊说明外操作温度均在 15以下， 得到 的产品干重提取率不低于 80， 色白， 品质优良。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102276719 A1/1 页 2 1. 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法， 其特征在于该方法包括以下步骤 ： (1) 原料预处理 将新鲜牛蛙皮除去肌肉、 脂肪、 血管， 洗净， 挤干， 切碎 ； 加入料液比为 1 20-40， 浓度 为 0.05-0.2M/LNaOH 。
4、溶液处理 24-48h， 维持匀速搅拌， 中途换液 2-5 次， 将牛蛙皮取出， 冲 洗数次， 调节 pH 至 8-12， 加入料液比为 1 5-30， 体积浓度为 1 -8的 H2O2溶液处理 12-48h， 维持匀速搅拌， 中途换液2-4次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节pH至6.0-6.5， 用料 液比为 1 10-50， 体积浓度为 30 -70脱脂剂处理 12-24h， 维持匀速搅拌， 取出， 冲洗， 纯水浸泡过夜， 挤干， 备用 ； (2) 未变性天然胶原的提取 将上述预处理所得的牛蛙皮 60-100 重量份用浓度为 0.1-2M/L 乙酸溶液浸提 24-48h， 维持匀速搅拌。
5、， 未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为 0.1-2M/L 乙酸溶液复提 6-24h， 得到酸溶 牛蛙皮胶原溶液， 向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为 0.1-2M/L 乙酸溶液， 并加入浓度为 1wt -5wt蛋白酶浸提 24-48h， 维持匀速搅拌， 得到酶溶牛蛙皮胶原溶液 ； (3) 未变性天然胶原的纯化 将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为 0.6-4M/L 盐分 别盐析， 在温度 4以下， 以 5000-20000rpm 离心 10-15 分钟， 沉淀用浓度为 0.1-2M/L 乙酸 溶液复溶， 盐析 2-4 次 ； 将得到的沉淀分别溶于浓度为 0.1-2M/L 乙酸中， 以。
6、浓度为 0.1-1M/ L 的乙酸溶液为透析液透析处理 2-3 天， 冻干， 得到海绵状牛蛙皮胶原 ； (4) 以上步骤中除特殊说明外， 均在温度 15以下进行。 2. 如权利要求 1 所述从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法， 其特征在于脱脂剂为异 丙醇、 丁醇和丙酮中的至少一种。 3. 如权利要求 1 所述从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法， 其特征在于蛋白酶为胃 蛋白酶、 酸性蛋白酶、 真菌复合酶和 537 蛋白酶中的至少一种。 4. 如权利要求 1 所述从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法， 其特征在于盐为氯化 钠、 硫酸铵、 硫酸钠或硫酸镁中的任一种。 5.如权利要求14之一所述从牛蛙皮。
7、中提取未变性天然胶原的方法制备得到的未变 性天然胶原。 6. 如权利要求 5 所述未变性天然胶原用于医学、 美容、 化妆品、 保健品和食品领域。 权 利 要 求 书 CN 102276716 A CN 102276719 A1/5 页 3 一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法， 属于生物医用材料的制 备领域。 背景技术 0002 胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质， 占体内蛋白质总量的 25 -30， 是 腱、 软骨、 皮肤和血管的主要成分， I 型胶原蛋白分子由三条肽链组成， 两条 I 链、 一条 链， 三条肽链以特有。
8、的左手螺旋相互缠绕构成右手螺旋， 分子结构显现独特的甘氨 酸 -X-Y(X、 Y 为其他种类的氨基酸， 多为脯氨酸、 羟脯氨酸、 谷氨酸和丙氨酸 ) 周期结构。胶 原蛋白独特的三重螺旋结构， 使其分子结构非常稳定， 并且具有低免疫原性和良好的生物 相容性， 因此， 胶原蛋白在医学、 美容、 化妆品、 保健品和食品中有着广泛的应用。 0003 迄今为止， 猪、 牛等陆生动物的皮和跟腱仍然是提取未变性天然胶原的主要原材 料。 但是由于疯牛病和口蹄疫等动物传染性疾病全球肆虐， 并且尚无有效治疗方法， 以致人 们对使用从陆生动物组织中提取的未变性天然胶原产生恐慌。于是， 寻求更高质量和更高 安全性的提。
9、取未变性天然胶原的原材料迫在眉睫。目前， 水产动物组织中提取胶原蛋白已 经成为可行之径， 其胶原相比陆生动物在安全性上具有更大的优势， 同时， 它还具有陆生动 物所没有的一些特点， 因此， 水产动物已经成为未变性天然胶原提取材料的新目标。 0004 牛蛙， 属脊椎动物门， 两栖纲蛙科中的大型种类， 体重可超过 1000 克。牛蛙的营养 价值非常丰富， 每 100 克蛙肉中含蛋白质 19.9 克， 脂肪 0.3 克， 是一种高蛋白质、 低脂肪、 低 胆固醇营养食品， 备受人们的喜爱。牛蛙养殖业日益壮大， 牛蛙产量逐年增加。牛蛙的皮肤 组织重量约占其体量的 5， 食用过程中通常被废弃， 造成了大量。
10、的生物资源的浪费。从遗 弃的牛蛙皮肤组织中提取优质未变性天然胶原， 深度开发高附加值产品， 不仅可以解决废 弃物的污染问题， 更重要的是， 生物质资源的综合开发和高值利用， 将产生巨大的环境效益 和社会效益。 0005 目前， 未变性天然胶原蛋白的提取方法主要有酸法、 碱法、 酶法和结合法， 如 CN101979654A 和 CN101948900A 分别介绍了以鱼皮和牛软骨为原料的酶法提取胶原蛋白的 方法， CN1385489A 介绍了一种从鸡胸软骨中碱法提取胶原蛋白的方法， CN1155549A 介绍了 一动物结缔组织为原料的酸法提取胶原蛋白的方法， 此外， 人们还将上述几种方法结合使 用。
11、来提取胶原。 不过， 上述方法的原料多为哺乳动物或鱼类， 鲜有涉及两栖类动物， 同时， 单 一方法提取未变性天然胶原蛋白的产率均不太理想。 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种从牛蛙皮中提取未变性天然胶 原的方法， 其特点是该方法采用预处理、 提取和纯化三步 ： 预处理用氢氧化钠溶液、 双氧水 溶液和脱脂剂处理分别除去非胶原蛋白、 色素和脂肪 ； 提取则用乙酸溶液和乙酸 - 蛋白酶 先后提取得到酸溶胶原和酶溶胶原溶液 ； 纯化则是利用多次盐析后冻干得到海绵状牛蛙皮 说 明 书 CN 102276716 A CN 102276719 A2/5 页 4 胶原。较好地保存了。
12、胶原蛋白的三股螺旋结构及其生理功能。提高了牛蛙皮废弃物的附加 值， 牛蛙皮未变性天然胶原蛋白的提取率不低于 80。 0007 本发明的目的由以下技术措施实现， 其中所述原料份数除特殊说明外， 均为摩尔 份数。 0008 从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法包括以下步骤 ： 0009 (1) 原料预处理 0010 将新鲜牛蛙皮除去肌肉、 脂肪、 血管， 洗净， 挤干， 切碎 ； 加入料液比为 1 20-40， 浓度为0.05-0.2M/LNaOH溶液处理24-48h， 维持匀速搅拌， 中途换液2-5次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节 pH 至 8-12， 加入料液比为 1 5-30， 体积浓度。
13、为 1 -8的 H2O2溶液处理 12-48h， 维持匀速搅拌， 中途换液2-4次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节pH至6.0-6.5， 用料 液比为 1 10-50， 体积浓度为 30 -70脱脂剂处理 12-24h， 维持匀速搅拌， 取出， 冲洗， 纯水浸泡过夜， 挤干， 备用 ； 0011 (2) 未变性天然胶原的提取 0012 将上述预处理所得的牛蛙皮 60-100 重量份用浓度为 0.1-2M/L 乙酸溶液浸提 24-48h， 维持匀速搅拌， 未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为 0.1-2M/L 乙酸溶液复提 6-24h， 得到 酸溶牛蛙皮胶原溶液 ； 向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为 0.。
14、1-2M/L 乙酸溶液， 并加入浓度为 1 -5蛋白酶浸提 24-48h， 维持匀速搅拌， 得到酶溶牛蛙皮胶原溶液 ； 0013 (3) 未变性天然胶原的纯化 0014 将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为 0.6-4M/ L 盐分别盐析， 在温度 4以下， 以 5000-20000rpm 离心 10-15min， 沉淀用浓度为 0.1-2M/ L 乙酸溶液复溶， 盐析 2-4 次 ； 将得到的沉淀分别溶于浓度为 0.1-2M/L 乙酸中， 以浓度为 0.1-1M/L 的乙酸溶液为透析液透析处理 2-3 天， 冻干， 得到海绵状牛蛙皮胶原 ； 0015 (4) 以上步骤。
15、中除特殊说明外， 均在温度 15以下进行。 0016 脱脂剂为异丙醇、 丁醇和丙酮中的至少一种。 0017 蛋白酶为胃蛋白酶、 酸性蛋白酶、 真菌复合酶和 537 蛋白酶中的至少一种。 0018 盐为氯化钠、 硫酸铵、 硫酸钠或硫酸镁中的任一种。 0019 从牛蛙皮中提取未变性天然胶原的方法制备得到未变性天然胶原。 0020 未变性天然胶原用于医学、 美容、 化妆品、 保健品和食品领域。 0021 性能测试 0022 未变性天然牛蛙皮胶原十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱如图 1 所示， 结果表明牛蛙皮胶原含有分子量为 30 万、 20 万和 10 万的 链、 链和 链， 其中 链 为。
16、两条， 很好地保存了胶原蛋白的三股螺旋结构。 0023 本发明有如下优点 ： 0024 1、 预处理方法能很大限度地除去非胶原蛋白和色素 ； 0025 2、 分别使用酸法和酸酶结合法提取胶原， 干重提取率不低于 80， 产品色纯白， 品 质优良 ； 0026 3、 制得的天然胶原不同于水解胶原， 它具有独特的生物相容性、 低抗原性和生物 降解性 ； 0027 4、 所有流程均在低温下操作， 保留了胶原特有的三股螺旋结构， 保证了胶原蛋白 说 明 书 CN 102276716 A CN 102276719 A3/5 页 5 的活性和结构的完整性。 附图说明 0028 图 1. 为未变性天然牛蛙皮。
17、胶原蛋白十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 图 0029 1 为酸溶牛蛙皮未变性天然胶原， 2 为酶溶牛蛙皮未变性天然胶原， 其中， Mark 为 标准样， 分子量分别为 66kDa、 97.4kDa、 116kDa、 200kDa。 具体实施方式 0030 下面通过实施例对本发明进行具体描述， 有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明， 不能理解为对本发明保护范围的限制， 该领域的技术熟练人员可 以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。 0031 实施例 1 ： 0032 (1) 原料预处理 0033 将新鲜牛蛙皮除去肌肉、 脂肪、 血管， 洗净， 挤干， 切。
18、碎 ； 加入料液比为 1 20， 浓度 为 0.05M/L NaOH 溶液处理 48h， 维持匀速搅拌， 中途换液 5 次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调 节 pH 至 8-12， 加入料液比为 1 5， 体积浓度为 8的 H2O2溶液处理 12h， 维持匀速搅拌， 中 途换液 2 次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节 pH 至 6.0-6.5， 用料液比为 1 10， 体积浓度为 30异丙醇处理 24h， 维持匀速搅拌， 取出， 冲洗， 纯水浸泡过夜， 挤干， 备用 ； 0034 (2) 未变性天然胶原的提取 0035 将上述预处理所得的牛蛙皮 60g( 干重 15.6g) 用浓度为 0。
19、.1M/L 乙酸溶液浸提 24h， 维持匀速搅拌， 未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为 0.1M/L 乙酸溶液复提 6h， 得到酸溶牛蛙 皮胶原溶液， 向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为 0.1M/L 乙酸溶液， 并加入浓度为 1wt胃蛋 白酶浸提 48h， 维持匀速搅拌， 得到酶溶牛蛙皮胶原溶液 ； 0036 (3) 未变性天然胶原的纯化 0037 将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为 0.6M/L 氯 化钠分别盐析， 在温度 4以下， 以 20000rpm 离心 10 分钟， 沉淀用浓度为 0.1M/L 乙酸溶 液复溶， 盐析 2 次 ； 将得到的沉淀分别溶于浓度为 0.5M/L。
20、 乙酸中， 以浓度为 0.1M/L 的乙 酸溶液为透析液透析处理 2 天， 冻干， 得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白 12.8g， 干重提取率为 82.05 ； 0038 (4) 以上步骤中除特殊说明外， 均在温度 15以下进行。 0039 实施例 2 ： 0040 (1) 原料预处理 0041 将新鲜牛蛙皮除去肌肉、 脂肪、 血管， 洗净， 挤干， 切碎 ； 加入料液比为 1 40， 浓度 为 0.2M/L NaOH 溶液处理 24h， 维持匀速搅拌， 中途换液 2 次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调 节 pH 至 8-12， 加入料液比为 1 30， 体积浓度为 1的 H2O2溶液处理 48h，。
21、 维持匀速搅拌， 中途换液 4 次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节 pH 至 6.0-6.5， 用料液比为 1 50， 体积浓度 为 70丁醇处理 12h， 维持匀速搅拌， 取出， 冲洗， 纯水浸泡过夜， 挤干， 备用 ； 0042 (2) 未变性天然胶原的提取 说 明 书 CN 102276716 A CN 102276719 A4/5 页 6 0043 将上述预处理所得的牛蛙皮100g(干重26.0g)用浓度为2M/L乙酸溶液浸提48h， 维持匀速搅拌， 未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为 2M/L 乙酸溶液复提 24h， 得到酸溶牛蛙皮胶 原溶液， 向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为 2M/L 乙。
22、酸溶液， 并加入浓度为 5wt酸性蛋白酶 浸提 24h， 维持匀速搅拌， 得到酶溶牛蛙皮胶原溶液 ； 0044 (3) 未变性天然胶原的纯化 0045 将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为 4M/L 硫酸 铵分别盐析， 在温度 4以下， 以 5000rpm 离心 15 分钟， 沉淀用浓度为 2M/L 乙酸溶液复溶， 盐析4次 ； 将得到的沉淀分别溶于浓度为2M/L乙酸中， 以浓度为1M/L的乙酸溶液为透析液 透析处理 3 天， 冻干， 得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白 20.91g， 干重提取率为 80.44 ； 0046 (4) 以上步骤中除特殊说明外， 均在温度 15以下进。
23、行。 0047 实施例 3 ： 0048 (1) 原料预处理 0049 将新鲜牛蛙皮除去肌肉、 脂肪、 血管， 洗净， 挤干， 切碎 ； 加入料液比为 1 30， 浓度 为 0.1M/L NaOH 溶液处理 36h， 维持匀速搅拌， 中途换液 4 次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调 节 pH 至 8-12， 加入料液比为 1 15， 体积浓度 5的 H2O2溶液处理 24h， 维持匀速搅拌， 中 途换液 3 次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节 pH 至 6.0-6.5， 用料液比为 1 30， 体积浓度为 50丙酮处理 18h， 维持匀速搅拌， 取出， 冲洗， 纯水浸泡过夜， 挤干， 备。
24、用 ； 0050 (2) 未变性天然胶原的提取 0051 将上述预处理所得的牛蛙皮 80g( 干重 20.8g) 用浓度为 1M/L 乙酸溶液浸提 36h， 维持匀速搅拌， 未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为 1M/L 乙酸溶液复提 12h， 得到酸溶牛蛙皮胶 原溶液， 向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为 1M/L 乙酸溶液， 并加入浓度为 3wt真菌复合酶 浸提 36h， 维持匀速搅拌， 得到酶溶牛蛙皮胶原溶液 ； 0052 (3) 未变性天然胶原的纯化 0053 将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为 2M/L 硫酸 钠分别盐析， 在温度4以下， 以10000rpm离心12分钟， 。
25、沉淀用浓度为1M/L乙酸溶液复溶， 用浓度为 2M/L 硫酸钠盐析 3 次 ； 得到的沉淀分别溶于浓度为 1M/L 乙酸中， 以浓度为 0.5M/ L 的乙酸溶液为透析液透析处理 3 天， 冻干， 得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白 17.36g， 干重提取 率为 83.46 ； 0054 (4) 以上步骤中除特殊说明外， 均在温度 15以下进行。 0055 实施例 4 ： 0056 (1) 原料预处理 0057 将新鲜牛蛙皮除去肌肉、 脂肪、 血管， 洗净， 挤干， 切碎 ； 加入料液比为 1 30， 浓度 为 0.1M/L NaOH 溶液处理 48h， 维持匀速搅拌， 中途换液 3 次， 将牛蛙皮取。
26、出， 冲洗数次， 调 节 pH 至 8-12， 加入料液比为 1 20， 体积浓度为 3的 H2O2溶液处理 24h， 维持匀速搅拌， 中途换液3次， 将牛蛙皮取出， 冲洗数次， 调节pH至6.0-6.5， 用料液比为140， 含30异 丙醇和 20丁醇的脱脂剂处理 24h， 维持匀速搅拌， 取出， 冲洗， 纯水浸泡过夜， 挤干， 备用 ； 0058 (2) 未变性天然胶原的提取 0059 将上述预处理所得的牛蛙皮 70g( 干重 18.2g) 用浓度为 0.5M/L 乙酸溶液浸提 36h， 维持匀速搅拌， 未溶解的牛蛙皮沉渣用浓度为 0.5M/L 乙酸溶液复提 12h， 得到酸溶牛 说 明 。
27、书 CN 102276716 A CN 102276719 A5/5 页 7 蛙皮胶原溶液， 向牛蛙皮沉渣中继续加入浓度为 0.5M/L 乙酸溶液， 并加入浓度为 1wt胃 蛋白酶和 2wt 537 酶浸提 36h， 维持匀速搅拌， 得到酶溶牛蛙皮胶原溶液 ； 0060 (3) 未变性天然胶原的纯化 0061 将上述所得到的酸溶牛蛙皮胶原溶液和酶溶牛蛙皮胶原溶液用浓度为 0.7M/L 硫 酸镁分别盐析， 在温度 4以下， 以 20000rpm 离心 10 分钟， 沉淀用浓度为 0.5M/L 乙酸溶 液复溶， 用浓度为 0.7M/L 硫酸镁盐析 2 次 ； 将得到的沉淀分别溶于浓度为 0.5M/L 乙酸中， 以浓度为 0.1M/L 的乙酸溶液为透析液透析处理 2 天， 冻干， 得到海绵状牛蛙皮胶原蛋白 15.45g， 干重提取率为 84.87 ； 0062 (4) 以上步骤中除特殊说明外， 均在温度 15以下进行。 说 明 书 CN 102276716 A CN 102276719 A1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102276716 A 。